Introduction
Omprogrammering menneskelige voksne somatiske celler i indusert pluripotente stamceller (iPSCs) gir en måte å få en potensielt ubegrenset tilførsel av pasientspesifikke celler for å studere sykdom 1, 2. Rekapitulere en sykdom fenotype in vitro ville gjøre det plausibelt å undersøke cellulære og molekylære mekanismer i forbindelse med sykdom, og forbedre medisiner og personlig medisin tre. I tillegg er human iPSCs (hiPSCs) tilbyr muligheten for utledning av spesifikke celletyper som kan brukes som en unik ressurs for å erstatte døde eller dysfunksjonelle celler og gjenopprette funksjonen i sammenheng med flere lidelser 4, 5.
En viktig forutsetning for å hjelp iPSCs i de ovennevnte programmene er å sikre at deres pluripotent og udifferensiert tilstand opprettholdes under ekspansjon i kultur. Vanligvis techniques slik som strømningscytometri, western blotting, polymerase kjedereaksjon og funksjonelle analyser, noe som krever store mengder celler og spesialisert utstyr, brukes for detaljert analyse av IPSC pluripotency 6, 7, 8, 9, 10. Imidlertid rutinemessig vurdering av iPSCs 'udifferensiert tilstand kan effektivt oppnås gjennom den begrensede formering av disse cellene spesifikt for immunocytokjemi (ICC), således som involverer redusert tid og ressurser.
Nylige fremskritt tillater vekst av iPSCs i definerte serumfrie betingelser, som er en betydelig forbedring i forhold til konvensjonelle dyrkingssystemer som krever murine fibroblast-feeder-lag og serumholdig medium. Men dagens litteratur ikke inkluderer klare trinnvise protokoller som beskriver hvordan overgangen iPSCs fra materlag til matefrie systemer.
I denne sammenheng foreliggende protokoll detaljer systematisk hvordan hiPSCs dyrket på bestrålte mus embryo fibroblast (iMEF) næringslag kan være (1) innrettet til å forplante seg i serumfritt medium, og (2) dyrket på en liten skala for spesifikt å støtte robust immunocytokjemisk analyse. Samlet sett representerer denne metodikken et tidsriktig og kostnadseffektiv prosedyre for å spre menneske iPSCs i serumfrie betingelser for å bekrefte deres pluripotency på rutinemessig basis ved hjelp immunocytochemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hiPSCs ble avledet fra humane dermale fibroblaster isolert fra 4 mm hud punsj biopsier og omprogrammeres i huset via Sendai virus-mediert omprogrammering 11. The University of Arizona Institutional Review Board godkjent alle prosedyrer for faget rekruttering og biopsi samling.
1. Utarbeidelse av ekstracellulær matriks belagte overflaten for IPSC Culture
- En dag før samløpet av hiPSC kulturer vokser på iMEFs, forberede ekstracellulære matrise (Matrigel) belagte plater.
- Langsom tining en alikvot av den ekstracellulære matriks (lot avhengig, følger instruksjonene på spesifikasjonen) på is i 4 ° C i 2 timer.
- I en biosikkerhet hette, ved hjelp av kaldt pipettespisser (lagret ved -20 ° C), legge til en delmengde av ekstracellulære matrise for kulde Dulbeccos Modified Eagle Medium / Nærings Blanding F-12 (DMEM / F12 / HEPES) i henhold til mye spesifikk fortynningsfaktoren .
- Tilsett ~ 60081; L av ekstracellulær matriks per brønn av hver ny cellekultur behandlet 12-brønns plate nødvendig.
- Platen inkuberes ved romtemperatur i flere timer. Her bruker en tre timers inkubasjonstid.
MERK: Plater kan brukes umiddelbart eller oppbevares ved 4 ° C i opptil to uker.
2. Overføring av hiPSCs Grown på iMEF Feeder Cells på ekstracellulær matriks for forplantning
- På dagen for aging, fjerne matrisen belagt plate fra 4 ° C og la maskinen for å akklimatisere seg til romtemperatur i 1 time i vevskultur hette.
- Aspirere mediet fra en brønn i en 6-brønns plate av hiPSC kultur vokser på iMEFs og erstatt med 500 ul kollagenase dissosiasjon reagens (1 mg / ml i basaldyrkningsmedium).
- Inkuber ved 37 ° C i ~ 10 - 30 minutter inntil kantene av IPSC koloniene ser ut til å heves litt.
MERK: Inkubasjonstid er linjeavhengig og vil variere. Overvåk dissosiasjon under et mikroskop. - Bilefully aspirate dissosiasjon reagenset og vaskes forsiktig 2 ganger med fosfatbufret saltløsning (PBS, pH 7,4).
- Tilsett 1 ml romtemperatur mTeSR1 komplett medium med 10 ng / ml Rho-assosiert protein kinase inhibitor (Y-27632 ROCK-inhibitor) til brønnen.
MERK: Ved hjelp av en 50:50 blanding av iMEF kondisjonerte medium og mTeSR1 i denne innledende avsnittet er foreslått og kan være gunstig for overlevelsen av hiPSCs under dette mediet overgangen. - Ved hjelp av en liten fasekontrastmikroskop plassert delvis inne i panseret, manuelt score og plukke 1 - 2 hiPSC kolonier (~ 700 - 1000 mikrometer i diameter) med en sprøyte og nål (25 G, 1½ in). Dytte bort de scoret biter av kolonien inn i mediet med en P200 pipette tips.
- Aspirer og kast matrisen fra den nye platen, være forsiktig med å forstyrre belegget.
- Overføre 1 ml av cellesuspensjonen fra den gamle brønnen inneholdende de scoret iPSCs inn i den nye matriks belagt godt.
- Place platen i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2. Rock the plate i flere rask, back-og-tilbake, og side-til-side bevegelser jevnt spredt ut cellene. Ikke forstyrr platen i 24 timer.
- Utføre daglige fulle medie endringer med mTeSR1 komplett medium (tillegg av Y-27632 ROCK Inhibitor er ikke nødvendig etter den første platekledning i trinn 2.5).
3. Småskala aging av hiPSCs på Matrix-belagte plater
MERK: Generelt, etter den første overføringen av hiPSCs til matrise belagte plater ble cellene skal passeres en gang til på lignende måte å sikre at alle iMEFs er eliminert, og celler som har tilpasset seg mater-frie betingelser.
- En dag før IPSC konfluens forberede fersk belagt matrix plater som omtalt i punkt 1.
- På dagen for passasjen, fjerne matrisen belagt plate fra 4 ° C inkubasjon og tillate platen å akklimatisere seg til romtemperatur i 1 time i vevet Culture hette.
- Aspirer medium fra en brønn i en seks-brønns plate av hiPSCs (opprinnelig overført fra mater til matrise) og erstatte med 500 mL celledissosiasjon buffer.
MERK: Den kommersielle celledissosiasjon buffer brukes her (se Materialer Table) er mer egnet for bruk med mTeSR1 medium sammenlignet med kollagenase. - Inkuber ved romtemperatur i 3 - 7 minutter inntil kantene av IPSC koloniene ser ut til å heves litt. Som nevnt før, er den inkubasjonstid linje avhengig og variabel. Derfor overvåke det cellulære dissosiasjon under et mikroskop for å bestemme den optimale tid.
- suge dissosiasjon buffer forsiktig og forsiktig vask 2 ganger med PBS.
- Tilsett 500 ul romtemperatur mTeSR1 komplett medium med 10 ng / ml Y-27632 ROCK inhibitor til brønnen.
- I stedet for å poeng kolonier som i trinn 2.6, skyver det ønskede antall kolonier i mediet ved hjelp av en P200 spiss og forsiktig triturer cellesuspensjonen 2 ganger against ett hjørne av brønnen for å bryte hiPSC kolonier inn i klumper av ~ 50-200 mikrometer i størrelse. For eksempel, for en 12-brønns plate, plukke 1 - 2 kolonier for å overføre inn i hver en ny brønn. Overfør cellesuspensjonen fra den gamle brønnen i en enkelt ny brønn av en 12-brønns plate.
- Rock platen i flere hurtig, tilbake-og-frem, og side-til-side-bevegelser for å jevnt spredt ut cellene og la platen hvile i 24 timer i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Utføre daglige fulle medie endringer med mTeSR1 komplett medium. Som nevnt tidligere, er det ikke nødvendig å tilsette Y-27632 ROCK Inhibitor etter den første plettering.
MERK: Ubrukte IPSC kolonier i trinn 3.7 kan være lett cryopreserved på dette punktet.
4. Utarbeidelse av Chamber lysbilder og Dekk for Seeding av hiPSCs for Immunocytochemistry
MERK: Følgende protokoll benytter 4-brønn plastkammer lysbilder og 12 mm dekkglass med appropriate volumer av media i multi-brønner for å støtte kostnadseffektiv immunocytochemistry. Imidlertid kan medievolumet økes dersom bruken av store brønn og dekkstørrelser er ønsket.
- En dag før hiPSC samløpet, forberede kammer lysbilder nylig belagt med ekstracellulære matrise som omtalt i punkt 1. Legg nok matrise løsning (~ 300 - 500 mL per brønn i en 4-brønn kammer lysbilde) for å fullt ut pelsen hver brønn uten bekymring for fordampning. Alternativt, etter å plassere en rengjøres og steriliseres dekkglass i hver brønn av en 24-brønns plate, frakk med 500 mL ekstracellulære matrise og sørg for dekkglass er ikke flytende på toppen av løsningen.
- På dagen for passasjen, fjerne belagt kammer lysbilder / Dekk fra 4 ° C og la akklimatisering til romtemperatur i 1 time i vevskultur panseret.
- Aspirer medium fra en brønn i en 12-brønns plate av hiPSCs og erstatte med 500 mL dissosiasjon buffer.
- Inkuber ved rom temperatur for ~ 3 - 7 minutter inntil kantene av IPSC koloniene ser ut til å heves litt.
- suge dissosiasjon buffer forsiktig og tilsett 1 ml romtemperatur mTeSR1 komplett medium med 10 ng / ml Y-27632 ROCK Inhibitor til brønnen.
- Ved hjelp av en liten fasekontrastmikroskop plassert inne i vevskultur panseret, manuelt plukke en koloni / ny brønn av en 4-brønn kammer lysbilde eller en ny dekk å være belagt (~ 1000 - 1500 mikrometer i diameter) med en P200 pipette tips ved å skyve den av plateoverflaten inn i mediet.
- Aspirer matrisen fra den nye kammer lysbilde / dekkglass, være forsiktig med å forstyrre belegget.
- Forsiktig triturer cellesuspensjonen 2 ganger mot en sone av brønnen for å bryte hiPSC kolonier inn i klumper av ~ 50-200 mikrometer i størrelse. Overfør 250 ul av cellesuspensjonen fra den gamle brønnen inn i hver ny brønn av en fire-kammer vel lysbilde / dekkglass.
- Bringe volumet av hver ny brønn opptil 500 mL med mTeSR1 fortseller innelukker 10 ng / ml Y-27632 ROCK Inhibitor.
- Plasser kammerlysbilde / dekk i inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Etter 24 timer, utføre daglige fulle medie endringer med mTeSR1 komplett medium. Igjen som tidligere nevnt, er tilsetningen av Y-27632 ROCK Inhibitor ikke er nødvendig etter den første plettering.
5. Utarbeidelse av iPSCs for Immunocytochemistry
- Når konfluent, bevare hiPSC kolonier via fiksering ved å fjerne media fra brønnene og legge forvarmet FORSIKTIG 4% paraformaldehyde (~ 300 mL / brønn av en 4-brønn kammer lysbilde / dekkglass). Inkuber ved romtemperatur i 20 min.
- Kast paraformaldehyde riktig i henhold til institusjonelle biohazard og kjemiske retningslinjer for sikkerhet.
- Vask cellene 3 ganger for 5 min hver på en benk-top shaker med PBS.
MERK: Celler på kammer lysbilder / dekk kan lagres med rikelig PBS ved 4 ° C på ubestemt tid på dette stadiet.Alternativt kan de bli brukt umiddelbart for ICC.
6. Farging av hiPSCs med pluripotency Markers
MERK: immunfarging hiPSCs med standard pluripotency antistoffer. Som et eksempel, her celler er dobbelt-farget med antistoffer rettet mot en en overflate og en intracellulær antigen på en trinnvis måte som følger: Anti-Stage-Specific embryonale antigen-4 (SSEA4) med anti-Octamer-bindende protein 4 (okt- 4) og anti-Tra-1-60 med anti-SRY beslektet HMG BOX gen 2 (SOX2) (se Materials Table for antistoff detaljer).
- Aspirer PBS fra brønnene og tilsett i 500 mL / brønn blokkering løsning uten Triton-X-100. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Fremstille en forhåndsbestemt konsentrasjon (her ved å bruke 1: 200) av overflate antistoffer, enten SSEA4 eller Tra-1-60, ved fortynning i blokkeringsløsning uten Triton X-100.
- For kammer lysbilder, forberede 300 mL / brønn av en 4-brønn kammer lysbildeved å blande 298,5 mL av blokkering løsning over og 1,5 mL av anti-SSEA4 eller Tra-1-60 primært antistoff.
- For Dekk, forberede 40 mL / dekkglass ved å blande 199 mL av blokkering løsning og en mL av anti-SSEA4 eller Tra-1-60 primært antistoff.
- Aspirer Blokkering Solution fra kammeret lysbildet og dispensere det primære antistoffet i passende brønner. For Dekk, plasserer et stykke Parafilm fast inne i en petriskål og dispensere 40 mL av det primære antistoffet på toppen som en dråpe. Ved hjelp av en bøyd sprøyte nål og pinsett, løft forsiktig dekkglass ut av kulturen godt og legg den celle side ned på dråpe antistoff på Parafilm. Inkuber over natten ved 4 ° C.
- Den neste morgen, vasker cellene 3 ganger, 5 - 10 minutter hver, ved å fjerne antistoffet fra kammeret lysbilde og tilsetning i PBS. For Dekk, løfte hver en av parafilm og sett den tilbake i en brønn i en 24-brønns plate, celle siden opp. Tilsett forsiktig PBS.
- Forbered passende sekundære antistoffer på 1: 500 i blokkering løsning.
- For kammer lysbilder, forberede 300 mL / brønn av en 4-brønn kammer lysbilde ved å blande 499 mL av blokkering løsning og en ul geit anti-mus IgG3 Alexa Fluor 488 (for SSEA4) eller en ul geit anti-mus IgM Alexa Fluor 488 (for Tra-1-60).
- For Dekk, forberede 40 mL / dekkglass ved å blande 499 mL av blokkering løsning og 1 mL av geit anti-mus IgG3 Alexa Fluor 488 (for SSEA4) eller en ul geit anti-mus IgM Alexa Fluor 488 (for Tra-1-60 ).
- Aspirer PBS fra kammeret lysbildet og dispensere sekundære antistoff i passende brønner. For Dekkglass, følgende trinn 6.2, invertere Dekk på antistoffløsning plasseres på parafilm ved romtemperatur i 2 timer.
MERK: Hvis du bruker fluorescerende merket sekundære antistoffer, må cellene beskyttes mot lys. Plasser kammer lysbilder og glassene i en mørk environment under inkubasjoner og vasker. - Vask cellene 3 ganger i 5 - 10 minutter hver ved å fjerne antistoffet fra kammeret lysbilde og tilsetning i PBS. For Dekkglass, løfte hver enkelt nøye fra parafilm og sett tilbake i en brønn i en 24-brønns plate, cellesiden opp. Tilsett PBS under vask.
- Før sentret for den andre antigen, OKT-4 intracellulær eller SOX2 i dette tilfellet, inkuberes på nytt i Blocking Solution laget med permeabiliseringen reagens (Triton-X-100) i 1 time ved romtemperatur.
- Å immunfarging for oktober-4 eller SOX2, bare følg metoden beskrevet i trinn 6.1-6.6 for å anvende de primære og sekundære antistoffer. Ved anvendelsen av denne protokollen, bruker oktober-4 og SOX2 ved en konsentrasjon på 1: 200 og det sekundære antistoff geit anti-kanin IgG Alexa Fluor 594 på 1: 500.
- Etter at de ovenfor nevnte primære og sekundære antistoffbehandlinger, vaskes cellene 3 ganger i 5 - 10 minutter hver med PBS og farge med 4 ', 6'-diamidino-2--phenylindole, dihydrochloride (DAPI) etter standard protokoller hvis atom visualisering er ønsket.
7. Forberedelse til visning
- For kammer lysbilder, forsiktig fjerne det øvre kammeret fra raset, etter produsentens anvisninger. Deretter skyll i destillert vann, og tilsett monteringsmedium og et dekkglass for å aktivere mikroskopi.
- For Dekk, invertere Dekk på en dråpe monteringsmedium plassert på et glass objektglass.
- Bildet under en standard eller confocal fluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen gir en trinnvis beskrivelse av hvordan menneske iPSCs kan overføres fra matersjikt for å mater frie betingelser, og deretter forplanter seg i en begrenset måte for spesifikt å aktivere kostnadseffektiv immunocytokjemi for å bekrefte pluripotency vedlikehold. Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av denne protokollen. Figur 2A viser hiPSC kolonier som vokser på iMEFs i 6-brønns plater. Disse koloniene utviser typisk morfologi med definerte grenser og tett fase lyse sentre. Som vist i figur 2B, etter tilførsel av iPSCs til mater-frie betingelser i 12-brønners plater, vises kolonimorfologi noe kaotisk med mindre utpregede kanter. I tillegg kan noen iMEFs forbli i kulturen på dette tidspunktet. Figur 2C viser at etter en ekstra passasje i materen fritt system, IPSC kolonier vise en klassisk enkeltlag morfologi med en høy kjernen til Cytoplasm forholdet. På dette stadiet er det sett at iMEFs er praktisk talt eliminert fra kulturen.
Kolonier som vokser under mater-frie forhold er mekanisk plukket og sådd ut på små multi-brønn kammer lysbilder eller dekkglass, og undersøkt for spesifikke pluripotency antigener via immunocytochemistry. Figur 3 viser representative kolonier som er immunopositive for SSEA4 eller Tra-1-60 (3B, 3F, overflate pluripotency antigener) og oktober-4 eller Sox2 (3 A, 3E, intracellulære pluripotency antigener).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av protokollen. Samlet skjema av den beskrevne metoden som brukes til overgangen menneskelige iPSCs fra iMEF matere til mater-fri kultur og påfølgende undersøkelser av celler med pluripotency markører. iMEF: Irradia ted Mouse Embryonic fibroblast; IPSC: Induced pluripotent stamcelle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative Bilder av IPSC Colonies overgangen fra iMEF matere til mater-frie kultur betingelser. A) Tett IPSC koloni (hvit pil) dyrket på iMEF mater celler (svart pil). B) Etter den første passasje på en matrise-belagte 12-brønns plate i serumfritt medium, et par iMEFs kan fremdeles observeres i kultur (sort pil). C) Typisk morfologi av et monolag IPSC koloni vokst mater-free. Ingen iMEFs forbli i kulturen på dette stadiet. Scale Bar (AC) = 100 mikrometer.> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. immunocytokjemisk Karakterisering av menneskelige iPSCs belagt i Small brønners plater. Representative immunofluorescence bilder av iPSCs oppnådd via en konfokal mikroskop, viser positivt uttrykk for pluripotency markører A) oktober-4 (rød) og B) SSEA4 (grønn) med C) kjernefysiske flekken DAPI (blå) og E) Sox2 ( rød) og F) Tra-1-60 (grønn) med G) DAPI (blå). D og H vise overlegg bilder knyttet til AC og EG. Scale bar (AH) = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| hiPSC Media for vedlikehold på Feeders | ||
| Komponent | Stock Konsentrasjon | endelig Konsentrasjon |
| DMEM-F12 / HEPES | 100% | 80% |
| Knockout Serum Replacement | 100% | 20% |
| L-glutamin | 200 mm | 1 mm |
| MEM-NEAA | 10 mm | 0,1 mm |
| 2-merkaptoetanol | 55 mm | 0,1 mm |
| Rekombinant human FGF-Basic | 10 ug / mL | 10 ng / ml |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | 10 mikrometer | |
| Matrigel belegg for Feeder-Free kulturer | ||
| Komponent | ||
| Matrigel hESC kvalifiserte Matrix | Fortynningsfaktoren 269 mL | |
| DMEM-F12 / HEPES | 25 mL | |
| Merk: Fortynningsfaktor er mye avhengig og må fastslås fra analysesertifikat | ||
| mTeSR1 komplett medie for Feeder-Free kulturer | ||
| Komponent | Beløp | |
| mTeSR1 Basal Medium | 400 mL | |
| mTeSR1 5x Supplement | 100 mL | |
| Merk: Når blandet, kan mTeSR1 komplett media fryses i porsjoner og brukes til komponent utløpsdato | ||
| Merk: mTeSR1 komplett media må varmes i romtemperatur bare. Ikke plasser i vannbad | ||
Tabell 1: IPSC Kultur Media Oppskrifter og Plate Coatings.
| 4% Paraformaldehyde fiksativ | |
| Komponent | Beløp |
| 0,1 M PO 4 Buffer | 2 L |
| Paraformaldehyde, pille | 80 g |
| ICC blokkeringsløsning uten Triton-X-100 | |
| Komponent | Beløp |
| 1x Fosfatbufret Saline | 49 mL |
| Normalt geiteserum | 1 ml |
| Bovine Serum Albumin | 0,5 g |
| ICC blokkeringsløsning med Triton-X-100 | |
| Komponent | Beløp |
| 1x Fosfatbufret Saline | 49 mL |
| Normalt geiteserum | 1 ml |
| Bovine Serum Albumin | 0,5 g |
| Triton-X-100 | 200 mL |
Tabell 2: Fixative og immunocytochemistry oppskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den systema protokollen presenteres her gir en tidsbesparende og kostnadseffektiv metode, i form av en nedskalert kultur teknikk, spesielt utviklet for å støtte effektiv pluripotency analyse via immunocytochemistry.
De viktigste fordelene med den beskrevne metoden er som følger. Tradisjonelt har mer enn 3 til 4 passeringer for å gå over fra iPSCs næringslag for å mater-frie dyrkningsbetingelser for å eliminere rest iMEFs igjen etter bruk av bulk dissosiasjon teknikker og typisk for monolag morfologi skal vises 12, 13. I motsetning til fremgangsmåten som presenteres her innebærer en kortere tidslinjen, noe som gjør det mulig for den relativt rask overføring av iPSCs til serumfrie betingelser til ved manuell plukking av IPSC kolonier. De iPSCs er dyrket i begrensede mengder i små kammer lysbilder eller dekk bidrar for immunocytochemistry. Faktisk volumeg av kulturmedium er nødvendig per brønn er bare 0,5 ml, og volumet av fortynnet antistoffløsning som kreves for en enkelt dekkglass er som nominell som 40 pl eller 300 pl pr kammer brønn, ved bruk av denne protokollen.
Vi finner at tillegg av like deler iMEF kondisjonert medium til mTeSR1 under den første passering (trinn 2.5) er et viktig skritt som hjelpemidler i overlevelse og vedlikehold av IPSC er pluripotent morfologi. I tillegg, hvis cellene skulle vedhefte er ikke optimal når aging (trinnene 2,2, 3,3 og 4,3), feilsøking kan utføres ved ytterligere å optimalisere dissosiasjon tider brukt.
Til slutt, en begrensning av den presenterte små-skala-metoden, sammenlignet med andre teknikker slik som strømningscytometri også brukes til å verifisere pluripotency, er at den ikke tillater for den fortsatte formering av celler ble analysert for nedstrøms applikasjoner. Nytten av vår metode oppstår fra dens spesifikke utforming som understøtter de cost-effektiv kulturen i hiPSCs for å bekrefte pluripotency via rutine immunocytochemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
