Introduction
Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine insan yetişkin somatik hücre yeniden programlama (iPSCs) Hastalık 1, 2 incelemek için hastaya özgü hücrelerin bir potansiyel olarak sınırsız kaynağı elde etmek için bir yol sağlar. In vitro bir hastalık fenotipi yansıtan bu makul hastalığı ile ilişkili hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek yapmak ve uyuşturucu keşif geliştirmek ve tıp 3. kişiselleştirilmiş olur. Buna ek olarak, insan iPSCs (hiPSCs) ölü ya da işlevsiz hücrelerinin yerini alır ve birçok hastalığın 4 kapsamında, 5 fonksiyonu geri eşsiz bir kaynak olarak kullanılabilecek özel hücre tipleri kaynaklanan imkanı sunuyoruz.
Yukarıdaki uygulamalarda iPSCs kullanarak önemli bir ön koşul kendi pluripotent ve farklılaşmamış devlet kültüründe genişleme sırasında muhafaza edilmesini sağlamaktır. Tipik haliyle, TECHNIQhücre ve özel ekipman büyük miktarlarda ihtiyaç gibi akış sitometrisi, Western blotting, polimeraz zincir reaksiyonu ve işlevsel tahlilleri gibi daah, iPSC pluripotensin 6, 7, 8, 9, 10, ayrıntılı analiz için kullanılmıştır. Ancak, iPSCs 'farklılaşmamış devletin rutin değerlendirme etkin şekilde azaltılmış zaman ve kaynak içeren, özellikle immünsitokimya (ICC) için bu hücrelerin sınırlı yayılımı yoluyla elde edilebilir.
Son gelişmeler, murin fibroblast besleyici tabakalar ve serum ihtiva eden ortam gerektiren geleneksel kültür sistemlerine göre önemli bir gelişmedir tanımlanan serumsuz koşullarda iPSCs büyümesi izin verir. Bununla birlikte, mevcut literatür besleyici iPSCs geçiş anlatan net adım adım protokolleri içermezbesleyici içermeyen sistemlere tabaka.
Bu bağlamda, bu protokol, sistematik olarak ışınlanmış fare embriyonik fibroblast üzerinde büyümüş hiPSCs (IMEF) besleyici tabakalar (1) olarak, serumsuz ortam içinde yayılması için uyarlanmış, ve (2), bir küçük ölçekte kültürlendi özellikle sağlam bir destek nasıl detayları immünositokimyasal analizi. Genel olarak, bu yöntem, immünsitokimya kullanarak rutin olarak kendi pluripotensini teyit etmek için, serum içermeyen koşullar insan iPSCs yaymak için zamanında ve düşük maliyetli bir prosedür gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSCs 4 mm deri delici biyopsilerinden izole edilmiş ve Sendai virüsü aracılı yeniden programlama 11 üzerinden ev yeniden programlanabilir, insan dermal fibroblastlarında elde edilmiştir. Arizona Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi konusu işe alınması ve biyopsi toplanması için tüm prosedürleri onayladı.
iPSC Kültür Ekstraselüler Matriks Kaplı Yüzey 1. Hazırlık
- Bir gün önce iMEFs üzerinde büyüyen hiPSC kültürlerin izdiham, hücre dışı matriks (Matrigel) kaplı plakaları hazırlamak.
- Yavaş çözülme ekstraselüler matriksin bir kısım 2 saat boyunca 4 ° C buz üzerinde (bağımlı sürü özellikler sayfasında talimatları izleyin).
- Bir biyo-güvenlik kaput, soğuk pipet uçları kullanılarak (DMEM / F12 / HEPES) çok özel bir seyreltme faktörüne göre, soğuk Dulbecco Modifiye Eagle ortamı / besin karışımı F-12 hücre dışı matrisin 1 kısım ekleyin (-20 ° C'de saklanan) .
- Dağıtın ~ 60081; her bir yeni hücre kültürü oyuk başına hücre dışı matrisin L 12-çukurlu plaka gerekli işlemden geçirildi.
- Birkaç saat süreyle oda sıcaklığında inkübe plakası. Burada, 3H inkübasyon süresi kullanın.
Not: Plakalar hemen kullanılabilir veya iki haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
Yayma Ekstraselüler Matrix üzerine IMEF Besleyici Hücreleri Yetiştirilen hiPSCs 2. Transferi
- pasajlarının günde, 4 ° C ila matris kaplı plaka kaldırmak ve plaka, doku kültürü kaputu 1 saat boyunca oda sıcaklığına gelmesini sağlar.
- iMEFs büyüyen hiPSC kültür 6 oyuklu plaka 1 kuyusundan orta aspire 500 uL kolajenaz ayrılma maddesi ile yerine (1 mg / bazal kültür ortamı içinde ml).
- iPSC koloni kenarları hafif asansör görünene kadar 30 dakika - ~ 10 boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: İnkübasyon süresi çizgisi bağlıdır ve değişecektir. Bir mikroskop altında ayrışmasını izleyin. - arabaefully ayrılma reaktif aspire ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, pH 7.4) ile yavaşça 2 kez yıkayın.
- de 10 ng / ml Rho-ilişkili protein kinaz önleyicisi (Y-27632 ROCK inhibitörü) ile oda sıcaklığı mTeSR1 tam orta 1 ml.
Not: Bu, ilk geçişi sırasında IMEF durumunu orta ve mTeSR1 50:50 karışımı kullanılarak önerilmektedir, bu ortam geçiş sırasında hiPSCs devamı için yararlı olabilir. - El skor ve 1 pick kaput içinde kısmen yerleştirilen küçük bir faz kontrast mikroskop kullanarak - 2 hiPSC koloniler (~ 700 - çapı 1.000 mm) bir şırınga ve iğne (25 G, 1½ içinde) ile. P200 pipet ucu ile ortama koloni attı adet kapalı itin.
- Aspire kaplama rahatsız etmemek için dikkatli olmak, yeni plakadan matris imha ve.
- Eski iyi iyi kaplı yeni matris içine attı iPSCs içeren hücre süspansiyonu transferi 1 ml.
- Pla37 ° C'de inkübatör içinde plaka Ce,% 5 CO2. birkaç hızlı geri ve ileri-plaka Kaya ve yan-yan hareketleri eşit hücreleri yaymak için. 24 saat süreyle plaka rahatsız etmeyin.
- mTeSR1 tam ortam (Y-27632 ROCK-önleyici maddesinin ilave adım 2.5 sonra ilk kaplama gerekli değildir) günlük tam ortam değişiklikleri gerçekleştirme.
Matris kaplanmış plakalar üzerinde hiPSCs 3. Küçük ölçekli pasaj
Not: Genellikle kaplanmış plakalar matris hiPSCs ilk transferinden sonra, hücreler her iMEFs elimine edilmiştir ve hücreler koşulları içermeyen besleyici adapte emin olmak için, benzer bir şekilde bir kez daha geçirilmiştir edilmelidir.
- 1. bölümde tartışıldığı gibi önce iPSC confluency Bir gün taze matris plakaları kaplı hazırlamak.
- geçidin günde, 4 ° C inkübasyon matris kaplı plaka kaldırmak ve plaka, doku, Cul, 1 saat boyunca oda sıcaklığına gelmesini sağlarTure kukuleta.
- (Orjinal matris besleyiciden geçiş) hiPSCs bir 6-yuvalı plaka 1 kuyusundan orta aspire ve 500 uL hücre ayrışma tamponu ile değiştirin.
Not: Burada kullanılan ticari bir hücre ayırma tamponu (Malzeme Tablo) kolajenaz ile karşılaştırıldığında mTeSR1 ortamı ile kullanım için daha uygundur. - iPSC koloni kenarları hafif asansör görünene kadar, 7 dakika - 3, oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha önce belirtildiği gibi, kuluçkalama süresi hattı bağımlı ve değişkendir. Bu nedenle, optimal zamanı belirlemek için bir mikroskop altında hücre ayrışma izler.
- Dikkatle ayrışma tampon aspire ve PBS ile hafifçe 2 kez yıkayın.
- de 10 ng / ml-Y-27632 ROCK önleyicisi ile oda sıcaklığı mTeSR1 tam orta 500 uL ekleyin.
- Bunun yerine Adım 2.6 gibi puanlama kolonilerinin, P200 ucunu kullanarak ortama kolonilerin istenilen sayıda itin ve yavaşça hücre süspansiyonu 2 kez ag çiğnemekboyutunda 200 mikron - Kuyunun bir köşesi ~ 50 kümeleri içine hiPSC kolonileri kırmak için ainst. Her 1 yeni kuyunun içine aktarmak için 2 koloni - örneğin, bir 12 plaka için, 1 seçin. de 12 oyuklu bir plakanın yeni tek bir kuyuya eski hücre süspansiyonu aktarın.
- Birkaç hızlı geri ve ileri-plaka Kaya ve yan-yan hareketleri eşit hücreleri yaymak için, ve 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör 24 saat süreyle plaka dinlendirin.
- mTeSR1 tam orta günlük tam bir medya değişiklikleri gerçekleştirmek. Daha önce de belirtildiği gibi, ilk kaplama sonrası Y-27632 ROCK İnhibitörü eklemek gerekli değildir.
NOT: Adım 3.7 Kullanılmayan iPSC kolonileri bu noktada kolaylıkla donduruldu olabilir.
Immünsitokimya hiPSCs ve Yayımlamak için Odası Slaytlar ve lameller 4. hazırlanması
NOT: Aşağıdaki protokol 4-iyi plastik hazne slaytlar ve appropriat ile 12 mm cam lamelleri kullanırÇoklu kuyularda medya e hacimleri düşük maliyetli immünsitokimya desteklemek. daha iyi ve kapak boyutları istenensonuçları Ancak, ortam hacmi arttırılabilir.
- Bir gün hiPSC izdiham önce, yeterli matris çözümü bölüm 1'de tartışıldığı gibi taze ekstrasellüler matriks ile kaplı odası slaytlar hazırlamak ekle (~ 300 - 4-iyi bir oda slayt oyuk başına 500 uL) herhangi bir kaygı olmadan iyi tam kat, her buharlaşma. Seçenek olarak ise, 500 uL, her bir 24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu, kat halinde hücre dışı matrisi 1 temizlenmesi ve sterilize lamel yerleştirilmesi ve örtücü cam, çözelti üstünde yüzen olmadığından emin olun sonra.
- geçidin günde, 4 ° C ila kaplanmış bölmeli lamlar / lamelleri çıkarın ve doku kültürü kaputu 1 saat oda sıcaklığında aklimasyonundan sağlar.
- hiPSCs bir 12 oyuklu plaka 1 kuyusundan orta aspire 500 uL ayrılma tamponu ile değiştirin.
- Oda tempe inkübe~ 3 rature - 7 dakika iPSC kolonilerinin kenarları hafifçe kaldırın görünene kadar.
- Dikkatle ayrılma tampon aspire ve de 10 ng / ml-Y-27632 ROCK önleyici ile oda sıcaklığı mTeSR1 tam orta 1 ml.
- elle 4-iyi odasının slayt ya da 1 yeni lamel 1 koloni / Yeni bir kuyu pick doku kültürü kaputu içine yerleştirilen küçük bir faz kontrast mikroskop kullanarak kaplama için (~ 1000 - çapı 1.500 mm) iterek P200 pipet ucu kullanılarak kapalı ortama plaka yüzeyi.
- kaplama rahatsız etmemek için dikkatli olmak, yeni bölme slayt / lamel matrisi aspire.
- boyutunda 200 mikron - Yavaşça ~ 50 kümeleri içine hücre süspansiyonu hiPSC koloniler kırmak için kuyunun bir köşesinde karşı 2 kez çiğnemek. iyi bir 4-iyi odasının slayt / lamel her yeni kuyunun içine eski hücre süspansiyonu 250 mcL aktarın.
- iyi mTeSR1 cont ile 500 mcL kadar her yeni ses getirmek10 ng / ml-Y-27632 ROCK İnhibitörü Tahliye.
- 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübatörde odası dia / lamelleri yerleştirin.
- 24 saat sonra, tam bir ortamda mTeSR1 günlük tam ortam değişimleri gerçekleştirmek. Daha önce belirtildiği gibi, yine, Y-27632 ROCK-önleyici maddesinin ilave sonra ilk kaplama gerekli değildir.
İmmünositokimya için iPSCs 5. hazırlanması
- Birleşmiş sonra, önceden ısıtılmış DİKKAT% 4 paraformaldehid kuyu ortamı çıkarılması ve eklenerek tespit ile hiPSC koloniler muhafaza (~ 300 uL / oyuk, 4 oyuklu oda slayt / lamel). 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- uygun kurumsal biohazard ve kimyasal güvenlik yönergelerine göre paraformaldehid atın.
- PBS ile bir tezgah üstü bir karıştırıcı üzerinde her biri 5 dakika için hücreler 3 kez yıkayın.
NOT: oda slaytlar üzerinde hücreler / lamelleri bu aşamada belirsiz 4 ° C'de geniş bir PBS ile saklanabilir.Seçenek olarak ise, hemen ICC için kullanılabilir.
Pluripotency belirteçlerinin ile hiPSCs 6. immün
NOT: Standart Pluripotency antikorları ile immunostain hiPSCs. Bir örnek olarak, burada hücreler çift lekelenmiş aşağıda antikorlar, bir 1 yüzeye ve sıralı bir şekilde 1, hücre içi antijen hedefleme şunlardır: Anti-safha spesifik Embriyonik Antijen 4 (SSEA4) protein 4 (okt anti Oktamer bağlayıcı 4) ve anti-Tra-1-60 Anti-SRY HMG kutu genidir 2 (Sox2) ile () antikoru ayrıntılar için Materyaller Tablo bakınız.
- Kuyulardan PBS aspire ve Triton-X-100 olmadan 500 uL / kuyu Engelleme Çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Triton X-100 olmadan bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmesi ile yüzey antikorların, SSEA4 ya TRA-1-60 ya: önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda hazırlanması (200, burada 1 kullanın).
- oda slaytlar, bir 4-çukurlu oda slayt 300 uL / oyuk hazırlanmasıYukarıdaki solüsyon ve anti-SSEA4 Tra-1-60 birincil antikor 1.5 ul Bloklama 298.5 uL karıştırılarak.
- lamelleri için, Çözüm ve anti-SSEA4 veya Tra-1-60 birincil antikor 1 mcL Engelleme 199 uL karıştırılarak 40 mL / lamel hazırlar.
- kamara slayt Engelleme Çözüm aspire ve uygun kuyulara primer antikor dağıtmak. lamelleri için sıkıca bir Petri kabı içinde parafilm bir parça koyun ve bir damlacık olarak üst birincil antikor 40 mcL dağıtın. bükülmüş bir şırınga iğnesi ve forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde iyi kültürün dışına lamel kaldırın ve parafilm üzerindeki antikor damla üzerine aşağıya doğru hücre tarafı yerleştirin. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
- odası slayt antikorun uzaklaştırılması ve PBS içinde eklenerek 10 dakika her biri, - Ertesi sabah, hücreler 3 kez, 5 yıkayın. lamelleri için parafilm kapalı her biri kaldırın ve 24-plaka, hücre tarafı üste gelecek bir kuyuda geri koyun. Dikkatle P eklemekBS.
- 1 de uygun ikincil antikor hazırlayın: 500 Engelleme Çözüm.
- oda slaytlar için hazırlamak 300 uL / kuyu 4-iyi bir oda slayt anti-fare IgM Alexa Fluor keçi anti-fare IgG3 Alexa Fluor 488 (SSEA4 için) veya 1 uL keçi uL Engelleme Çözüm 499 uL karıştırma ve 1 ile 488 (Tra-1-60 için).
- lamelleri için, bloklama çözeltisi 499 uL karıştırılarak 40 uL / lamel hazırlayıp keçi 1 ul anti-fare IgG3 Alexa Fluor 488 keçi ul anti-fare IgM Alexa Fluor 488 (SSEA4 için) veya 1 (Tra-1-60 ).
- kamara slayt PBS aspire ve uygun kuyulara ikincil antikor dağıtmak. lamelleri, Aşama 6.2 ardından, 2 saat boyunca oda sıcaklığında parafilm yerleştirilen antikor çözeltisi üzerine lamelleri ters çevirin.
Not: kullanarak, ışıltılı ikincil antikorlar etiketlemişse hücreler ışıktan korunmalıdır. Karanlık bir env odasının slaytlar ve lamelleri yerleştirininkubasyon ve yıkama sırasında ironment. - kamara slayt antikoru çıkarılması ve PBS eklenerek 10 dk - her 5 için Hücreleri 3 kere yıkayın. lamelleri için parafilm dikkatlice her biri kaldırın ve 24-plaka, hücre tarafı üste gelecek bir kuyuda geri yerleştirin. Yavaşça yıkama sırasında PBS ekleyin.
- İkinci antijen için tarama önce, hücre içi OCT-4 ya da bu durumda, Sox2, oda sıcaklığında 1 saat süre ile geçirimli hale reaktifi (Triton-X-100) ile yapılan engelleme solüsyonu içinde tekrar inkübe edin.
- Ekim-4 ya da Sox2 immunostain için, sadece birincil ve ikincil antikorlar ve uygulanması aşamalarım 6,1-6,6 açıklanan yöntem takip edin. 1'den 200 ve ikincil antikor keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594: Bu protokolün amaçları için, 1 konsantrasyonda OCT-4 ve Sox2 kullanın 500.
- 6'-diamidino-2, 'PBS ile 10 dakika her ve 4 ile counterstain - yukarıda belirtilen birincil ve ikincil antikor tedavileri sonrasında, 5 için hücreler 3 kere yıkayın-phenylindole, nükleer görüntüleme isteniyorsa standart protokoller aşağıdaki dihidroklorür (DAPI).
Görüntüleme 7. Hazırlık
- oda slaytlar için, üreticinin talimatlarını dikkatlice takip, slayt üst bölmeyi çıkarın. Daha sonra, damıtılmış su içinde durulanır ve mikroskopi sağlamak için ortam ve coverglass monte ekleyin.
- lamelleri için, orta bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirilen montaj bir damla üzerine lamelleri ters.
- Bir standart veya konfokal floresan mikroskop altında görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, özellikle Pluripotency bakım teyit için maliyet-etkin immünsitokimya sağlamak için sınırlı bir şekilde besleyici serbest koşulları besleyici tabaka transfer ve daha sonra yayılan nasıl insan iPSCs bir adım adım açıklama sağlar. Şekil 1, bu prosedürün şematik bir temsilini göstermektedir. Şekil 2A, 6-çukurlu plakalara iMEFs üzerinde büyüyen hiPSC kolonileri gösterir. Bu koloniler tanımlanmış sınırlar ve yoğun faz parlak merkezleri ile tipik morfoloji gösterirler. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, 12 oyuklu plakalar içinde iPSCs devri sonrası besleyici içermeyen koşullar, koloni morfolojisi daha az belirgin kenarları olan biraz kaotik görüntülenir. Ayrıca, bazı iMEFs bu aşamada kültür içinde kalabilir. Şekil 2C, besleyici-sistemde ek bir geçişten sonra iPSC koloniler CY yüksek çekirdeği ile klasik bir tek tabaka morfolojiye sahiptir göstermektedirtoplasm oranı. Bu aşamada, iMEFs neredeyse kültürden ortadan kaldırılmıştır görülmektedir.
besleyici içermeyen koşullar altında büyüyen koloniler mekanik aldı ve oda slaytlar veya cam lamelleri küçük çok iyi kaplanmıştır ve immünsitokimya üzerinden belirli Pluripotency antijenleri için probed. Şekil 3 SSEA4 veya Tra-1-60 (3B, 3F, yüzey Pluripotency antijenler) ve Ekim-4 veya Sox2 (3 A, 3E, hücre içi Pluripotency antijenleri) için immünopozitif olan temsili kolonileri gösterir.
Şekil 1: Protokol şematik temsili. IMEF besleyiciler insan iPSCs geçiş için kullanılan açıklanan yönteme genel şema besleyici içermeyen kültür ve sonraki Pluripotency işaretleri ile hücrelerin sondalama. IMEF: irradia ted Fare Embriyonik fibroblast; iPSC: Pluripotent Kök Hücre Bağlı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Besleyici serbest Kültür Şartları IMEF Besleyiciler gelen Geçiş iPSC Kolonileri Şekil 2. Temsilcisi Görüntüler. IMEF besleyici hücreler (siyah ok) yetiştirilen A) Yoğun iPSC koloni (beyaz ok). B) serumsuz bir ortam içinde, bir matris ile kaplanmış 12-yuvalı plakaya başlangıç geçişten sonra, bir kaç iMEFs de) kültür (siyah okla gözlenebilir. C) bir tek tabaka Tipik morfoloji iPSC koloni besleyici içermeyen büyüdü. Resim iMEFs bu aşamada kültür kalır. Ölçek Bar (AC) 100 mikron =.> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Küçük Kuyu Tabaklar İnsan iPSCs Kaplama İmmünositokimyasal Karakterizasyonu. Temsilci C Pluripotency belirteçlerinin A) Ekim-4 (kırmızı) ve B) SSEA4 (yeşil)) nükleer leke DAPI (mavi) pozitif ifadesini gösteren bir konfokal mikroskop ile elde iPSCs immünofloresan görüntüleri, ve E) Sox2 ( kırmızı) ve F G) Tra-1-60 (yeşil)) DAPI (mavi). D ve H AC ve EG ile ilgili bindirme görüntüleri göstermek. Ölçek çubuğu (AH) = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Besleyiciler üzerinde bakım için hiPSC Medya | ||
| Bileşen | Hazır Konsantrasyon | nihai konsantrasyon |
| DMEM-F12 / hepes | 100% | % 80 |
| Nakavt Serum Yedek | 100% | % 20 |
| L-Glutamin | 200 mM | 1 mM |
| MEM-NEAA | 10 mM | 0.1 mM |
| 2-merkaptoetanol | 55 mM | 0.1 mM |
| Rekombinant İnsan FGF-Temel | 10 ug / ml | 10 ng / ml |
| Y 27632 ROCK İnhibitörü | 10 uM | |
| Besleyici-Free kültürler için Matrigel kaplama | ||
| Bileşen | ||
| Matrigel hESC nitelikli Matrix | Seyreltme Faktörü 269 uL | |
| DMEM-F12 / hepes | 25 mL | |
| Not: Seyreltme Faktörü çok bağlıdır ve analiz sertifikası itibaren tespit edilmelidir | ||
| Besleyici-kültürlere mTeSR1 komple ortam | ||
| Bileşen | Tutar | |
| mTeSR1 Bazal Orta | 400 mL | |
| mTeSR1 5x Supplement | 100 mL | |
| Not: Karışık sonra mTeSR1 eksiksiz bir medya donduruldu olabilir ve bileşen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir | ||
| Not: mTeSR1 komple medya sadece oda sıcaklığında ısıtılmalıdır. su banyosunda koymayın | ||
Tablo 1: iPSC Kültür Medya Tarifler ve Plaka kaplamaları.
| % 4 paraformaldehid sabitleme maddesi | |
| Bileşen | Tutar |
| 0.1 M PO 4 tampon | 2 L'lik |
| Paraformaldehyde, pril | 80 g |
| Triton-X-100 olmadan ICC Engelleme Çözümü | |
| Bileşen | Tutar |
| 1x Fosfat Tamponlu Salin | 49 ml |
| Normal keçi serumu | 1 mL |
| Sığır serum albumini | 0.5 gr |
| Triton X-100 ile ICC Bloklama çözeltisini | |
| Bileşen | Tutar |
| 1x Fosfat Tamponlu Salin | 49 ml |
| Normal keçi serumu | 1 mL |
| Sığır serum albumini | 0.5 gr |
| Triton-X-100 | 200 uL |
Tablo 2: Saptayıcı ve İmmünositokimya Tarifler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan sistematik protokol özellikle immünsitokimya yoluyla etkili Pluripotency analizini desteklemek için tasarlanmış bir küçültülmüş kültür tekniği şeklinde bir zaman kazandıran ve maliyet-etkin bir yöntem, sunmaktadır.
şöyle tarif metodolojinin temel avantajlarıdır. Geleneksel olarak en fazla 3 ila 4 geçitler 12, 13 görünmesini dökme ayrılma tekniklerinin kullanımı sonrası kalan iMEFs ortadan kaldırmak için ve tipik tek tabakalı morfoloji için kültür koşulları içermeyen beslemeyi sağlayan besleyici tabakadan iPSCs geçiş için gereklidir. Bunun aksine, burada sunulan yöntem iPSC kolonilerin Cımbızlama ile serumsuz koşullar iPSCs nispeten hızlı transferini sağlayan bir kısaltılmış bir zaman çizelgesi, içerir. iPSCs küçük oda slaytlar veya immünsitokimya elverişli lamelleri sınırlı miktarda yetiştirilmektedir. Aslında, VOLUoyuk başına gereken kültür ortamının me sadece 0.5 mL ve bu protokolü kullanıldığında tek lamel için gerekli seyreltilmiş antikor çözeltisi hacmi de nominal 40 olarak uL veya bölme başına 300 ml.
Biz IMEF ilk geçiş sırasında mTeSR1 medya klimalı eşit parçaya (2.5 Adım) eklenmesi önemli bir adım olduğunu bulmak ve hayatta kalma IPSC en pluripotent morfoloji bakım yardımcı olur. Hücre yapışması (2.2, 3.3 ve 4.3 adımları) pasaj sonra optimal değildir, buna ek olarak, sorun daha da kullanılan ayrılma sürelerine optimize ederek gerçekleştirilebilir.
Son olarak, akış sitometrisi ve diğer tekniklere göre sunulan küçük ölçekli bir metodun bir sınırlama da, pluripotensini doğrulamak için kullanıldığında, alt uygulamalar için analiz hücrelerinin sürekli yayılımı için izin olmasıdır. Bizim yöntemin faydası cos destekleyen kendine özgü tasarımı kaynaklanant-etkin ve rutin immunositokimya ile pluripotensini onaylamak için hiPSCs etkin kültür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
