Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Neuro Reflex Testning i neonatala råttungar

Published: April 24, 2017 doi: 10.3791/55261
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of Alberta

Summary

Behavioral tester är den gyllene standarden för att fastställa resultat efter hjärnskada och kan identifiera förekomst av utvecklingsstörning hos spädbarn och barn. Nerv reflexer är en tidig indikator av dessa avvikelser. En mängd enkelt genom utvecklingsreflextester i neonatal gnagare har utvecklats och beskrivs här.

Abstract

Neurodevelopmental reflextestning används ofta i klinisk praxis för att bedöma mognaden av nervsystemet. Nerv reflexer också kallas primitiva reflexer. De är känsliga och i överensstämmelse med senare utfall. Onormala reflexer beskrivs som en frånvaro, persistens, återuppträdande, eller latens av reflexer, som är prediktiva index för spädbarn som löper hög risk för nervsystemets sjukdomar. Djurmodeller av nerv funktionshinder, såsom cerebral pares, ofta uppvisar avvikande utvecklings reflexer, som skulle observeras i mänskliga spädbarn. De tekniker som beskrivs bedöma en mängd nerv reflexer i neonatala råttor. Neuropsykiatriska reflextestning ger utredaren en testmetod som inte annars finns i sådana unga djur. Metodiken som presenteras här syftar till att hjälpa utredare för att undersöka utvecklingsmässiga milstolpar i neonatala råttor som en metod för att upptäcka tidiga debut brain skada och / eller bestämma effektiviteten av terapeutiska ingrepp. Metodiken som presenteras här syftar till att ge en allmän riktlinje för utredarna.

Introduction

Nerv reflexer eller utvecklingsmässiga milstolpar, är en av de tidigaste bedömningarna används på mänskliga nyfödda och spädbarn. Neurologiska reflexer är ofrivilliga och repetitiva rörelser som visar hjärnstammen och ryggmärgen reflexer. Mognad av högre kortikala nätverk som kännetecknas av utvecklande migration, myelinering, och synaptogenes främja frivillig kontroll och kortikal inhibering. Förändringar i den normala utvecklingen av det centrala nervsystemet evolution kan störa hjärnans utveckling, vilket resulterar i onormal kortikal ledningar, funktion, och myeline, orsakar nerv reflex förseningar eller frånvaro. Spädbarn med hög risk för neuro funktionshinder visar ofta abnorma tidiga reflexer. Onormala reflexer kan presentera som en fördröjning i förvärv, frånvaro, långvarig närvaro, eller återuppträdande senare i livet, och är förutsägande för utvecklingsstörning. 1, 2 DärförÄr det viktigt att efterlikna reflex förseningar i experimentella modeller av nervsystemets funktionsnedsättningar.

Gnagare används vanligen som experimentmodeller. Råttungar är altricial när de föds, och därför alltför omogen att vidta särskilda eller komplicerade motor, sensoriska och / eller kognitiv beteende uppgifter. I detta avseende avser deras utvecklings omognad både deras fysiska och organutveckling. Råttor föds hårlösa med en oförmåga att thermoregulate är blind och oförmögen att gå. Med hänvisning till hjärnans utveckling sker betydande kortikal mognad postnatalt. Nyfödda råttungar (dag födelse kallas postnatal dag 1; PD1) har föreslagits för att nå en hjärna mognad nivå som liknar en prematur mänskliga hjärnan av 23 - 28 veckors graviditet, medan PD7-10 valpar motsvarar när- termen mänskliga hjärnan. 3, 4, 5, 6Denna korrelation är baserad på brutto anatomiska analyser, men andra mått på hjärnans mognad som myelinisering och amplitud integrerade elektroencefalogram har också beskrivits. 5, 7 Till exempel, pre-oligodendrocyter är de dominerande cellerna i utvecklings human fetal hjärna från 23 - 32 veckor i livmodern, och detta mognadsstadiet motsvarar en PD1-3 gnagare. 5, 8, 9, 10 Dessutom börjar myelinering in utero i människor medan den i råttungar den visas i framhjärnan runt PD7-10; nyfödda gnagare hjärnan är i stort sett icke-myelinerade. 11, 12 Tucker et al. fann att amplituden integrerade elektroencefalogram mönster av en P1 råtta vara liknande en 23-veckors Gestation mänskliga foster, medan en PD7 och PD10 valp är besläktad med en 30-32 vecka och term spädbarn, respektive. 7 Av dessa skäl ger nyfödd reflex tester i neonatala råttungar en möjlighet för att fånga ontogeni och / eller störningar i hjärnans utveckling.

Batteriet av reflexer som beskrivs nedan anpassas från studier av WM Fox och A. Lubics 13, 14 WM Fox var en av de tidigaste utredarna i förhållande till ontogeni av reflexer i musen. 13 Dessa reflexer inkluderar, men är inte begränsade till, lem gripande och placering, klippa undvikande, rätande, accelererad rätande, gående, auditiv skrämsel, hållning, och ögonöppning. Både forelimb och bakbens grepp (hänvisad till som palmar och plantar grepp hos människor, respektive) underlättas av spinala reflexer och kortikospinala hämning från icke-primära motoriska områden. 15, 16 bakdelen placering (plantar reflex) återspeglar mognad av corticospinal kanalen. 16, 17, 18 Cliff undvikande (skyddande svar), rätande (labyrint), och accelererad rätande involverar integration och kommunikation mellan sinnesintryck och motoreffekt (såsom de som är involverade med vibrissae och vestibulära system). 19, 20, speglar 21 Gait förflyttning. 14 Auditory startle bedömer akustisk stimulering och synaptiska anslutningar av jätte neuroner i kärnan reticularis Pontis caudalis. 21 Posture involverar lämpliga kortikala-spinal / spinal-kortikala projektioner, muskelstyrka och neuromuskulär innervation. 22, 23 Maturation av gamma-aminosmörsyra-receptorer kan korrelera med ögonöppning. 24 Det är viktigt att hålla i minnet att de reflexer speglar en mycket mer komplicerad nätverk och ges här är en allmän korrelation. Dessutom är dessa reflexer ger en snabb och enkel metod för att bedöma neurologiska utveckling på mycket unga åldrar där mer komplexa beteendetestning inte är möjlig.

Målet med detta dokument är att ge en allmän riktlinje för neuroutvecklingsreflextestning som lätt kan införlivas i experimentella neonatala råttstudier. Den metod som beskrivs genomfördes i Long-Evans neonatal råttungar och kvantifiering av resultaten baserades på första dagen i utseende. Den dag som reflex testning initieras och utrustningen som används kan modifieras för att bättre passa en annan experimentmodell (såsom för olika stammar och arter). Genom att etablera den normala fysiologiska utvecklingen av reflex mognad i ett visst djurmodell, kan utredarna utvärdera effekterna av externa stressfaktorer, endogena manipulationer, och / eller terapeutiska interventioner på neuroutvecklingssjukdomar hos neonatala råttmodeller. Sammantaget är användningen av reflexer som en bestämning av hjärnans mognad fördel i att förutsäga perinatal hjärnskada, och återspeglar senare nerv resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal Care och användning kommittén, Health Sciences vid University of Alberta godkänt alla djurstudier.

Obs! Även om detta protokoll kan anpassas till andra arter och stammar är detta protokoll skriven för lång Evans råttor. Dessa råttor har visat sig ha överlägsna motor föreställningar och synskärpa jämfört med andra stammar av gnagare. 25, 26 Protokollet för tidsinställda graviditeter, dietary supplementation, maternal inflammation och nerv reflexer är som följer.

1. Försöksdjur

  1. När råttor anländer till djurstallar anläggningen avstå från varje interaktion för en dag eller två för att tillåta dem att anpassa sig till sin nya miljö. Efter acklimatisering, hantera råttorna varje dag under cirka fem dagar, eller när råttorna inte längre visar tecken på stress. Human-inducerad stress kan förändra testresultat och leannons missfall.
  2. När råttorna är bekväma börjar avel. Placera två tikar och en hane råtta i en dubbeldäckare avel bur (h = 38 cm, 1800 cm 2 golv område) över natt (03:00 - 8 AM). Dessa burar förebygga stress och överbeläggning. På morgonen, med användning av en pipett, spola slidan av honråttor med ca 0,25 ml av saltlösning. Överför lösningen till ett mikrocentrifugrör.
  3. Placera de två honor och manliga tillbaka till sina respektive konventionella burar.
  4. Visa lösningen uppsamlas i avsnitt 1,2 under ett ljusmikroskop (100X) för att bestämma vilken skede av Östrogencykeln råttan upplever och huruvida sperma eller inte är närvarande. Om det finns spermier, registrera datum embryonala dag (E1) (Figur 1). Om du är gravid, ge den kvinnliga sin egen bur på E14.
    OBS: Cellerna i den vaginala smear är tydliga, därför använda en låg ljussättning. Se till att kondensorn justeras till den lägsta inställningen. A.dbara ljusstyrkan att dämpa ljuset. Om en ljus ratten är tillgänglig, ställa in den på en.

2. Dietary Komplettering

OBS: Detta protokoll är avsett för att bedöma de terapeutiska effekterna av dietary broccoli spira konsumtion under den sista veckan av graviditeten. Växa groddarna enligt Wu et al. 27.

  1. Blötlägg broccoligroddar frön 2 - 3 timmar. Sprid fröna på en bänkskiva frö Sprouter box och ligger på en varm yta för groning.
  2. Vattna fröna två gånger dagligen, en gång på AM (8-9 AM) och en gång i PM (3-4 PM).
  3. På dag fem, placera groddar genom ett fönster för dagen (groddar ska ha två blad vardera och kommer att bli grön över dagen).
  4. Vid slutet av dagen, skörda groddar genom att försiktigt dra broccoligroddar av det siktade lådan och lägg på en plan yta för att torka.
  5. När groddarna är fullständigt torkat, weigh ut 200 mg och placera det i en försluten plastpåse.
  6. Med början på E14, mata varje gravid råtta 200 mg torkade broccoligroddar dagligen fram PD21 (dagen pups är avvanda).

3. Inflammation

  1. För att inducera inflammation och reproducera vita substansen skada hos avkomman, injicera dräktiga råttor med lipopolysackarid (LPS) var 12 h på E19 och E20. På dagen för injektionen sätta buren i labbet från huset anläggning. Låt den gravida råttan att acklimatisera och bli lugn under minst en timme. Om en råtta visar kliniska tecken på permanent system eller njurskada, kommer den att avlivas omedelbart och tas bort från studien.
  2. Väg den gravida dammen.
  3. Lös upp 200 pg / kg av LPS (serotyp 0127: B8) i 100 mikroliter av saltlösning. Aspirera lösningen i en 1 ml spruta utrustad med en 30 G ½ nål.
    1. Använd en ny nål för varje injektion. Låt lösningen att värma upp för ett par minuter för att minimera obehaget.
    2. Registrera den tid och injicera gravida dammen intraperitonealt. Alternerande injektioner mellan sidorna för att säkerställa jämn fördelning.
      OBS: Machholz et al. beskriver korrekta förfaranden fasthållnings och injektion. 28

    4. Utvecklings Reflex Tester

    1. På PD1 (dag datum), ta bort valpar från dammen och spela födelsevikt. Placera valparna tillbaka till sina respektive burar och flytta dem till djuranläggningen tills PD3. Detta säkerställer moderns bindning mellan dammen och valp.
      1. Anteckna reflex testning för tillförlitlig bedömning. Justera videokameran så att den är vid maximal slutarhastighet för ram-för-ram analyser (1/1000 s). Placera videokameran så att det är direkt ovanför eller vid sidan av råttungar och allt material som används för varje reflex. Till exempel för bakdelen placering, placera kameran bredvid råttan valpen att säkerställa lyftning och placering av bakbenen fångas.
      2. För accelererad rätande, placera kameran ovanför råtta valp och landning pad för att registrera förmåga valpen till höger i luften.
    2. Spela in vikter dagligen fram till slutet av experimentet. På PD3, börjar neurodevelopmental reflextestning (Figur 4). Flytta burar i ett tyst rum under minst 1 h före testning för att acklimatisera sig till miljön.
    3. Utför neuroreflextestning vid en konsekvent tid varje dag som råttor är natt. Till exempel test mellan 09:00 - PM 12 dagligen. Hålla valparna direkt under en värmelampa eller på en värmedyna vid alla tillfällen, för att upprätthålla en stabil kroppstemperatur av 36,5 ° C; råttungar i denna ålder förlorar värme lätt. Mäta med en rektal temperatursond. Om det görs på ett effektivt sätt, gör valpar kroppstemperatur inte förändras eftersom de inte tas bort från dammen och strö tillräckligt länge. OBS: Övervaka temperaturen hos värmelampa för att garantera att den inte överskrider 37 ° C. Spela in poängen för varje reflex varje dag tills ett positivt svar observeras. En positiv reflex svar uppstår när valpen kan utföra en uppgift på två dagar i följd. Datumet för den första förekomsten av ett positivt svar används för kvantifiering. Inga ytterligare tester krävs efter positiv respons. Därför slutdatum för varje reflex är variabel.
  4. framben Grasping
    1. Med början på PD3, genomföra forelimb grepp reflex test. Placera en trubbig stång mot handflatan av varje framtassarna och applicera lätt tryck manuellt. Den lätt tryck bör något förskjuta framtassarna för att säkerställa att kontakten görs och valparna kan känna staven. Gripa visas som böjning av alla siffror runt stången. Framgångsrika förvärvet av denna reflex inträffar när båda framtassarna greppa staven under två dagar i rad.
    2. Betyg forelimb grepp:
      0 för ingen grip
      En för framgångsrik gripande av en framtassarna (vänster eller right tassarna kan anges här)
      2 för framgångsrik gripande av båda framtassarna
  5. bakben Grasping
    1. Med början på PD3, genomföra bakdelen grepp reflex test. Placera en trubbig stång mot sulan på varje baktass och applicera lätt tryck manuellt. Den lätt tryck bör något förskjuta baktass för att säkerställa att kontakten görs och valparna kan känna staven. Framgångsrik gripa av staven verkar som böjning av siffrorna kring stången. Framgångsrika förvärvet av denna reflex inträffar när båda baktassar greppa staven under två dagar i rad.
    2. Betyg bakbenet grepp:
      0 för ingen grip
      En för framgångsrik gripas av en baktass (vänster eller höger baktass kan anges här)
      2 för framgångsrik gripande av båda baktassar
  6. rätande
    1. Med början på PD3, börjar rätande reflex test. Stadigt hålla valpen i ryggläge, med alla fyra tassar upprätt. Släpp of valpen och omedelbart starta timern. Rätande uppnås när pup är i stånd att vända / rulla över på alla fyra tassar, och varje tass är vinkelrät mot kroppen. Ge varje valp högst 15 s för att uppnå detta mål.
    2. Betyg av rätande:
      0 för att ligga på baksidan (eller 15 s för den maximala tilldelade tiden)
      1 för att ligga på sidan (vänster eller höger sida kan anges här) eller förmåga valpen till höger men i fel arbetsställning (eller 15 s för den maximala tilldelade tiden)
      2 för framgångsrik rätande och lämplig hållning
  7. bakbensutsläppande
    1. Med början på PD4, börjar bakben placera reflex test. Håll valpen vertikalt i luften med bålen. Försiktigt stroke dorsum av baktassen med en trubbig yta (såsom kanten av ett bord). En korrekt placering reflex är när råttunge drar tillbaka den stimulerade bakbenen, följt av placering av bakben ner på denna yta.
    2. Score bakbenet plHANTERA reflex:
      0 för inga framgångar
      1 för placering av en baktass (vänster eller höger baktass kan anges här)
      2 för framgångsrik bakbensutsläppande för båda baktassar
  8. Cliff Undvikande
    1. Med början på PD4 börjar klippan undvikande test. Placera råttunge vid kanten av en plan yta, så att framtassarna och nos hos valp är över kanten. Det korrekta resultatet är ett skyddande svar, där råttunge vänder sig bort från kanten på klippan. Försöksledaren hand eller skum landning placeras under klippan att fånga valpen från hösten.
    2. Betyg klippan undvikande:
      0 för ingen rörelse eller falla av kanten
      En för försök att komma bort från klippan, men med hängande armar och ben
      2 för framgångsrik rörelse bort från klippan
  9. Gång
    1. Börja utvärdering av gång på PD6. Placera valpar i mitten av en 15 cm Diameter cirkel och låt valpen 30 s för att slutföra uppgiften. 14 En framgångsrik gångart utförs när råttunge kan röra båda framtassama utanför cirkeln på mindre än 30 s.
    2. Betyg gång som tiden i sekunder det tar råtta valpen att röra sig utanför cirkeln. Registrera den tid det tar valpen att flytta båda framtassarna utanför cirkeln. Record 30 s om valpen är oförmögen att slutföra uppgiften inom den angivna tiden
  10. Auditory spritta
    1. Börja analys av hörsel spritta på PD10. Presentera ett högt ljud (bell) direkt över pup att bedöma huruvida eller inte en skrämselreaktion är närvarande. En positiv reaktion på plötsliga observeras när valpen visar en 'ryck' rörelse, bort från ljudet.
    2. Betyg hörselskrämsel:
      (Eller ingen) för ingen skrämselreaktion
      (Eller ja) för en positiv reaktion på plötsliga
  11. Hållning
    1. Börja hållning analys på PD12. Placera pups på icke-hal öppna ytan, och observera hållning pup har vid förflyttning. En omogen hållning återspeglas genom att dra av buken vid förflyttning, och vinkelrätt pekar båda framtassarna och baktassar i förhållande till kroppen. En mogen hållning förvärvas när pup kan lyfta buken från ytan och båda framtassarna och baktassarna är spetsiga rak, eller parallellt med kroppen, när den rör sig.
    2. Betyg hållning:
      0 för ingen rörelse
      En för omogna hållning vid förflyttning
      2 för mogen hållning under förflyttning
  12. Ögonöppnande
    1. Börja ögonöppnande analys på pD12. Anteckna dagen båda ögonlocken öppna:
      0 för inga synliga ögon
      1 för en synlig ögat (vänster eller höger sida kan anges här)
      2 för två synliga ögon
  13. Accelerated Uppriktningsprov
    1. Med början på PD14 börjar accelererad rätande testning. Placera valpen i ryggläge 30,48 centimeters ovanför en skum landning. Släpp valp och observera dess förmåga att räta upp sig. Rätande refererar till när valpen kan vända över till liggande läge och landa på tassarna.
    2. Betyg påskyndat rätande:
      0 för att falla på rygg
      1 för faller på sin sida (vänster eller höger sida kan anges här)
      2 för landning på tassarna

Notera: Olika typer av kvantifiering av reflexer är tillgängliga beroende på frågan om utredarna. Kvantifiering av reflexer kan göras som initial observation av en reflex, första dagen utseende fram till försvinnandet av reflex, tiden det tar att framgångsrikt utföra uppgiften, snabb prestanda och / eller förbättring av prestanda över tiden. 13, 14, 29, 30, 31 För cktuellt studie var den första dagen av utseende som en poäng. Vid användning av multipara modeller, valpar från samma kull vanligtvis beter sig på samma sätt på grund av deras arvsmassa, i livmodern och postpartum miljö och närings tillgänglighet. 32 Därför kan en enda pup kan inte redovisas som en n = 1 på grund av att strö bias. Pups undersökts inom en kull kan medelvärdes så att varje kull representerar ett n = 1. 32, 33 Alternativt kan flera pups inom samma kull analyseras med hjälp av blandade effekter modell, som tar hänsyn till valpar inom samma kull. 32, 33

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidslinjen för denna experimentella utformning presenteras i Figur 2. 30 Metoderna och resultaten har tidigare publicerats. 30 Syftet med studien var att bedöma om kosttillskott med broccoligroddar under dräktigheten och preweaning period skyddade avkomman från neurodevelopmental fördröjning framkallad av in utero exponering för LPS. Tidsinställda dräktiga råttor gavs intraperitoneala injektioner av saltlösning (kontroll, 100 | il) eller LPS (200 pg / kg utspädd i 100 | il av steril saltlösning) på E19 och E20 varje 12 h. Slumpmässigt utvalda gravida dammar fick också kosttillskott av torkade broccoligroddar (200 mg / dag) från E14 till PD21. LPS användes för att härma moderns inflammation och broccoligroddar gavs som en potentiell terapeutisk intervention för att skydda avkomman. Valpar föddes naturligt på E23 ( (Tabell 1). Börjar den PD3, pups gick en batteri av nerv reflexer och förvärv av reflexen definierades som dag reflexen uppträdde (figur 3, tabell 1). Se den refererade artikeln för ytterligare detaljer. 30

födelsevikt

Analys av födelsevikter avslöjade en huvudeffekt av behandlingen (F (1,23) = 18,5, 0,0003), diet (F (1,23) = 6,5, p = 0,02), och en interaktionseffekt (F (1,23) = 7,4, p = 0,01). LPS, som en återspegling av maternal inflammation, resulterade i valpar (5,1 ± 0,2 g) födda betydligt mindre jämfört med Saline valpar (6,3 ± 0,2 g, Tukeys p <0,001), Saline + broccoligroddar pups (6,2 ± 0,2 g, Tukeys p <0,001), och LPS + broccoligroddar pups (6.0 ± 0,1 g, Tukeys p <0,01). Födelsevikt hos LPS + broccoli groddar valpar skilde sig inte från kontroller, vilket tyder på att de broccoligroddar skonas LPS valpar från att tillväxt begränsas.

Neuroutvecklings Reflex Testning

Grasping Reflex

Inga effekter av behandling eller diet observerades för både forelimb och bakdelen gripande. Alla valpar kunde utföra dessa uppgifter.

bakdelen Placering

En huvudbehandlingseffekt (F (1,23) = 6,8, p = 0,02) detekterades för bakbensutsläppande. Jämfört med Saline (4,3 ± 0,1 dagar, Tukeys p <0,05) och Saline + broccoligroddar (4,3 ± 0,0 dagar, Tukeys p <0,05), var LPS pups signifikant fördröjd (5,1 ± 0,3dagar). Även om resultatet av LPS + broccoligroddar valpar inte skiljer sig från LPS valpar, de inte längre skilde sig från kontroller, vilket tyder på en förbättring i denna reflex uppgift från dessa valpar som fick LPS och ingen behandling.

Cliff Undvikande

En huvudbehandlingseffekt (F (1,25) = 6,0, p = 0,02) efter klippa undvikande analys detekterades. LPS valpar (5,8 ± 0,4 dagar) var signifikant komprometterat i att erhålla denna reflex jämfört med saltlösning (4,4 ± 0,2 dagar, Tukeys p <0,05). LPS + broccoligroddar valpar inte utföra annorlunda från någon av grupperna, vilket tyder på en förbättring i prestanda.

Gång

En signifikant effekt av behandling (F (1,24) = 15,1, p = 0,0007), diet (F (1,24) = 6,3, p = 0,02), och ett interverkan mellan behandling och kost (F (1,24) = 9,5, p = 0,005) befanns följande gångart analyser. En fördröjd förvärv av gångart detekterades i LPS valpar (9,7 ± 0,4 dagar) jämfört med koksaltlösning (7,5 ± 0,3 dagar, Tukeys p <0,001), Saline + broccoligroddar (7,7 ± 0,3 dagar, Tukeys p <0,001), och LPS + broccoligroddar pups (7,9 ± 0,2 dagar, Tukeys p <0,01).

Auditory spritta

Inga skillnader observerades.

rätande

Ett kön effekt detekterades (F (1,43) = 16,3, p = 0,0002) för rätande därför manliga och kvinnliga valpar undersöktes separat. Inga skillnader upptäcktes för män. Hos kvinnor, en huvud effekten av diet (F (1,21) = 11,8, p = 0,002) och en interaktionseffekt (F (1,21) = 15,6,p = 0,0007) hittades. LPS + broccoligroddar pups (4,9 ± 0,4 dagar) kunde höger tidigare jämfört med LPS-valpar (6,7 ± 0,6 dagar, Tukeys p <0,05).

Accelerated Uppriktningsprov

Den accelererade rätande Testet avslöjade en signifikant huvudeffekt av behandling (F (1,25) = 4,51, p = 0,04). LPS (17,4 ± 0,6 dagar) och LPS + broccoligroddar pups (16,9 ± 0,2 dagar) var försenade i utförande accelererade rätande jämfört med saltlösning (16,0 ± 0,4 dagar) och Saline + broccoligroddar (16,4 ± 0,5 dagar).

Hållning

En signifikant interaktionseffekt av behandling och kost (F (1,24) = 5,8, p = 0,02) detekterades följande analys av hållning. LPS + broccoligroddar valpar (14,9 ± 0,4 dagar) hade en mogen hållning tidigare än LPS (17,0 ± 0,4 dagar, Tukeys p <0,05).

Ögonöppnande

En signifikant huvudeffekt av diet (F (1,23) = 4,71, p = 0,04) observerades i fråga om att öppna ögonen. Både saltlösning + BrSp (15,9 ± 0,1 dagar) och LPS + broccoligroddar pups (15,4 ± 0,2 dagar) uppnås denna reflex tidigare än Saline (16.0 ± 0,2 dagar) och LPS valpar (16,0 ± 0,1 dagar).

Sammantaget broccoli spira konsumtion under sen dräktighet och preweaning perioden kunde ge skydd mot LPS-inducerade försenad utveckling i flera av reflexer undersökta. Se den refererade artikeln för ytterligare detaljer. 30

Figur 1
Figur 1. Positive Vaginal Smear. Ett exempel på en vaginal utstryk avbildas med en 10X objektivlins på ett ljusmikroskop. Denna glid representerar ett positivt slid indikeras av närvaron av spermier (pil). Vid utförande av en vaginal utstryk, kan den Östrogencykeln för råttan bedömas vara antingen proestrus estrus, metestrus eller diestrus. Detta hjälper till att exakt timing grogrund för en högre graviditet framgång.

figur 2
Figur 2. Experimentell Design tidslinjen. Den experimentella tidsplan för att utvärdera avkomman till dammar ges intraperitoneala injektioner av LPS. Dietary tillskott med broccoligroddar börjar E14 upp till PD21. Dammar injiceras på E19 och E20 var 12 h (betecknade som gula pilar). Maternal vikter registreras med en våg och kroppstemperatur med en rektal temperatursond täckt med smörjmedel. Ungarna föds NATURally på E23 (betecknade som en svart pil). Med början på PD3, ungar genomgår flera reflextestning. På PD21, valpar genomgår öppna fälttest för att utvärdera beteendemässiga reaktioner.

figur 3
Figur 3. Exempel på en tidslinje för Bedömning av Neuropsykiatriska Reflexer. Reflexer visas i olika stadier av utveckling, alltså fånga förvärvet av dessa reflexer kräver att testa börjar några dagar innan. Denna studie använde lång Evans råttungar, men skillnader mellan stammar och arter förekommer, bör därför genomföras ett preliminärt experiment med hjälp av dessa datum som en allmän vägledning. Frambens grepp, bakbenen grepp och rätande bedöms PD3, bakdelen placering och klippa undvikande på PD4, och gång på PD6. Hörsel startle utvärderas PD10, hållning och ögonöppningar på pD12, och accelererade rätande på PD14.


Figur 4. Bilder av Develop Reflexer. Bilder av reflextestning utförs på PD3 i Long-Evans råttungar. Forelimb grepp (A), bakbens grepp (B) samt att vända (C) undersökning börjar PD3. Klippa undvikande (D) och bakbensutsläppande (E) testning börjar på PD4. Gait (F) analyser börjar på PD6. Apparaten för accelererad rätande avbildas (G). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Examination Parameter Grupper (medelvärde ± SEM) Huvudsakliga effekter (p-värde)
Kullstorlek och vikter Salin Saline + broccoli groddar LPS LPS + broccoli groddar Behandling Diet Interaktion
Kullstorlek (antal ungar) 13,3 ± 1,0 13,1 ± 1,0 10,3 ± 1,5 11 ± 1,2 0,03 0,8 0,7
Födelsevikt * # d 6,3 ± 0,2 6,2 ± 0,2 5,1 ± 0,2 6,0 ± 0,1 0,0003 0,02 0,01
PD7 Vikter * d 15,0 ± 0,5 15,5 ± 0,4 11,4 ± 1,1 13,6 ± 0,3 0,0006 0,09 0,2
PD21 Vikter d 50,0 ± 1,4 48,7 ± 1,6 46,4 ± 1,2 48,2 ± 1,4 0,2 0,9 0,3
Neurodevelop-
mentala Reflexer
Forelimb förstå en 3,0 ± 0,0 3,0 ± 0,0 3,0 ± 0,0 3,0 ± 0,0 n / a n / a n / a
Bakdelen förstå en 3,6 ± 0,3 3,5 ± 0,3 4,6 ± 0,6 3,3 ± 0,1 0,3 0,1 0,1
Bakbens Placering * a 4,3 ± 0,1 4,3 ± 0,0 5,1 ± 0,3 4,5 ± 0,2 0,02 0,07 0,2
Klippa Undvikande * a 4,4 ± 0,2 4,7 ± 0,2 5,8 ± 0,4 5,0 ± 0,4 0,02 0,4 0,1
Gait * # a 7,5 ± 0,3 7,7 ± 0,3 9,7 ± 0,4 7,9 ± 0,2 0,0007 0,02 0,005
Auditory spritta en 11,5 ± 0,3 11,5 ± 0,1 12,0 ± 0,5 11,8 ± 0,2 0,2 0,8 0,9
posture #A 15,6 ± 0,5 15,9 ± 0,6 17,0 ± 0,4 14,9 ± 0,4 0,8 0,08 0,02
Eye Öppningar a 16,0 ± 0,2 15,9 ± 0,1 16,0 ± 0,1 15,4 ± 0,2 0,08 0,04 0,2
Accelerated Rätande en 16,0 ± 0,4 16,4 ± 0,5 17,4 ± 0,6 16,9 ± 0,2 0,04 1 0,3
Rätande #A (honor) 4,9 ± 0,5 5,1 ± 0,4 6,7 ± 0,6 4,6 ± 0,4 0,09 0,003 0,0007
Rätande a (hanar) 3,9 ± 0,2 4,6 ± 0,3 5,9 ± 1,9 4,2 ± 0,6 0,4 0,6 0,2
En dag av utseende * Signifikant skillnad mellan LPS och saltlösning
b Antal gånger aktivitet utfördes # Signifikant skillnad mellan LPS och LPS + BrSp
c sekunder
d gram

Tabell 1. Vikter och neurodevelopmental Reflex Resultat. Resultat erhållna från avkomman som exponerats för in utero inflammation och / eller dietbroccoligroddar supplementation. 30 Vikterna som presenteras här är från födseln, PD7 och PD21. De tidpunkter valdes att representera en prematur, sikt och 1-2-åriga barn. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Statistiska analyser som användes i studien var en tvåvägs ANOVA följt av Tukeys post hoc-test.a = dag av utseende, b = antal gånger aktiviteten utfördes, och c = den tid (s) den aktivitet utfördes, * = signifikant skillnad mellan LPS och kontroll, # = signifikant skillnad mellan LPS och LPS + broccoligroddar. n = 5 - 7 kullar per grupp (värden från fyra pups, två hanar och två honor, inom en kull beräknades att representera kullen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neuropsykiatriska reflex testning är en prediktiv mått på onormal kortikal utveckling och mognad, som kan vara av betydelse under omständigheter där öppen neuropatologi är inte självklart. Under neuro tester är det viktigt att se till att valparna undersöks samtidigt dagligen. Råttor är nattdjur, och därför kan deras dygnsrytm ändra prestanda om testningen utförs vid olika tidpunkter under dagen. 34 Testning bör kompletteras i ett tyst rum som höga ljud kan lägga stress valparna. 35 Valparna kräver ett minimum av 1 h för att acklimatisera sig till nya miljöer, eftersom transporten, mänsklig hantering, och nya inställningar kan inducera stress i avkomman. 35 Ungar måste också testas direkt under en uppvärmd lampa eller på en uppvärmd dyna. Ju yngre valparna, desto mindre kan de kan thermoregulate. 36 Av denna anledning är pups ges 15s och 30 s för utförande av rätande på PD3 och gång på PD6, respektive. 36 Dessutom kontroll pups bör inte tillväxt begränsas när de föds, som vikt representerar en confounding faktor. Kullar bör också gallras till 8-10 för att ge lika näring och representation av kön. När valparna föds, är det viktigt att tillåta en dag för råttan att bilda en obligation med dammen för att förhindra moderns försummelse.

Valpar måste testas en dag eller två innan den dag de förvärva reflex för att fånga uppkomsten av utseende. Beroende på experimentell modell kan vissa ändringar behövas. Nyfödda möss är mycket mindre än råttor. Därför är storleken på den utrustning som används kan behöva justeras för att storleken hos de nyfödda möss. Viss felsökning kan också krävas. Olika stammar och arter kan ha något annorlunda tidpunkten för uppkomsten av reflexer. 13 Tidpunkten beskrivs i denna rapport är specific för att Long-Evans valpar, med testning för nya reflexer börjar den PD3, 4, 6, 10, 12, och 14 (figur 3). Utredaren kan behöva utföra reflextest på 2 - 3 kullar att fastställa den naturliga reflex progression före experimentell testning. Dessutom, när utför statistiska analyser på de data som samlas in, måste försöksledaren använda lämpliga metoder för att förhindra strö bias. Valpar från samma kull tenderar att utföra liknande sätt till varandra, därför kullen representerar en n = 1, inte den enskilda pup. 32, 33

Testa nerv reflexer är viktigt eftersom det är det enda test för nyfödda gnagare, eftersom mer komplex beteende testning är inte möjligt på dessa åldrar. Inga andra åtgärder finns i denna tidiga period förutom vikt och utseende. Metoderna som här har använts av flera forskare, vilket stöderanvändning av neurologisk reflextestning, särskilt hos unga gnagare där andra beteendetester inte är genomförbara. 13, 14, 29, 30, 31, 37, 38 Dessa tester parallellt med reflex tester utförda i humana spädbarn, är förutsägande för nervsystemets sjukdomar, såsom cerebral pares, och ge ytterligare information avseende ontogeni av neurala nätverk. Uppkomsten av reflexer inträffar under särskilda tidpunkter under preweaning perioden, vilket återspeglar mognaden av nervsystemet. 39 En begränsning hos detta protokoll är att inte alla experimentella modeller kan utsättas för reflextestning. Gnagare föds omogna, så att deras postnatal utveckling har den fördelen att fånga uppkomsten av reflex utveckling. Andra djurmodeller såsomsom lammet föds mogna och utvecklas annorlunda än gnagare, så att en del av reflex testning är inte tillämplig på denna modell. Dessutom är reflextestning inte ett direkt mått på kognitiva eller beteendeavvikelser, och det är osäkert om några observerade avvikelser är övergående eller ihållande.

Förutom reflexer, kan beteendetester göras för kompletterande analyser i högre åldrar. Detta är av betydelse eftersom avvikande reflex förseningar inte alltid leder till nervsystemets sjukdomar. 2, 40 Testerna administreras typiskt börjar den PD21 (dagen för avvänjning) när gnagare kan utföra kognitiva och motoriska uppgifter. Dessa tester innefattar bot inte begränsad till rotarod, Morris vatten labyrint, och förhöjda plus labyrint. Kortfattat är rotarodtestet utfördes genom att placera gnagare på en roterande stav, och registrera dess prestanda på stången under en tidsperiod eller tills gnagare fallerav. Detta test utvärderar motorisk inlärning och styrka, såväl som integriteten hos hjärnstrukturer såsom basala ganglierna och cerebellum. 41 Morris vatten labyrint består av att placera gnagare i en pool av mjölkvit vatten, och registrera den tid det tar för gnagare för att hitta en nedsänkt plattform. Cues kan placeras ovanför varje kvadrant av poolen med samma kö alltid ovanför plattformen. Detta undersöker egocentriska vs allocentric former av hippocampus medierad spatial inlärning och minne. 42 Den förhöjda plus maze test mäter rädsla och ångest, såväl som inneboende undersökande beteende. Gnagare är placerade i centrum av fyra armar, två slutna och två öppna, upphöjd över marken. 43 Den undvikande och utforskande beteende (utvärderat som tid i varje arm) hos gnagare registreras. 43 Dessa ytterligare tester undersöka sensomotorisk och kognitiv funktion, vilket möjliggör för forskaren att somsess om förolämpning varar i vuxen ålder, eller om det är övergående.

Försenad utveckling är prediktiva och kompletterande beteende tester krävs för att ge kompletterande bevis för förekomsten av en sjukdom senare i livet. Dessutom måste responser kontroll optimeras innan experimentera med töjnings och artskillnader, genetiska förändringar, läkemedelsadministration, etc. Trots dessa förhållanden, är de beskrivna teknikerna snabbt lärt, lätt behärskar, billigt, och ger viktig information om utvecklingen av den nervsystem. De erbjuder en möjlighet att utvärdera ontogeni och mognaden av nervsystemet hos valpar vid en ålder då de är oförmögna att utföra mogna beteende uppgifter. Dessutom mänskliga spädbarn genomgår ofta utvecklingsreflextestning, och således, tillhandahåller gnagare reflextestning ett medel för translationsbarhet. Sammanfattningsvis är detta en utmärkt metod för preliminär screening av onormalneurologiska utvecklingen hos nyfödda som kan leda till senare undersökning av kognition och beteende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka våra finansiärer, som omfattar NeuroDevNet (nationell spetsforsknings) ALVA Foundation, de kvinnors och barns hälsa Research Institute och University of Alberta.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Breeding
Transfer pipettes Fisherbrand 12-711-9AM Used for vaginal flushes.
Sterile Saline Hospira 7983254 The solution used to collect cells during vaginal flushes.
400 µL Microcentrifuge tubes Fisherbrand 05-408-120 Used to hold the saline solution.
Light microscope Leica Leica ATC 2000 For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab.
Slides Fisherbrand 12-552-5 The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab.
Coverslips Fisherbrand 12-545-F To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab.
Dietary  Supplementation
Broccoli Sprouts seeds Mumm's Sprouting Seeds Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab.
Countertop Seed Sprouter Box Mumm's Sprouting Seeds A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest.
250 mL beaker The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used.
Maternal Inflammation
Lipoplysaccharide (LPS) Sigma L3129 The endotoxin used to mimic maternal inflammation.
1 mL Syringe BD Syringe 309659 Used to inject the pregnant rat.
Gauge (30 G x 1/2) BD PrecisionGlide Needle 305106 Use the smallest needle to avoid pain and discomfort.
Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP) Hospira Saline is used to dissolve LPS.
Weights
Scale Denver Instrument For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab.
Neurodevelopmental Reflexes
Thin blunt rod Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping.
Round filter paper Whatman 1001 150 15 cm diameter paper used for gait analysis.
Timer Fisher Scientific 06-662-51 For timing the time allocated to righting and gait.
Blunt surface Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance.
Foam landing For when the pups perform accelerated righting.
Video recorder Sony VCT-D580RM To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1,000 fps
Bell For auditory startle. 
Heat lamp or pad To maintain the body temperature of the pups underoing examination.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farber, J. M., Shapiro, B. K., Palmer, F. B., Capute, A. J. The diagnostic value of the neurodevelopmental examination. Clin Pediatr (Phila. 24 (7), 367-372 (1985).
  2. Zafeiriou, D. I. Primitive reflexes and postural reactions in the neurodevelopmental examination). Pediatr. Neurol. 31 (1), 1-8 (2004).
  3. Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. S. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).
  4. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum. Dev. 3 (1), 79-83 (1979).
  5. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog. Neurobiol. , (2013).
  6. Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch. Dis. Child. 48 (10), 757-767 (1973).
  7. Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr. Res. 65 (1), 62-66 (2009).
  8. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with. Dev. Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  9. Back, S. A., Riddle, A., McClure, M. M. Maturation-dependent vulnerability of perinatal white matter in premature birth. Stroke. 38, 724-730 (2007).
  10. Back, S. A., et al. Late oligodendrocyte progenitors coincide with the developmental window of vulnerability for human perinatal white matter injury. J. Neurosci. 21 (4), 1302-1312 (2001).
  11. Downes, N., Mullins, P. The development of myelin in the brain of the juvenile rat. Toxicol. Pathol. 42 (5), 913-922 (2014).
  12. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front. Neuroanat. 3 (5), (2009).
  13. Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim. Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
  14. Lubics, A., et al. Neurological reflexes and early motor behavior in rats subjected to neonatal hypoxic-ischemic injury. Behav. Brain Res. 157 (1), 157-165 (2005).
  15. Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int. J. Pediatr. , 191562 (2012).
  16. Hashimoto, R., Tanaka, Y. Contribution of the supplementary motor area and anterior cingulate gyrus to pathological grasping phenomena. Eur. Neurol. 40 (3), 151-158 (1998).
  17. Isaza Jaramillo, S. P., et al. Accuracy of the Babinski sign in the identification of pyramidal tract dysfunction. J. Neurol. Sci. 343 (1-2), 66-68 (2014).
  18. Donatelle, J. M. Growth of the corticospinal tract and the development of placing reactions in the postnatal rat. J. Comp. Neurol. 175 (2), 207-231 (1977).
  19. Palanza, P., Parmigiani, S., vom Saal, F. S. Effects of Prenatal Exposure to Low Doses of Diethylstilbestrol, o,p'DDT and Methoxychlor on Postnatal Growth and Neurobehavioral Development in Male and Female Mice. Horm. Behav. 40 (2), 252-265 (2001).
  20. Pantaleoni, G. C., et al. Effects of maternal exposure to polychlorobiphenyls (PCBs) on F1 generation behavior in the rat. Fundam. Appl. Toxicol. 11 (3), 440-449 (1988).
  21. Yeomans, J. S., Frankland, P. W. The acoustic startle reflex: neurons and connections. Brain Res. Rev. 21 (3), 301-314 (1995).
  22. Vinay, L., Brocard, F., Clarac, F. Differential maturation of motoneurons innervating ankle flexor and extensor muscles in the neonatal rat. Eur. J. Neurosci. 12 (12), 4562-4566 (2000).
  23. Geisler, H. C., Westerga, J., Gramsbergen, A. Development of posture in the rat. Acta Neurobiol. Exp.(Wars. 53 (4), 517-523 (1993).
  24. Heinen, K., et al. Gabaa receptor maturation in relation to eye opening in the rat visual cortex). Neuroscience. 124 (1), 161-171 (2004).
  25. Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behav. Brain Res. 145 (1-2), 221-232 (2003).
  26. Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behav. Brain Res. 136 (2), 339-348 (2002).
  27. Wu, L., et al. Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (18), 7094-7099 (2004).
  28. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and. J. Vis. Exp. (67), (2012).
  29. Rousset, C. I., et al. Maternal exposure to lipopolysaccharide leads to transient motor dysfunction in neonatal rats. Dev. Neurosci. 35 (2-3), 172-181 (2013).
  30. Nguyen, A. T., Bahry, A. M. A., Shen, K. Q., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Consumption of broccoli sprouts during late gestation and lactation confers protection against developmental delay induced by maternal inflammation. Behav. Brain Res. 307, 239-249 (2016).
  31. Black, A. M., Armstrong, E. A., Scott, O., Juurlink, B. J., Yager, J. Y. Broccoli sprout supplementation during pregnancy prevents brain injury in the newborn rat following placental insufficiency. Behav. Brain Res. 291, 289-298 (2015).
  32. Wainwright, P. E. Issues of design and analysis relating to the use of multiparous species in developmental nutritional studies. J. Nutr. 128 (3), 661-663 (1998).
  33. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14, 14-37 (2013).
  34. Sergio, D. P., Sanchez, S., Ruben, V. R., Ana, B. R., Barriga, C. Changes in behaviour and in the circadian rhythms of melatonin and corticosterone in rats subjected to a forced-swimming test. J Appl Biomed. 1 (47), (2005).
  35. Castelhano-Carlos, M., Baumans, V. The impact of light, noise, cage cleaning and in-house transport on welfare and stress of laboratory rats. Lab. Anim. 43 (4), 311-327 (2009).
  36. Zimmerberg, B., Ballard, G. A., Riley, E. P. The development of thermoregulation after prenatal exposure to alcohol in rats. Psychopharmacology (Berl. 91 (4), 479-484 (1987).
  37. Fan, L. W., et al. Hypoxia-ischemia induced neurological dysfunction and brain injury in the neonatal rat). Behav. Brain Res. 165 (1), 80-90 (2005).
  38. Smart, J. L., Dobbing, J. Vulnerability of developing brain. VI. Relative effects of foetal and early postnatal undernutrition on reflex ontogeny and development of behaviour in the rat. Brain Res. 33 (2), 303-314 (1971).
  39. Fox, M. W. Neuro-Behavioral ontogeny: A synthesis of ethological and neurophysiological concepts. Brain Res. 2 (1), 3-20 (1966).
  40. Piper, M. C., Mazer, B., Silver, K. M., Ramsay, M. Resolution of neurological symptoms in high-risk infants during the first two years of life. Dev. Med. Child Neurol. 30 (1), 26-35 (1988).
  41. Shiotsuki, H., et al. A rotarod test for evaluation of motor skill learning. J. Neurosci. Methods. 189 (2), 180-185 (2010).
  42. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat. Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
  43. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat. Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).

Tags

Beteende nerv reflexer nyfödda råttor nyfödd testning utvecklingsstörning inflammation cerebral pares
Neuro Reflex Testning i neonatala råttungar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, A. T., Armstrong, E. A.,… More

Nguyen, A. T., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Neurodevelopmental Reflex Testing in Neonatal Rat Pups. J. Vis. Exp. (122), e55261, doi:10.3791/55261 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter