Summary
tests de comportement est la norme d'or pour la détermination des résultats suite à une lésion du cerveau, et peut identifier la présence de troubles du développement chez les nourrissons et les enfants. réflexes sont un indicateur du développement neurologique précoce de ces anomalies. Une foule de tests de réflexes de développement facilement accompli chez les rongeurs du nouveau-né ont été mis au point et décrit ici.
Abstract
test réflexe neurodéveloppemental est couramment utilisé dans la pratique clinique pour évaluer la maturation du système nerveux. réflexes neuro-développementaux sont aussi appelés réflexes primitifs. Ils sont sensibles et compatibles avec les résultats ultérieurs. réflexes anormaux sont décrits comme une absence, la persistance, la réapparition ou la latence des réflexes qui sont des indices prédictifs des nourrissons qui sont à risque élevé de troubles du développement neurologique. Les modèles animaux de handicaps du développement neurologique, comme la paralysie cérébrale, présentent souvent des réflexes de développement aberrantes, comme on observerait chez les nourrissons humains. Les techniques décrites évaluer une variété de réflexes neurodéveloppementaux chez les rats nouveau-nés. test de réflexe neurodéveloppemental offre l'enquêteur une méthode d'essai qui ne sont pas autrement disponibles dans ces jeunes animaux. La méthodologie présentée ici vise à aider les enquêteurs à examiner les étapes du développement chez les rats nouveau-nés comme une méthode de détection précoce brain blessures et / ou déterminer l'efficacité des interventions thérapeutiques. La méthodologie présentée ici vise à fournir des lignes directrices générales pour les enquêteurs.
Introduction
réflexes du développement neurologique, ou les étapes du développement, sont l'une des premières évaluations sur les nouveau-nés humains utilisés et les nourrissons. réflexes neurologiques sont des mouvements involontaires et répétitifs qui démontrent le tronc cérébral et des réflexes de la moelle épinière. Maturation des réseaux corticaux caractérisés par l'évolution plus la migration, la myélinisation et synaptogenèse promouvoir le contrôle volontaire et l'inhibition corticale. Les modifications de la progression normale de l'évolution du système nerveux central peuvent perturber le développement du cerveau, ce qui entraîne dans le câblage cortical anormal, le fonctionnement et la myélinisation, ce qui provoque des retards réflexes neurodéveloppementaux ou absences. nourrissons humains à haut risque d'invalidité neurologique présentent souvent des réflexes anormaux précoces. réflexes anormaux peuvent présenter un retard dans l'acquisition, l'absence, la présence prolongée, ou réapparition tard dans la vie, et sont prédictifs des troubles du développement. 1, 2 Par conséquent, Il est important d'imiter les retards réflexes dans des modèles expérimentaux de handicap neurodéveloppementaux.
Les rongeurs sont couramment utilisés comme modèles expérimentaux. Les bébés rats sont nidicoles à la naissance, et donc trop immature pour entreprendre moteur spécifique ou complexe, des tâches comportementales sensorielles et / ou cognitives. À cet égard, leur immaturité concerne à la fois leur développement physique et organes. Les rats sont nés sans poils avec une incapacité à thermorégulation, sont aveugles, et incapable de marcher. En ce qui concerne le développement du cerveau, la maturation corticale importante se produit après la naissance. ratons nouveau-nés (jour de naissance appelés jour après la naissance 1; PD1) ont été proposées pour atteindre un niveau de maturation du cerveau qui est semblable à un cerveau humain prématuré de 23 - 28 semaines de gestation, alors que PD7-10 chiots sont équivalentes à NEAR terme cerveau humain. 3, 4, 5, 6Cette corrélation est basée sur des analyses anatomiques brutes, cependant, d'autres mesures de maturation du cerveau telles que la myélinisation et l'amplitude électroencéphalogrammes intégrée ont également été décrits. 5, 7 Par exemple, pré-oligodendrocytes sont les cellules prédominantes dans le développement du cerveau du fœtus humain de 23 - 32 semaines in utero, et ce stade maturational correspond à un rongeur PD1-3. 5, 8, 9, 10 De plus, la myélinisation commence in utero chez l' homme alors que chez les ratons , il apparaît dans le cerveau antérieur autour PD7-10; le cerveau des rongeurs nouveau-né reste largement un myélinisé. 11, 12 Tucker et al. ont trouvé que le motif d'électroencéphalogramme intégré d'amplitude d'un rat P1 pour être similaire à une gesta 23 semainestion foetus humain, alors qu'un chiot PD7 et DP10 est semblable à un 30-32 semaine et enfant à terme, respectivement. 7 Pour ces raisons, le test réflexe du nouveau - né chez les chiots de rat nouveau - né est l'occasion pour capturer l'ontogenèse et / ou de perturbation du développement du cerveau.
La batterie de réflexes décrits ci - dessous sont adaptés à partir d' études de WM Fox et R. Lubics 13, 14 WM Fox a été l' un des premiers chercheurs par rapport à l'ontogenèse des réflexes chez la souris. 13 Ces réflexes comprennent, mais sans s'y limiter, la saisie des membres et mise en place, l' évitement de la falaise, le redressement, le redressement accéléré, la démarche, auditive tressaillement, la posture et l' ouverture des yeux. Les deux prise de membres antérieurs et postérieurs (dénommé palmaire et plantaire prise chez l'homme, respectivement) sont facilitées par les réflexes spinaux et inhibition cortico des zones de moteur non primaires. 15, 16 placement des membres postérieurs (réflexe plantaire) reflète la maturation du tractus cortico - spinal. 16, 17, 18 évitement Cliff (réponses de protection), de redressement (labyrinthe) et de redressement accéléré implique l' intégration et la communication entre l' entrée sensorielle et la sortie moteur (tels que ceux qui participent à la vibrisses et les systèmes vestibulaires). 19, 20, 21 Gait reflète la locomotion. 14 stimuli auditifs évalue la stimulation acoustique et des connexions synaptiques des neurones géants dans le noyau réticulaire pontis caudalis. 21 Posture comporte des projections corticales-spinal appropriés / spinaux-corticales, la force musculaire, et innervation neuromusculaire. 22, 23 Maturation des récepteurs de l' acide gamma - aminobutyrique peut en corrélation avec l' ouverture de l' oeil. 24 Il est important de garder à l' esprit que les réflexes reflètent un réseau beaucoup plus complexe et fourni ici est une corrélation générale. De plus, ces réflexes fournissent une méthode rapide et facile d'évaluer le développement neurologique très jeunes où les tests de comportement plus complexe est impossible.
L'objectif de ce document est de fournir une ligne directrice générale pour les tests de réflexe neurodéveloppement qui peut être facilement intégré dans les études de rats nouveau-nés expérimentaux. La méthodologie décrite a été réalisée chez les ratons néonatale Long-Evans et la quantification des résultats a été fondée le premier jour d'apparition. Le jour où le test réflexe est initié et l'équipement utilisé peut être modifié pour l'adapter à un modèle expérimental différent (par exemple pour différentes souches et espèces). En établissant la progression physiologique normal de refmaturation dans un modèle lex animal spécifique, les chercheurs peuvent évaluer les effets des facteurs de stress externes, manipulations endogènes et / ou interventions thérapeutiques sur le développement neurologique dans les modèles de rats nouveau-nés. Dans l'ensemble, l'utilisation des réflexes comme la détermination de la maturité du cerveau est avantageuse pour prédire une lésion cérébrale périnatale, et reflète des résultats neurodéveloppementaux plus tard.
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Protocol
La protection des animaux et le Comité d'utilisation, sciences de la santé à l'Université de l'Alberta a approuvé toutes les études animales.
Remarque: Bien que ce protocole peut être adapté à d'autres espèces et souches, ce protocole est écrit pour les rats Long-Evans. Ces rats ont été démontré que les performances motrices supérieures et l'acuité visuelle par rapport à d'autres souches de rongeurs. 25, 26 Le protocole pour les grossesses chronométrés, les suppléments alimentaires, de l' inflammation, de la mère et des réflexes neuro - développementaux est le suivant.
1. Les animaux expérimentaux
- Lorsque les rats arrivent à l'installation de logement des animaux, s'abstenir de toute interaction pour un jour ou deux pour leur permettre de s'acclimater à leur nouvel environnement. À la suite de l'acclimatation, les rats gérer tous les jours pendant environ cinq jours, ou lorsque les rats ne sont plus à montrer des signes de stress. induite par le stress humain peut modifier les résultats des tests et leannonce à la perte de la grossesse.
- Une fois que les rats sont confortables, la reproduction commence. Placez deux femelles et un rat mâle dans une cage d'élevage à deux étages (h = 38 cm, 1800 cm 2 au sol) pendant une nuit (15 heures - 8 AM). Ces cages empêchent le stress et la surpopulation. Le matin, à l'aide d'une pipette de transfert, rincer le vagin des rats femelles avec environ 0,25 ml de solution saline. Transférer la solution dans un tube à centrifuger.
- Placez les deux femelles et mâles dans leurs cages conventionnelles respectives.
- Voir la solution recueillie dans la section 1.2 au microscope optique (100X) pour déterminer à quel stade du cycle oestral du rat connaît et si oui ou non le sperme sont présents. S'il y a des spermatozoïdes, enregistrez la date comme le jour embryonnaire (E1) (figure 1). Si vous êtes enceinte, la femelle donne sa propre cage sur E14.
NOTE: Les cellules du frottis vaginal sont claires, utilisez donc un faible réglage de la lumière. Assurez-vous que le condenseur est réglé à son plus bas. Un dseulement le contrôle de la luminosité pour atténuer la lumière. Si un réglage de la luminosité est disponible, réglez-le sur 1.
2. Dietary Supplémentation
NOTE: Ce protocole vise à évaluer les effets thérapeutiques de la consommation de germes de brocoli alimentaire au cours de la dernière semaine de la grossesse. Développer les germes selon Wu et al. 27.
- Faire tremper les graines germées de brocoli pour 2 - 3 h. Etaler les semences sur une boîte germoir de graines de comptoir et mettre sur une surface chaude pour la germination.
- Arrosez les graines deux fois par jour, une fois le matin (8 - 9 h) et une fois le PM (3 - 4 h).
- Le cinquième jour, placez les choux par une fenêtre pour la journée (les germes doivent avoir deux feuilles chacun et deviendront vert au cours de la journée).
- A la fin de la journée, la récolte des pousses en tirant doucement sur les pousses de brocoli hors de la boîte tamisée et poser sur une surface plane pour sécher.
- Une fois que les pousses sont complètement séchées, weigh à 200 mg et le placer dans un sac en plastique scellé.
- A partir du E14, nourrir chaque rat enceinte 200 mg de germes de brocoli séchées par jour jusqu'à PD21 (les chiots sont sevrés du jour).
3. L'inflammation
- Pour induire une inflammation et de se reproduire lésions de la substance blanche chez la progéniture, injecter des rats enceintes avec lipopolysaccharide (LPS) toutes les 12 h sur E19 et E20. Le jour de l'injection, mettre la cage dans le laboratoire de l'installation de logement. Laisser le rat enceinte à acclimater et se calment pendant au moins 1 h. Si un rat montre des signes cliniques de dommages permanents systémique ou rénale, il sera euthanasié immédiatement et retiré de l'étude.
- Peser le barrage enceinte.
- Dissoudre 200 ug / kg de LPS (serotype 0127: B8) dans 100 ul de solution saline. Aspirer la solution dans une seringue de 1 ml équipée d'une aiguille de 30 G ½.
- Utiliser pour chaque injection d'une aiguille neuve. Laisser la solution se réchauffer pendant quelques minutes pour minimiser l'inconfort.
- Notez le temps et l'injection intrapéritonéale barrage enceinte. injections alternées entre les côtés pour assurer une distribution égale.
NOTE: Machholz et al. décrit les procédures de retenue et d'injection appropriées. 28
4. Tests réflexes du développement
- Le PD1 (jour de naissance), enlever les chiots du barrage et d'enregistrer le poids de naissance. Placez les chiots dans leurs cages respectives et de les déplacer à l'animalerie jusqu'à PD3. Ceci assure la liaison entre la mère et mère chiot.
- Enregistrez le test réflexe pour une évaluation fiable. Régler la caméra vidéo de sorte qu'il est à la vitesse maximum de l'obturateur de trame par trame analyses (1/1000 s). Placez la caméra vidéo afin qu'il soit directement au-dessus ou à côté du chiot de rat et tous les matériaux utilisés pour chaque réflexe. Par exemple, pour placer des pattes arrière, placez l'appareil à côté du chiot de rat pour assurer la levée et le placement des membres postérieurs est capturé.
- Pour redressement accéléré, placez l'appareil au-dessus du chiot de rat et aire d'atterrissage afin d'enregistrer la capacité du chiot à droite en plein vol.
- poids record tous les jours jusqu'à la fin de l'expérience. Sur PD3, commencer à tester réflexe neurodéveloppemental (Figure 4). Déplacer des cages dans une pièce calme pour un minimum de 1 h avant l'essai pour permettre l'acclimatation à l'environnement.
- Effectuer des tests de réflexe neurodéveloppemental à la fois cohérente chaque jour que les rats sont des animaux nocturnes. Par exemple, le test entre 9 heures-12 heures par jour. Garder les chiots directement sous une lampe chauffante ou sur un coussin chauffant à tout moment, afin de maintenir une température corporelle stable de 36,5 ° C; chiots rats de cet âge perdent facilement la chaleur. Mesurer avec une sonde de température rectale. Si cela est fait efficacement, chiots température du corps ne changent pas parce qu'ils ne sont pas retirés du barrage et litière assez longtemps. REMARQUE: Surveillez la température de la lampe de chaleur pour assurer qu'elle ne dépasse pas 37 ° C.
- forelimb saisissant
- À partir du PD3, effectuer le test de réflexe de préhension des membres antérieurs. Placer une tige émoussé contre la paume de chaque patte avant et appliquer une légère pression manuelle. La pression de la lumière devrait déplacer légèrement la patte pour assurer que le contact est réalisé et les chiots peut sentir la tige. Grasping apparaît comme la flexion des chiffres autour de la tige. acquisition réussie de ce réflexe se produit lorsque les deux pattes saisissent la tige pendant deux jours dans une rangée.
- Score à la portée des membres antérieurs:
0 pour sans agripper
1 pour la saisie de succès par une patte avant (gauche ou rforepaw ight peut être spécifiée ici)
2 pour les deux succès saisie forepaws
- saisissant membres postérieurs
- À partir du PD3, effectuer le test de réflexe de préhension des membres postérieurs. Placer une tige émoussé contre la semelle de chaque patte arrière et appliquer une légère pression manuelle. La pression de la lumière devrait déplacer légèrement la patte arrière pour assurer que le contact est réalisé et les chiots peut sentir la tige. Le succès de la saisie tige apparaît comme la flexion des chiffres autour de la tige. acquisition réussie de ce réflexe se produit lorsque les deux pattes arrière saisissent la tige pendant deux jours dans une rangée.
- Score à la portée des membres postérieurs:
0 pour sans agripper
1 pour saisir avec succès par une patte arrière (gauche ou droite patte arrière peut être spécifié ici)
2 pour les deux succès saisie pattes arrières
- redresser
- À partir du PD3, commencer le test de réflexe de redressement. Tenez fermement le chiot dans une position couchée, avec les quatre pattes en position verticale. Lâchez of le chiot et démarrer immédiatement la minuterie. Redressement est obtenu lorsque le chiot est capable de basculer / rouler sur les quatre pattes, et chaque patte est perpendiculaire au corps. Donner à chaque chiot un maximum de 15 s pour atteindre cet objectif.
- Score du redressement:
0 pour couché sur le dos (ou 15 s pour le temps alloué au maximum)
1 pour couché sur le côté (gauche ou côté droit peut être spécifié ici) ou la capacité du chiot à droite, mais dans la mauvaise posture (ou 15 s pour le temps alloué au maximum)
2 pour redresser la posture appropriée et réussie
- Placer des membres postérieurs
- À partir du PD4, commencer le test de réflexe de placer des membres postérieurs. Tenir le chiot verticalement dans l'air, par le torse. Doucement course la face dorsale de la patte arrière avec une surface émoussée (par exemple le bord d'une table). Un réflexe correct de mise en place est alors le chiot de rat retire sa patte arrière stimulée, suivie par le placement de la patte arrière vers le bas sur cette surface.
- Score de la pl patte arrièreréflexe acing:
0 pour aucun succès
1 pour placer une patte arrière (gauche ou droite patte arrière peut être spécifié ici)
2 pour placer la patte arrière réussie pour les deux pattes arrières
- Prévention Cliff
- À partir du PD4, commencer les essais d'évitement de la falaise. Placez le chiot de rat au niveau du bord d'une surface plane, de telle sorte que les pattes et le museau du chiot sont sur le bord. Le résultat correct est une réponse protectrice, où le raton se détourne du bord de la falaise. la main ou un atterrissage en mousse de l'expérimentateur est placé sous la falaise pour attraper le chiot de la chute.
- Note d'éviter la falaise:
0 pour aucun mouvement ou tomber du bord
1 pour les tentatives de se déplacer loin de la falaise, mais avec des membres suspendus
2 pour le mouvement réussi loin de la falaise
- Démarche
- Commencez l'évaluation de la démarche sur PD6. La place des chiots dans le centre d'un 15 cm Diameter cercle et laisser le chiot 30 s pour compléter la tâche. 14 Une démarche réussie est effectuée lorsque le chiot de rat est en mesure de déplacer les deux pattes avant à l' extérieur du cercle en moins de 30 s.
- Score de la démarche que le temps en secondes, il prend le chiot de rat pour se déplacer en dehors du cercle. Notez le temps qu'il faut déplacer le chiot à deux pattes avant en dehors du cercle. Fiche 30 s si le chiot est incapable de terminer la tâche dans le temps imparti
- auditif Startle
- Commencez l'analyse des stimuli auditifs sur DP10. Présenter un grand bruit (cloche) directement sur le chiot pour évaluer si oui ou non une réponse est présente tressaillement. Une réponse de sursaut positif est observé lorsque le chiot affiche un mouvement « secousses », loin du son.
- Score du sursaut auditif:
(Ou non) sans aucune réaction de sursaut
(Ou oui) pour une réponse de tressaillement positif
- Posture
- Commencez l'analyse de la posture sur PD12. Placez les chiots sur une surface ouverte non glissante, et observer la posture que le chiot a lors du déplacement. Une posture immature est réfléchi en faisant glisser de l'abdomen lors du déplacement, et le pointage perpendiculaire des deux pattes avant et les pattes arrière par rapport au corps. Une posture est acquise à maturité lorsque le chiot peut soulever l'abdomen de la surface et les deux pattes avant et les pattes arrière sont pointues droites, ou parallèle au corps, lors du déplacement.
- Score de la posture:
0 pour aucun mouvement
1 pour la posture lors du déplacement immature
2 pour la posture matures tout en se déplaçant
- Ouverture des yeux
- Commencez l'analyse des yeux d'ouverture sur PD12. Enregistrez le jour les deux paupières ouvertes:
0 pour pas les yeux visibles
1 pour un oeil visible (à gauche ou à droite peut être spécifiée ici)
2 pour deux yeux visibles
- Commencez l'analyse des yeux d'ouverture sur PD12. Enregistrez le jour les deux paupières ouvertes:
- Redressement accéléré
- À partir du PD14, commencer à tester le redressement accéléré. Placez le chiot dans une position couchée 30,48 centimeters-dessus d'un palier de mousse. Laissez tomber le chiot et observer sa capacité à se redresser. Redressable réfère au moment où le chiot est en mesure de retourner à la position couchée et atterrir sur ses pattes.
- Score du redressement accéléré:
0 pour tomber sur le dos
1 pour tomber sur le côté (gauche ou côté droit peut être spécifié ici)
2 pour l'atterrissage sur ses pattes
Remarque: Les différents types de quantification des réflexes sont disponibles en fonction de la question des enquêteurs. Quantification des réflexes peut être fait que l'observation initiale d'un réflexe, premier jour d'apparition jusqu'à la disparition du réflexe, le temps qu'il faut pour réaliser avec succès la tâche, la rapidité d'exécution, et / ou l'amélioration de la performance au fil du temps. 13, 14, 29, 30, 31 Pour le cétude dusyst, le premier jour de la comparution a été utilisé comme score. Lors de l' utilisation des modèles multipares, chiots de la même portée se comportent généralement de la même en raison de leur constitution génétique, in utero et l' environnement post - partum, et la disponibilité alimentaire. 32 Par conséquent, un chiot unique ne peut pas être représenté comme n = 1 en raison d' un biais de litière. Les chiots examinés dans une litière peuvent être calculées de telle façon que chaque portée représente un groupe n = 1. 32, 33 Alternativement, plusieurs chiots peuvent être analysés dans la même portée en utilisant le modèle d'effets mixtes, qui prend en compte les petits au sein de la même portée. 32, 33
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Representative Results
La chronologie de cette conception expérimentale est présentée à la figure 2. 30 Les méthodes et les résultats ont déjà été publiés. 30 L'objectif de l'étude était d'évaluer si la supplémentation alimentaire avec des germes de brocoli pendant la gestation et la période pré - sevrage protégé la progéniture de retard neurodéveloppemental induite par l'exposition in utero au LPS. rates gravides ont reçu chronométrées des injections intraperitoneales de solution saline (contrôle, 100 ul) ou du LPS (200 pg / kg dilués dans 100 ul de solution saline stérile) sur E19 et E20 toutes les 12 h. barrages enceintes choisies au hasard ont également reçu une supplémentation alimentaire de pousses de brocoli déshydratés (200 mg / jour) à partir de E14 à PD21. LPS a été utilisé pour imiter l'inflammation maternelle et pousses de brocoli ont été donnés comme une intervention thérapeutique potentielle pour protéger la progéniture. Sont nés naturellement Pups sur E23 (
Poids à la naissance
Analyse des poids à la naissance a révélé un effet principal du traitement (F (1,23) = 18,5, 0,0003), l' alimentation (F (1,23) = 6,5, p = 0,02), et un effet d'interaction (F (1,23) = 7,4, p = 0,01). LPS, comme le reflet de l'inflammation de la mère, ont donné lieu à des chiots (5,1 ± 0,2 g) nés de manière significative plus petite par rapport aux chiots une solution saline (6,3 ± 0,2 g, p de Tukey <0,001), une solution saline + Brocoli Choux petits (6,2 ± 0,2 g, p de Tukey <0,001) et de LPS + brocoli petits choux (6.0 ± 0,1 g, p de Tukey <0,01). Les poids de naissance des LPS + pousses de brocoli chiots ne sont pas différents des témoins, ce qui suggère que les graines germées de brocoli épargnées les chiots de LPS d'être un retard de croissance.
Neurodéveloppemental des réflexes
réflexe d'agrippement
Aucun effet du traitement ou de l'alimentation ont été observés pour les deux et forelimb saisie des membres postérieurs. Tous les chiots ont pu effectuer ces tâches.
Placement des membres postérieurs
Un effet principal du traitement (F (1,23) = 6,8, p = 0,02) a été détecté pour placer des membres postérieurs. Par rapport à une solution saline (4,3 ± 0,1 jours, p de Tukey <0,05) et de solution saline + Brocoli Choux (4,3 ± 0,0 jours, p de Tukey <0,05), les chiots de LPS ont été sensiblement retardées (5,1 ± 0,3journées). Bien que les performances de LPS + Brocoli Choux chiots ne diffère pas de chiots LPS, ils ne diffèrent des contrôles, ce qui suggère une amélioration de cette tâche réflexe de ces chiots recevant LPS et aucun traitement.
Prévention Cliff
Un effet principal du traitement (F (1,25) = 6,0, p = 0,02) après analyse d'évitement falaise a été détectée. chiots LPS (5,8 ± 0,4 jours) ont été considérablement compromis pour obtenir ce réflexe par rapport à une solution saline (4,4 ± 0,2 jours p Tukey <0,05). LPS + Brocoli Choux chiots ne se comportent différemment de l'un des groupes, ce qui suggère une amélioration des performances.
Démarche
Un effet significatif du traitement (F (1,24) = 15,1, p = 0,0007), l' alimentation (F (1,24) = 6,3, p = 0,02), et une interune action entre le traitement et l' alimentation (F (1,24) = 9,5, p = 0,005) a été trouvé analyse démarche suivante. Une acquisition retardée de la démarche a été détectée chez les petits LPS (9,7 ± 0,4 jours) par rapport à Saline (7,5 ± 0,3 jours, p Tukey <0,001), une solution saline + brocoli Choux (7,7 ± 0,3 jours, Tukey de p <0,001), et LPS + brocoli Choux petits (7,9 ± 0,2 jours, p de Tukey <0,01).
auditif Startle
Aucune différence n'a été observée.
redresser
Un effet du sexe a été détectée (F (1,43) = 16,3, p = 0,0002) pour redresser, par conséquent, mâle et femelle chiots ont été examinés séparément. Aucune différence n'a été détectée chez les hommes. Chez les femmes, un effet principal de l' alimentation (F (1,21) = 11,8, p = 0,002) et un effet d'interaction (F (1,21) = 15,6,p = 0,0007) a été trouvé. LPS + Brocoli Choux chiots (4,9 ± 0,4 jours) ont pu droit antérieur par rapport aux chiots LPS (6,7 ± 0,6 jours, p <0,05 Tukey).
Redressement accéléré
Le test accéléré de redressement a révélé un effet principal significatif du traitement (F (1,25) = 4,51, p = 0,04). LPS (17,4 ± 0,6 jours) et LPS + brocoli petits choux (16,9 ± 0,2 jours) ont été retardés en exécution de redressement accéléré par rapport à une solution saline (16,0 ± 0,4 jours) et de solution saline + Brocoli Choux (16,4 ± 0,5 jours).
Posture
Un effet d'interaction significatif du traitement et de l' alimentation (F (1,24) = 5,8, p = 0,02) a été détectée suite à l' analyse de la posture. LPS + Brocoli Choux chiots (14,9 ± 0,4 jours) avaient une posture mûre plus tôt que LPS (17,0 ± 0,4 jours p Tukey <0,05).
Ouverture des yeux
Un effet significatif principal de l' alimentation (F (1,23) = 4,71, p = 0,04) a été observée en ce qui concerne l' ouverture des yeux. Les deux Saline + BRSP (15,9 ± 0,1 jours) et LPS + Brocoli Choux chiots (15,4 ± 0,2 jours) ont atteint ce réflexe antérieure à une solution saline (16,0 ± 0,2 jours) et les petits LPS (16,0 ± 0,1 jours).
Dans l'ensemble, la consommation de germes de brocoli en fin de gestation et la période a pu avant le sevrage protéger contre des retards de développement induite par le LPS dans plusieurs des réflexes étudiés. S'il vous plaît se référer à l'article référencé pour plus de détails. 30
Figure 1. PoSitive vaginale Frottis. Un exemple d'un frottis vaginal imagé avec un objectif 10X sur un microscope optique. Cette diapositive représente un coulisseau positif indiqué par la présence de spermatozoïdes (flèche). Lors de la réalisation d'un frottis vaginal, le cycle oestral du rat peut être évaluée comme étant soit proestrus, oestrus, metestrus ou diestrus. Cela aide dans le calendrier avec précision la reproduction pour un taux de réussite de grossesse plus élevé.
Figure 2. Conception expérimentale Timeline. Le calendrier expérimental pour évaluer la progéniture nés de mères reçu des injections intrapéritonéale de LPS. supplémentation alimentaire avec des germes de brocoli commence à PD21 E14. Les barrages sont injectés sur E19 et E20 toutes les 12 h (désigné par les flèches jaunes). poids maternels sont enregistrées avec une échelle de poids et la température du corps avec une sonde de température rectale recouverte de lubrifiant. Chiots sont nés naturally sur E23 (désigné par une flèche noire). À partir du PD3, chiots subissent plusieurs tests réflexes. Sur PD21, chiots subissent le test de champ ouvert pour évaluer les réponses comportementales.
Figure 3. Exemple d'un calendrier pour l' évaluation des Neurodevelopmental Réflexes. Réflexes apparaissent à différents stades de développement, ainsi, la capture de l'acquisition de ces réflexes exige que les tests commencent quelques jours avant. Cette étude a utilisé les ratons Long-Evans, mais les différences entre les souches et les espèces existent, doit donc être effectué une expérience préliminaire en utilisant ces dates comme guide général. prise forelimb, préhension des membres postérieurs et sont évalués sur redressable PD3, plaçant et éviter la falaise patte arrière sur PD4, et de la marche sur PD6. tressaillement est évalué sur Auditory ouvertures PD10, la posture et l'œil sur PD12, et a accéléré le redressement PD14.
Figure 4. Images de développement Réflexes. Images de tests effectués sur des réflexes PD3 chez les ratons Long-Evans. Forelimb portée (A), la patte arrière portée (B) et de redressement (C) commence l' examen sur PD3. Éviter Cliff (D) et l' essai plaçant la patte arrière (E) commence sur PD4. Analyse Gait (F) commence sur PD6. Appareil pour redressement accéléré est représenté (G). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Examen Paramètre | Groupes (moyenne ± SEM) | Effets principaux (valeur p) | |||||
| Taille de la portée et de poids | Saline | Saline + brocoli Choux | LPS | LPS + brocoli Choux | Traitement | Régime | Interaction |
| Taille de la portée (nombre de chiots) | 13,3 ± 1,0 | 13.1 ± 1.0 | 10.3 ± 1.5 | 11 ± 1,2 | 0,03 | 0,8 | 0,7 |
| Poids à la naissance * # d | 6,3 ± 0,2 | 6,2 ± 0,2 | 5,1 ± 0,2 | 6,0 ± 0,1 | 0,0003 | 0,02 | 0,01 |
| Poids PD7 * d | 15,0 ± 0,5 | 15,5 ± 0,4 | 11,4 ± 1,1 | 13,6 ± 0,3 | 0,0006 | 0,09 | 0,2 |
| PD21 poids ; d | 50,0 ± 1,4 | 48,7 ± 1,6 | 46,4 ± 1,2 | 48,2 ± 1,4 | 0,2 | 0,9 | 0,3 |
| Neurodevelop- Réflexes mentale | |||||||
| Forelimb un Grasp | 3,0 ± 0,0 | 3,0 ± 0,0 | 3,0 ± 0,0 | 3,0 ± 0,0 | n / a | n / a | n / a |
| Une patte arrière Grasp | 3,6 ± 0,3 | 3,5 ± 0,3 | 4,6 ± 0,6 | 3,3 ± 0,1 | 0,3 | 0,1 | 0,1 |
| * Une patte arrière Placing | 4,3 ± 0,1 | 4,3 ± 0,0 | 5,1 ± 0,3 | 4,5 ± 0,2 0,02 | 0,07 | 0,2 | |
| Prévention Cliff * a | 4,4 ± 0,2 | 4,7 ± 0,2 | 5,8 ± 0,4 | 5,0 ± 0,4 | 0,02 | 0,4 | 0,1 |
| * # Gait un | 7,5 ± 0,3 | 7,7 ± 0,3 | 9,7 ± 0,4 | 7,9 ± 0,2 | 0,0007 | 0,02 | 0,005 |
| Un Auditory startle | 11,5 ± 0,3 | 11,5 ± 0,1 | 12,0 ± 0,5 | 11,8 ± 0,2 | 0,2 | 0,8 | 0,9 |
| posture #Un | 15,6 ± 0,5 | 15,9 ± 0,6 | 17,0 ± 0,4 | 14,9 ± 0,4 | 0,8 | 0,08 | 0,02 |
| Une des ouvertures des yeux | 16,0 ± 0,2 | 15,9 ± 0,1 | 16,0 ± 0,1 | 15,4 ± 0,2 | 0,08 | 0,04 | 0,2 |
| Accélération Redresser une | 16,0 ± 0,4 | 16,4 ± 0,5 | 17,4 ± 0,6 | 16,9 ± 0,2 | 0,04 | 1 | 0,3 |
| Redresser (femelles #a) | 4,9 ± 0,5 | 5,1 ± 0,4 | 6,7 ± 0,6 | 4,6 ± 0,4 | 0,09 | 0,003 | 0,0007 |
| Redresser un (mâles) | 3,9 ± 0,2 | 4,6 ± 0,3 | 5,9 ± 1,9 | 4,2 ± 0,6 | 0,4 | 0,6 | 0,2 |
| un jour d'apparition | * Différence significative entre LPS et Saline | ||||||
| b Nombre d'activité fois a été réalisée | # Différence significative entre LPS et LPS + BRSP | ||||||
| c secondes | |||||||
| d Grams | |||||||
Tableau 1. Poids et neurodéveloppementaux Résultats réflexes. Les résultats obtenus par les enfants exposés à l'inflammation in utero et / ou supplémentation de germes de brocoli alimentaire. 30 Les poids présentés ici sont de la naissance, PD7 et PD21. Les points de temps ont été sélectionnés pour représenter un avant terme, long terme, et 1-2 ans enfant. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les analyses statistiques utilisées dans l'étude était une analyse de variance à deux voies suivie d'un test post hoc de Tukey.a = jour d'apparition, b = nombre de fois que l'activité a été réalisée, et c = le temps (s) de l'activité a été réalisée, * = différence significative entre les LPS et le contrôle, # = différence significative entre les LPS et LPS + pousses de brocoli. n = 5 - 7 portées par groupe (valeurs à partir de quatre petits, deux mâles et deux femelles, dans une litière ont été moyennées pour représenter la litière).
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Discussion
test réflexe neurodéveloppemental est une mesure prédictive du développement du cortex cérébral anormal et la maturation, qui peuvent être d'importance dans des circonstances où neuropathologie manifeste est pas évident. Au cours des essais neurodéveloppement, il est essentiel de veiller à ce que les chiots sont examinés en même temps tous les jours. Les rats sont nocturnes et, par conséquent, leur rythme circadien peuvent altérer les performances si les tests sont effectués à différents moments de la journée. 34 Le test doit être réalisé dans une pièce calme que les bruits forts peuvent ajouter du stress aux chiots. 35 Les chiots ont besoin d' un minimum de 1 h pour s'acclimater à de nouveaux environnements, puisque le transport, la manipulation humaine, et les paramètres nouveaux peuvent induire un stress chez les petits. 35 Pups doivent également être testés directement sous une lampe chauffée ou sur un coussin chauffant. Plus les chiots, moins en mesure ils sont capables de thermorégulation. 36 Pour cette raison, les chiots sont donnés 15s et 30 s pour effectuer le redressement sur PD3 et de la marche sur PD6, respectivement. 36 En outre, les petits de contrôle ne devrait pas être un retard de croissance à la naissance, le poids représente un facteur de confusion. Portées devraient également être cueillis à 8 - 10 pour fournir la nourriture égale et représentation du sexe. Une fois que les chiots sont nés, il est important de permettre à un jour pour le rat pour former une liaison avec le barrage pour prévenir la négligence de la mère.
Pups doivent être testés un jour ou deux avant le jour où ils acquièrent le réflexe afin de capturer le début d'apparition. Selon le modèle expérimental, certaines modifications peuvent être nécessaires. souriceaux nouveau-nés sont beaucoup plus petits que les rats. Par conséquent, la taille de l'équipement utilisé peut devoir être ajustée à la taille des souris nouveau-nés. Certains dépannage peut également être nécessaire. Différentes souches et les espèces peuvent avoir un timing un peu différent de l'apparition des réflexes. 13 Le calendrier détaillé dans ce rapport est spécific chiots à Long-Evans, avec des tests de nouveaux réflexes ouverts à PD3, 4, 6, 10, 12 et 14 (figure 3). L'enquêteur devra peut-être effectuer des tests réflexes sur 2 - 3 portées pour établir la progression du réflexe naturel avant le test expérimental. De plus, lors de l'exécution des analyses statistiques sur les données recueillies, l'expérimentateur doit utiliser des techniques appropriées pour prévenir le biais de la litière. Les petits de la même portée ont tendance à effectuer de façon similaire à l'autre, donc la litière représente un n = 1, pas le chiot individuel. 32, 33
Test des réflexes neurodéveloppementaux est important car il est le seul test disponible pour les rongeurs nouveau-nés, car les tests comportementaux plus complexes est impossible à ces âges. Aucune autre mesure sont disponibles dans cette première période en plus de poids et l'apparence physique. Les méthodes présentées ici ont été utilisés par plusieurs chercheurs, soutenant ainsi lautiliser des tests de réflexe neurologique, en particulier chez les jeunes rongeurs où d'autres tests de comportement ne sont pas réalisables. 13, 14, 29, 30, 31, 37, 38 Ces essais parallèles à réflexe essais effectués chez des nourrissons humains, sont prédictifs de troubles du développement neurologique comme la paralysie cérébrale, et fournissent des informations supplémentaires concernant l'ontogénie des réseaux de neurones. L'émergence de réflexes se produit pendant les périodes spécifiques pendant la période avant le sevrage, ce qui reflète la maturation du système nerveux. 39 Une limitation de ce protocole est que tous les modèles expérimentaux peuvent être soumis à des tests réflexes. Les rongeurs sont nés immatures, de sorte que leur développement post-natal offre l'avantage de capturer le début du développement des réflexes. D'autres modèles animaux telscomme l'agneau sont matures nés et développer différemment des rongeurs, de sorte que certains des tests réflexes n'est pas applicable à ce modèle. En outre, le test réflexe est pas une mesure directe d'anomalies cognitives ou comportementales, et on ne sait pas si des anomalies observées sont transitoires ou persistantes.
En plus des réflexes, des tests de comportement peuvent être effectués pour des analyses complémentaires à un âge plus avancé. Ceci est d'une importance parce que les retards réflexes aberrantes ne conduisent pas toujours à des troubles du développement neurologique. 2, 40 Les tests sont généralement administrés à partir du PD21 (le jour du sevrage) lorsque les rongeurs sont capables d'effectuer des tâches cognitives et motrices. Ces tests comprennent bot ne se limite pas au Rotarod, labyrinthe aquatique de Morris, et élevé labyrinthe plus. En bref, le test de la tige tournante est réalisée en plaçant le rongeur sur une tige rotative, et l'enregistrement de ses performances sur la tige pendant une période de temps ou jusqu'à ce que les chutes de rongeursde. Ce test évalue l'apprentissage moteur et la force, ainsi que l'intégrité des structures cérébrales telles que les noyaux gris centraux et du cervelet. 41 Le labyrinthe d'eau de Morris consiste à placer le rongeur dans une piscine d'eau blanc laiteux, et l' enregistrement du temps qu'il faut le rongeur pour trouver une plate - forme immergée. Cues peuvent être placés au-dessus de chaque quadrant de la piscine avec le même signal toujours au-dessus de la plate-forme. Cette analyse égocentriques vs formes allocentriques de l'apprentissage spatial à médiation hippocampique et de la mémoire. 42 Le test mesure elevated plus maze la peur et l' anxiété, ainsi que le comportement exploratoire inhérent. Les rongeurs sont placés au centre de quatre bras, deux fermé et ouvert deux, élevées au-dessus du sol. 43 La prévention et le comportement exploratoire ( a évalué que le temps passé dans chaque bras) des rongeurs sont enregistrés. 43 Ces tests supplémentaires examinent sensorimotrice et le fonctionnement cognitif, ce qui permet à l'enquêteur commesess si l'insulte dure à l'âge adulte, ou si elle est transitoire.
Les retards de développement sont des facteurs prédictifs et tests comportementaux supplémentaires sont nécessaires pour fournir des preuves complémentaires de la présence d'un trouble plus tard dans la vie. De plus, les réponses de contrôle doivent être optimisés avant d' expérimenter avec les différences de souches et espèces, altérations génétiques, l' administration des médicaments, etc. En dépit de ces conditions, les techniques décrites sont rapidement apprises, facilement maîtrisé, peu coûteux, et de fournir des informations importantes concernant le développement du système nerveux. Ils offrent l'occasion d'évaluer l'ontogenèse et de la maturation du système nerveux chez les chiots à un âge où ils ne sont pas capables d'effectuer des tâches comportementales matures. En outre, les bébés humains sont souvent soumis à des tests de réflexe de développement, et donc, le test de réflexe de rongeurs fournit un moyen de traductibilité. En conclusion, c'est une excellente méthode pour le dépistage préliminaire anormalle développement neurologique du nouveau-né qui peut mener à une enquête ultérieure de la cognition et le comportement.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier nos organismes de financement, qui comprennent NeuroDevNet (un des centres nationaux d'excellence), la Fondation ALVA, l'Institut de recherche santé des femmes et des enfants, et l'Université de l'Alberta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding | |||
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 12-711-9AM | Used for vaginal flushes. |
| Sterile Saline | Hospira | 7983254 | The solution used to collect cells during vaginal flushes. |
| 400 µL Microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-120 | Used to hold the saline solution. |
| Light microscope | Leica | Leica ATC 2000 | For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab. |
| Slides | Fisherbrand | 12-552-5 | The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab. |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-F | To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab. |
| Dietary Supplementation | |||
| Broccoli Sprouts seeds | Mumm's Sprouting Seeds | Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab. | |
| Countertop Seed Sprouter Box | Mumm's Sprouting Seeds | A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest. | |
| 250 mL beaker | The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used. | ||
| Maternal Inflammation | |||
| Lipoplysaccharide (LPS) | Sigma | L3129 | The endotoxin used to mimic maternal inflammation. |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 309659 | Used to inject the pregnant rat. |
| Gauge (30 G x 1/2) | BD PrecisionGlide Needle | 305106 | Use the smallest needle to avoid pain and discomfort. |
| Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP) | Hospira | Saline is used to dissolve LPS. | |
| Weights | |||
| Scale | Denver Instrument | For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab. | |
| Neurodevelopmental Reflexes | |||
| Thin blunt rod | Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping. | ||
| Round filter paper | Whatman | 1001 150 | 15 cm diameter paper used for gait analysis. |
| Timer | Fisher Scientific | 06-662-51 | For timing the time allocated to righting and gait. |
| Blunt surface | Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance. | ||
| Foam landing | For when the pups perform accelerated righting. | ||
| Video recorder | Sony | VCT-D580RM | To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1,000 fps |
| Bell | For auditory startle. | ||
| Heat lamp or pad | To maintain the body temperature of the pups underoing examination. |
References
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