Introduction
Omprogrammering humana vuxna somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) tillhandahåller ett sätt för att erhålla en potentiellt obegränsad tillgång på patientspecifika celler för att studera sjukdomen 1, 2. Rekapitulera en sjukdom fenotyp in vitro skulle göra det rimligt att undersöka cellulära och molekylära mekanismer som är förknippade med sjukdomen och förbättra läkemedelsforskning och personlig medicin 3. Dessutom mänskliga iPSCs (hiPSCs) erbjuder möjligheten att härleda specifika celltyper som kan användas som en unik resurs för att ersätta döda eller dysfunktionella celler och återställa funktion i samband med flera sjukdomar 4, 5.
En viktig förutsättning för att med hjälp av iPSCs i ovanstående program är att se till att deras pluripotenta och odifferentierade tillstånd bibehålles under expansion i kultur. Typiskt techniqUE: ar, såsom flödescytometri, western blotting, polymeraskedjereaktion och funktionella analyser, som kräver stora mängder av celler och specialutrustning, används för detaljerad analys av iPSC pluripotens 6, 7, 8, 9, 10. Dock kan rutin bedömning av iPSCs 'odifferentierat tillstånd effektivt uppnås genom den begränsade förökning av dessa celler speciellt för immuncytokemi (ICC), vilket medför minskad tid och resurser.
Nya framsteg möjliggöra tillväxt av iPSCs i definierade serumfria betingelser, vilket är en betydande förbättring jämfört med konventionella odlings system som kräver murina fibroblast feeder lager och seruminnehållande media. Men den nuvarande litteraturen innefattar inte klart stegprotokoll som beskriver hur övergången iPSCs från matarenskiktet till feeder-fria system.
I detta sammanhang det nuvarande protokollet systematiskt beskriver hur hiPSCs odlas på bestrålad mus embryonala fibroblaster (Imef) matarskikt kan vara (1) anpassad för att fortplanta sig i serumfritt medium, och (2) odlade på en liten skala för att specifikt stödja robust immunocytokemisk analys. Sammantaget denna metod utgör en snabb och kostnadseffektiv procedur för föröknings mänskliga iPSCs i serumfria betingelser för att bekräfta deras pluripotens rutinmässigt med hjälp av immuncytokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSCs härleddes från humana dermala fibroblaster isolerade från 4 mm huden punsch biopsier och omprogrammeras i huset via Sendai-virus-medierad omprogrammering 11. University of Arizona Institutional Review Board godkänt alla förfaranden för ämne rekrytering och biopsi samling.
1. Framställning av extracellulär matris belagd yta för iPSC Kultur
- En dag före sammanflödet av hiPSC kulturer växer på iMEFs, förbereda extracellulära matrix (Matrigel) belagda plattor.
- Långsam tina en portion av den extracellulära matrisen (mycket beroende, följ instruktionerna på specifikationsbladet) på is i 4 ° C under 2 timmar.
- I en biosäkerhet huva, med användning av kalla pipettspetsar (förvaras vid -20 ° C), tillsätt en alikvot av extracellulär matris för kyla Dulbeccos Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12 / HEPES) enligt det mycket specifika spädningsfaktor .
- Dispensera ~ 60081; L av extracellulär matris per brunn av varje ny cellkultur behandlade 12-brunnars platta behövs.
- Inkubera plattan vid rumstemperatur under flera timmar. Här använder en 3 h inkubationstid.
OBS: Plattorna kan användas omedelbart eller lagras vid 4 ° C i upp till två veckor.
2. Överföring av hiPSCs odlas på Imef matarceller på Extracellulär Matrix för Förökning
- På dagen för passage, ta bort matrisen belagda plattan från 4 ° C och låt plattan anpassa sig till rumstemperatur under 1 timme i vävnadsodling huven.
- Aspirera mediet från en brunn i en 6-brunnar i hiPSC kultur växer på iMEFs och ersätta med 500 mikroliter kollagenas dissociation reagens (1 mg / ml i basala odlingsmedium).
- Inkubera vid 37 ° C under ~ 10-30 min tills kanterna av IPSC kolonier tycks lättar något.
OBS: Inkubationstiden är linjeberoende och kommer att variera. Övervaka dissociation under ett mikroskop. - Bilefully aspirera dissociation reagens och tvätta försiktigt 2 gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4).
- Tillsätt 1 mL rumstemperatur mTeSR1 komplett medium med 10 ng / ml Rho-associerat proteinkinashämmare (Y-27632 ROCK-inhibitor) till brunnen.
OBS: Med användning av en 50:50 blandning av Imef-konditionerat medium och mTeSR1 under denna inledande passage föreslås och kan vara fördelaktigt för överlevnaden av de hiPSCs under detta medium övergång. - Med användning av en liten faskontrastmikroskop placerad partiellt inuti huven, manuellt göra mål och plocka 1 - 2 hiPSC kolonier (~ 700 - 1000 | j, m i diameter) med användning av en spruta och nål (25 G, 1 ½ i). Skjut bort den perforerade bitar av kolonin i mediet med en P200 pipettspets.
- Aspirera och avyttra matrisen från den nya plattan, och vara noga med att inte störa beläggningen.
- Överföring 1 ml av cellsuspensionen från den gamla brunn innehållande skårade iPSCs in i den nya matrisen belagda brunnen.
- Place plattan i inkubatorn vid 37 ° C, 5% CO2. Rock plattan i flera snabb, back-och-tillbaka, och från sida till sida rörelser jämnt sprida ut cellerna. Stör inte plattan under 24 timmar.
- Utföra dagliga fulla medier förändringar mTeSR1 komplett medium (tillägg av Y-27.632 ROCK Inhibitor behövs inte efter den initiala plätering i steg 2,5).
3. Småskalig Aging av hiPSCs på Matrix-belagda plattor
OBS: I allmänhet, efter den inledande överföringen av hiPSCs till matris belagda plattor, cellerna bör passera en gång mer på ett liknande sätt för att säkerställa alla iMEFs har eliminerats och cellerna har anpassat sig till feeder-fria betingelser.
- En dag före iPSC konfluens förbereda nyligen belagda matrisplattor som diskuteras i avsnitt 1.
- På dagen för passage, ta bort matrisen belagda plattan från 4 ° C inkubation och låt plattan anpassa sig till rumstemperatur under 1 timme i vävnaden culture huva.
- Aspirera mediet från en brunn i en 6-brunnar av hiPSCs (ursprungligen övergått från matare till matris) och ersätta med 500 mikroliter cell dissociation buffert.
OBS: Den kommersiella cell dissociation buffert som används här (se Material tabell) är mer lämpade för användning med mTeSR1 medel jämfört med kollagenas. - Inkubera vid rumstemperatur under 3-7 min tills kanterna av IPSC kolonier tycks lättar något. Som tidigare nämnts, är inkubationstiden linjen beroende och variabel. Därför övervaka den cellulära dissociation under ett mikroskop för att bestämma den optimala tiden.
- Försiktigt aspirera dissociation buffert och tvätta försiktigt 2 gånger med PBS.
- Tillsätt 500 mikroliter av rumstemperatur mTeSR1 komplett medium med 10 ng / ml Y-27632 ROCK-inhibitor till brunnen.
- Istället för poäng kolonier som i steg 2,6, tryck önskat antal kolonier i media med en P200 spets och försiktigt mal sönder cellsuspensionen 2 gånger against en hörnet av brunnen för att bryta de hiPSC kolonier in i klumpar av ~ 50 till 200 | j, m i storlek. Till exempel, för en 12-brunnars platta, plocka 1 - 2 kolonier för att överföra in i varje en ny brunn. Överför cellsuspensionen från den gamla väl in i en enda ny brunn i en 12-brunnars platta.
- Vicka plattan i flera snabb, back-och-tillbaka, och sida-till-sida rörelser för att jämnt sprida ut cellerna, och låt plattan vila under 24 timmar i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Utföra dagliga fulla medier förändringar mTeSR1 komplett medium. Som tidigare nämnts, är det inte nödvändigt att lägga till Y-27632 ROCK Inhibitor efter den initiala pläteringen.
OBS: Oanvända IPSC kolonier från Steg 3,7 kan vara lätt frysförvarade vid denna punkt.
4. Framställning av avdelningen Slides och Täck för sådd av hiPSCs för Immunocytochemistry
OBS: Följande protokoll utnyttjar 4-väl plastkammare diabilder och 12 mm täckglas med appropriate volymer av media i fler brunnarna för att stödja en kostnadseffektiv immuncytokemi. Emellertid kan mediavolymer ökas om man önskar att använda större brunn och täckglas storlekar.
- En dag före hiPSC sammanflödet, förbereda kammare diabilder nyligen belagda med extracellulär matris som diskuteras i avsnitt 1. Lägg tillräckligt matrislösning (~ 300 - 500 mikroliter per brunn av en 4-väl kammare slide) att helt belägga varje brunn utan någon oro för avdunstning. Alternativt, efter att placera en rengöras och steriliseras täck i varje brunn i en 24-brunnar, rock med 500 mikroliter extracellulärt matrix och se till att täck inte flyter ovanpå lösningen.
- På dagen för passagen, ta bort de belagda kammar diabilder / täckglas från 4 ° C och tillåta acklimatisering till rumstemperatur under 1 h i vävnadsodling huven.
- Aspirera mediet från en brunn på en 12-brunnar av hiPSCs och ersätta med 500 mikroliter dissociation buffert.
- Inkubera vid rums tempeperatur under ~ 3-7 min tills kanterna av IPSC kolonier tycks lättar något.
- Försiktigt aspirera dissociation buffert och tillsätt 1 ml av rumstemperatur mTeSR1 komplett medium med 10 ng / ml Y-27632 ROCK Inhibitor till brunnen.
- Med hjälp av en liten faskontrastmikroskop placerad inuti vävnadsodling huva, plocka en koloni / ny brunn i en 4-väl kammare bild eller en ny täck manuellt skall pläteras (~ 1000 - 1500 mikrometer i diameter) med en P200 pipettspets genom att trycka den av plattans yta in i mediet.
- Aspirera matrisen från den nya kammaren slide / täck, försiktigt så att inte störa beläggningen.
- triturera försiktigt cellsuspensionen 2 gånger mot ett hörn av brunnen för att bryta de hiPSC kolonier in i klumpar av ~ 50 till 200 | j, m i storlek. Överföra 250 mikroliter av cellsuspensionen från den gamla långt in varje ny brunn i en 4-brunnars kammarobjektglas / täckglas.
- Ta volymen för varje ny brunn upp till 500 mikroliter med mTeSR1 fortsaining 10 ng / ml Y-27632 ROCK Inhibitor.
- Placera kammaren glid / täckglas i inkubatorn vid 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 24 timmar, utföra dagliga fulla medier förändringar mTeSR1 komplett medium. Igen som tidigare nämnts, är det inte nödvändigt tillsats av Y-27632 ROCK Inhibitor efter den initiala pläteringen.
5. Beredning av iPSCs för Immunocytochemistry
- När sammanflytande, bevara hiPSC kolonierna via fixering genom att ta bort media från brunnarna och lägga förvärmda VARNING 4% paraformaldehyd (~ 300 mikroliter / brunn av en 4-väl kammare glida / täck). Inkubera vid rumstemperatur i 20 min.
- Kassera paraformaldehyd lämpligt enligt institutionella biologiskt och kemikaliesäkerhetsriktlinjer.
- Tvätta cellerna 3 gånger under 5 min vardera på en bänk-topp shaker med PBS.
OBS: Celler på kammarglas / täck kan lagras med riklig PBS vid 4 ° C på obestämd tid i detta skede.Alternativt kan de användas omedelbart för ICC.
6. Immunfärgning av hiPSCs med pluripotens markörer
OBS: Immunostain hiPSCs med standard pluripotens antikroppar. Som ett exempel, här celler är dubbel färgades med antikroppar targeting en en yta och en intracellulär antigen i ett sekventiellt sätt enligt följande: Anti-Stage-Specific Embryonala Antigen-4 (SSEA4) med anti-oktamer-bindande protein 4 (oktober- 4) och anti-Tra-1-60 med anti-SRY besläktad HMG BOX gen 2 (Sox2) (se Material tabell för mer information antikropps).
- Aspirera PBS från brunnarna och tillsätt i 500 mikroliter / brunn blockeringslösning utan Triton-X-100. Inkubera under 1 h vid rumstemperatur.
- Förbereda en förutbestämd koncentration (här, använder en: 200) av ytan antikroppar, antingen SSEA4 eller Tra-1-60, genom spädning i blockeringslösning utan Triton X-100.
- För kammarglas, förbereda 300 | il / brunn av en 4-brunnars kammarobjektglasgenom att blanda 298,5 mikroliter blockeringslösning ovan och 1,5 mikroliter av anti-SSEA4 eller Tra-1-60 primära antikroppen.
- För täckglas, framställa 40 mikroliter / täckglas genom att blanda 199 | il av blockeringslösning och 1 mikroliter av anti-SSEA4 eller Tra-1-60 primära antikroppen.
- Sug den blockerande lösningen från kammaren bilden och fördela den primära antikroppen i lämpliga brunnar. För täck, placera en bit parafilm fast inuti en petriskål och fördela 40 mikroliter av den primära antikroppen på toppen som en droppe. Med hjälp av en böjd sprutnål och pincett, lyft försiktigt täck ur odlingsbrunn och placera den cell nedåt på droppe antikropp på parafilm. Inkubera över natten vid 4 ° C.
- Nästa morgon, tvätta cellerna 3 gånger, 5-10 min vardera, genom att ta bort antikroppen från kammaren sliden och tillsats i PBS. För täck, lyft varje av parafilm och placera den tillbaka i en brunn på en 24-brunnar, cell uppåt. Tillsätt försiktigt PBS.
- Utarbeta lämpliga sekundära antikroppar vid 1: 500 i blockeringslösningen.
- För kammarglas, förbereda 300 | il / brunn av en 4-brunnars kammarobjektglas genom att blanda 499 | il av blockeringslösning och 1 mikroliter av get-anti-mus-IgG3 Alexa Fluor 488 (för SSEA4) eller en mikroliter av get-anti-mus-IgM Alexa Fluor 488 (för Tra-1-60).
- För täckglas, framställa 40 mikroliter / täckglas genom att blanda 499 | il av blockeringslösning och 1 mikroliter av get-anti-mus-IgG3 Alexa Fluor 488 (för SSEA4) eller en mikroliter av get-anti-mus-IgM Alexa Fluor 488 (för Tra-1-60 ).
- Aspirera PBS från kammaren bilden och fördela den sekundära antikroppen i lämpliga brunnar. För täckglas, efter steg 6,2, invertera täckglasen på antikropplösningen placeras på parafilm vid rumstemperatur under 2 h.
OBS: Om du använder fluorescerande märkta sekundära antikroppar, måste cellerna skyddas från ljus. Placera kammar diabilder och täck i en mörk ENVironment under inkubationer och tvättar. - Tvätta cellerna 3 gånger under 5 - 10 min vardera genom att avlägsna antikroppen från kammaren sliden och tillsats i PBS. För täck Lyft varje noggrant från parafilm och placera tillbaka i en brunn på en 24-brunnar, cell uppåt. Försiktigt lägga PBS under tvättar.
- Före sondering för det andra antigenet, intracellulär oktober-4 eller Sox2 i detta fall, inkubera igen i blockeringslösning gjord med permeabilitetsreagenset (Triton-X-100) under 1 h vid rumstemperatur.
- Att immunostain för oktober-4 eller Sox2, helt enkelt följa den metod som beskrivs i steg 6.1-6.6 för att tillämpa de primära och sekundära antikroppar. Vid tillämpningen av detta protokoll använder oktober-4 och Sox2 vid en koncentration av 1: 200 och den sekundära antikroppen get-anti-kanin-IgG Alexa Fluor 594 på 1: 500.
- Efter de ovan nämnda primära och sekundära behandlingar antikropps, tvätta cellerna 3 gånger under 5 - 10 min vardera med PBS och motfärga med 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole, dihydroklorid (DAPI) följande standardprotokoll om kärn visualisering önskas.
7. Förberedelse för visning
- För kammarglas, försiktigt bort den övre kammaren från bilden, enligt tillverkarens instruktioner. Sedan, skölj i destillerat vatten, och tillsätt monteringsmedium och ett täckglas för att möjliggöra mikroskopi.
- För täck, invertera täck på en droppe monteringsmedium placeras på ett objektglas.
- Bilden under en standard eller konfokalt fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll ger en stegvis beskrivning av hur mänskliga iPSCs kan överföras från matarskikt till matarfria betingelser, och därefter förökas på ett begränsat sätt att specifikt aktivera kostnadseffektiva immuncytokemi för att bekräfta pluripotens underhåll. Figur 1 visar en schematisk framställning av detta protokoll. Figur 2A visar hiPSC kolonier som växer på iMEFs i 6-brunnars plattor. Dessa kolonier uppvisar typisk morfologi med definierade gränser och tät fas ljusa centra. Såsom visas i fig 2B, efter överföringen av iPSCs att feeder-fria betingelser i 12-brunnsplattor, visas kolonimorfologi något kaotisk med mindre distinkta kanter. Dessutom kan vissa iMEFs kvar i kulturen i detta skede. Figur 2C visar att efter en ytterligare passage i mataren fritt system, IPSC kolonier uppvisar en klassisk mono morfologi med en hög kärna att Cytoplasm förhållande. I detta skede kan man se att iMEFs har praktiskt taget elimineras från kulturen.
Kolonier som växer i matarfria förhållanden mekaniskt plockas och ströks ut på små flera brunnar kammarskivor eller glastäck, och sonderade för specifika pluripotens antigen via immuncytokemi. Figur 3 visar representativa kolonier som är immunpositiva för SSEA4 eller Tra-1-60 (3B, 3F, yta pluripotens antigener) och oktober-4 eller Sox2 (3 A, 3E, intracellulära pluripotens antigener).
Figur 1: Schematisk bild av protokollet. Övergripande schema av den beskrivna metoden används för att flytta över mänskliga iPSCs från Imef matare till feeder-fria kulturen och efterföljande sondering av celler med pluripotens markörer. Imef: Irradia ted Mouse embryonala Fibroblast; iPSC: inducerade pluripotenta stamceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant bilder av IPSC kolonier Övergång från Imef matare till feeder-fria odlingsbetingelser. A) Tät iPSC koloni (vit pil) odlas på Imef matarceller (svart pil). B) Efter den initiala passage på till en matris-belagda 12-brunnars platta i serumfritt medium, några iMEFs kan fortfarande observeras i kultur (svart pil). C) Typisk morfologi av ett monolager iPSC koloni odlas feeder-fri. Inga iMEFs kvar i kulturen i detta skede. Skala Bar (AC) = 100 nm.> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Immuncytokemiska Characterization of Human iPSCs pläterad i små brunnsplattor. Representativa immunofluorescens bilder av iPSCs erhållna via en konfokalmikroskop, visar positivt uttryck för pluripotens markörer A) oktober-4 (röd) och B) SSEA4 (grön) med C) kärn fläcken DAPI (blå), och e) Sox2 ( röd) och F) Tra-1-60 (grön) med G) DAPI (blå). D och H visar overlay bilder om AC och EG. Skalstock (AH) = 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| hiPSC Media för underhåll på matare | ||
| Komponent | lager Koncentration | slutlig koncentration |
| DMEM-F12 / HEPES | 100% | 80% |
| Knockout Serum Byte | 100% | 20% |
| L-glutamin | 200 mM | 1 mM |
| MEM-NEAA | 10 mM | 0,1 mM |
| 2-merkaptoetanol | 55 mM | 0,1 mM |
| Rekombinant humant FGF-Basic | 10 | j, g / ml | 10 ng / ml |
| Y-27.632 ROCK Inhibitor | 10 ^ M | |
| Matrigel beläggning för Feeder-Free kulturer | ||
| Komponent | ||
| Matrigel hESC kvalificerade Matrix | Utspädningsfaktor 269 mikroliter | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 ml | |
| Obs: Utspädningsfaktorn är mycket beroende och måste fastställas från intyg från en analys | ||
| mTeSR1 komplett media för Feeder-Free kulturer | ||
| Komponent | mängd | |
| mTeSR1 Basal Medium | 400 ml | |
| mTeSR1 5x Supplement | 100 ml | |
| Obs! När blandad, kan mTeSR1 komplett medium frysas i alikvoter och användas till komponentutgångsdatum | ||
| Obs: mTeSR1 kompletta medier måste värmas endast rumstemperatur. Placera inte i vattenbad | ||
Tabell 1: IPSC Kultur Media Recept och Plate Coatings.
| 4% paraformaldehyd fixativ | |
| Komponent | mängd |
| 0,1 M PO4 buffert | 2 L |
| Paraformaldehyd, prill | 80 g |
| ICC blockeringslösning utan Triton-X-100 | |
| Komponent | mängd |
| 1x Fosfatbuffrad saltlösning | 49 mL |
| Normalt getserum | 1 ml |
| Bovint serumalbumin | 0,5 g |
| ICC blockeringslösning med Triton-X-100 | |
| Komponent | mängd |
| 1x Fosfatbuffrad saltlösning | 49 mL |
| Normalt getserum | 1 ml |
| Bovint serumalbumin | 0,5 g |
| Triton-X-100 | 200 mikroliter |
Tabell 2: Fixative och Immunocytochemistry recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den systematiska Protokollet presenteras här erbjuder en tidsbesparande och kostnadseffektiv metod, i form av en förminskad odlingsteknik, särskilt utformade för att stödja en effektiv pluripotens analys via immuncytokemi.
De främsta fördelarna med den metod som beskrivs är som följer. Traditionellt mer än tre till fyra passager behövs för att övergå iPSCs från matarlager för att matarfria odlingsbetingelser för att eliminera rest iMEFs återstår efter användning av bulk dissociation tekniker och typiska mono morfologi visas 12, 13. I motsats, den metod som presenteras här innebär en förkortad tidslinjen, vilket gör det möjligt att relativt snabb överföring av iPSCs till serumfria betingelser via manuell plockning av IPSC kolonier. De iPSCs odlas i begränsade mängder i små kammare diabilder eller täck främjar för immunocytokemi. I själva verket den VOLUmig odlingsmedium som behövs per brunn är bara 0,5 ml och volymen av utspädd antikroppslösning som krävs för en enda täck är så nominella som 40 mikroliter eller 300 mikroliter per kammare väl, när man använder detta protokoll.
Vi finner att tillsatsen av lika delar Imef konditionerat medium till mTeSR1 under den inledande passagen (steg 2,5) är ett viktigt steg som hjälper i överlevnad och underhåll av IPSC: s pluripotenta morfologi. Dessutom, om cell följsamhet är inte optimalt efter passage (steg 2,2, 3,3 och 4,3), felsökning kan utföras genom att ytterligare optimera dissociation gånger används.
Slutligen, en begränsning av den presenterade småskalig metod, jämfört med andra tekniker såsom flödescytometri används också för att kontrollera pluripotens, är att den inte tillåter för fortsatt förökning analyserade celler för tillämpningar efter. Nyttan av vår metod härrör från dess specifika utformning som stöder cost och effektivt kultur hiPSCs för att bekräfta pluripotens via rutin immunocytokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
