Differentiel scanningskalorimetri måler den termiske overgangstemperatur (er) og samlede varmeenergi kræves for at denaturere et protein. Opnåede resultater anvendes til at vurdere den termiske stabilitet af proteinantigener i vaccineformuleringer.
Differentiel scanningskalorimetri (DSC) er en analytisk teknik, der måler den molære varmekapacitet af prøver som funktion af temperaturen. I tilfælde af proteinprøver, DSC profiler giver information om termisk stabilitet, og i nogen grad fungerer som en strukturel "fingeraftryk", der kan anvendes til at vurdere strukturelle konformation. Den udføres under anvendelse af et differential scanning kalorimeter, der måler den termiske overgangstemperatur (smeltetemperatur, Tm) og den nødvendige energi til at afbryde interaktionerne stabiliserende den tertiære struktur (enthalpi, AH) af proteiner. Sammenligninger er lavet mellem formuleringer samt produktions partier og forskelle i afledte værdier indikerer forskelle i termisk stabilitet og strukturelle kropsbygning. Data, der illustrerer brugen af DSC i en industriel indstilling for stabilitets studier samt overvågning centrale faser i fremstillingsprocessen er tilvejebragt som bevis for effektiviteten af denne proprotokol. I sammenligning med andre metoder til vurdering af den termiske stabilitet af protein konformationer, DSC er omkostningseffektivt, kræver få fremstillingstrin prøve, og også giver en komplet termodynamisk profil af proteinet udfoldningsprocessen.
Differentiel scanningskalorimetri (DSC) er en eksperimentel metode, der direkte måler forskellen i varmeenergi optagelse finder sted i en prøve i forhold til en reference under et reguleret temperaturændring 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Udføres i et differential scanning kalorimeter involverer fremgangsmåden indføring varmeenergi i en prøvecelle og en reference celle samtidigt, mens identisk forøgelse af temperaturen af begge celler over tid 2, 13,14. På grund af forskellen i sammensætningen af prøven og referencen, vil forskellig mængde energi være påkrævet for at hæve temperaturen af cellerne 2, 12, 13. Således er den overskydende mængde energi, der kræves for at kompensere for temperaturforskellen mellem cellerne måles og direkte korreleret til specifikke termodynamiske egenskaber ved prøve 1, 3.
I 1960'erne, MJ O'Neil og E. Watson af Perkin Elmer udviklede den første differentialscanningkalorimeter at måle den varme strøm af faste materialer 2, 3, 4. Sideløbende PL Privalov og DR Monaseldze EL af Institut for Fysik, Republikken Georgien (tidligere USSR) skabt en unik differentieret adiabatisk kalorimeter, der kan bruges for biokemisk forskning 5, 6. Efterfølgende Andronikashvili team på Institut for Fysik, Republikken Georgien, rapporterede varmekapacitet af biomolekyler såsom fibrøse og kugleformede proteiner, DNA og RNA ved hjælp af DSC 7, 8, 9. Flere hold ledet af Sturtevant 10, 11, 12, Brandts 13, og Privalov 14, 15, 16 fokuseret på udviklingen af teorien og praktiske anvendelser af DSC til at undersøge de termodynamiske detaljer proteinudfoldning. Værdien af DSC i at studere store supramolekylære strukturer såsom fager, chloroplast, phospholipid flydende krystaller og kød-proteiner er også blevet rapporteret 17 </ sup>, 18, 19, 20.
DSC er nu blevet hverdagskost i farmaceutisk forskning og udvikling for vurderingen af den termiske stabilitet af biomolekyler, især proteiner 1, 21, 22. Dette skyldes hovedsagelig, at fremskridt med hensyn til følsomhed og automatisering af instrumentering anvendt til at udføre eksperimentet 23, 24. Her, det endelige resultat af DSC eksperiment, nemlig molære varmekapacitet som en funktion af temperaturen, der bruges til at estimere følgende termodynamiske parametre (ændring i varmekapacitet (ACp), entalpi (AH), entropi (AS) , og Gibbs fri energi (AG)) ved hjælp af nedenstående ligning:
eq1.jpg "/> (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Hvor Cp måles varmekapacitet; q er varmestrømmen i testmaterialet; T 0 og T er de indledende og afsluttende temperaturer overgangen henholdsvis 22, 25. Det er også værd at bemærke, at ligningerne ovenfor, gælder for single-domæne proteiner, der kan undergå to-stats overgang og reversibel termisk udfoldning 22. Analyse af mere komplekse proteiner (fx ikke-to-state-proteiner og oligomerer) have blevet rapporteret af Friere et al. 26; Johnson et al. 27; og Kasimova et al. 28.
For at afgøre om et protein gennemgår to-stats overgang eller danner mellemprodukter under termisk denaturering, den eksperimentelt afledt enthalpi (AH, også kaldet kalorimetriske entalpi AH Cal) sammenholdes med den enthalpi udledt ved hjælp af van't Hoff ligningen nedenfor (også benævnt van't Hoff enthalpi, AH VH):
(6)
Hvor T m er midtpunktet temperatur af overgangen, R er den ideelle gaskonstant (1,987 cal mol -1 K -1), og Y er den del af proteinet befolkning i udfoldet stand 16, 29. HvisAH VH er lig med AH Cal; eller AH VH / AH Cal er lig med 1, så proteinet undergår en "alt-eller-intet" overgang (dvs. to-stats overgang) 16, 25, 29. Men hvis AH VH er mindre end AH Cal; eller AH VH / AH Cal er mindre end 1, proteinet undergår en ikke-to-stats overgang 16, 25, 29. Forholdet AH VH / AH Cal svarer også til den del af proteinstrukturen, der smelter som en termodynamisk kooperativ eller -domænet 26.
De termodynamiske parametre nævnt ovenfor, såsom AG og AH give nyttige oplysninger om den termiske stabilitet af proteiner, herunder biologiske 30. Dog vil der blive lagt vægt på T m og AH i denne publikation, da de er de rapporterede værdier for denne protokol. T m er midtpunktet temperatur af overgangen, hvor den foldede og udfoldede tilstande af proteinet er ved ligevægt (dvs. AG = 0) 25, 31. Jo højere T m af et protein, desto højere er dens termiske stabilitet 31. AH svarer til arealet af den top (e) af varmekapacitet i forhold til temperatur graf (også kendt som termogram), der genereres ved udgangen af DSC eksperiment 16, 25. Det er den energi, der kræves til at denaturere proteiner og kan anvendes til at estimere den aktive fraktion (Fa) i et protein formulering (dvs. andelen af proteiner med aktiv konformation i en prøve) ved følgende ligning:
jove_content "> (7)Hvor AH er den eksperimentelt afledte entalpi af proteinet prøven og Q er enthalpi bestemt for en velkarakteriseret reference eller standardiseret protein 22. Vurderingen af F a er væsentlig for at overvåge real-time stabilitet produkter samt udførelse stabilitetsundersøgelser under stress betingelser som kræves af ICH guidelines 32. Sammenligning af DH giver også oplysninger om kompakthed af den tertiære struktur konformation af et protein 31.
Denne protokol beskriver en procedure for vurdering af den termiske stabilitet af proteiner i en industriel indstilling og har været flittigt brugt til formulering af vacciner. Det blev udviklet under anvendelse af en automatiseret differential scanning kalorimeter, der genererer reproducerbare resultater feller proteinkoncentrationer så lave som 300 ug / ml.
Denne procedure er blevet indarbejdet i forskellige karakterisering testpakker, herunder stabilitet og produkt sammenligningsstudier 21. I realtid stabilitetsundersøgelser er DSC anvendes til at overvåge Tm, samt estimere F en af biologiske over tid for at bestemme deres holdbarhed. Med hensyn til produkt sammenlignelighed, er det bruges til at vurdere konsekvenserne af processen og anlæg forandring samt effekten af de vigtigste fremstillingsprocesser trin på den strukturelle kropsbygning af producerede partier. Dette involverer typisk direkte sammenligning af AH af produceret meget for et referenceprodukt, der er blevet udpeget som det ideelle produkt. Derudover har DSC vist sig at være et nyttigt analytisk værktøj til produkt formulering undersøgelser 37. T m af et protein i forskellige puffere og ved forskellige koncentrationer kan anvendes til at bestemme den formulering, der virksomheden får mest stabilitet tilproteinet.
For at sikre pålideligheden af denne metode og objektivitet af resultaterne, er det vigtigt at holde test parametre konsekvent fra løb til at køre i den samme undersøgelse (f.eks vaccineformulering undersøgelse). Imidlertid kan fremgangsmåden modificeres til at rumme forskelle i de fysiske egenskaber af forskellige proteiner. Et eksempel på en modifikation, der kan gøres er ved at ændre scanningshastighed på eksperimentet 38, 39. Proteiner, der var udsat for danner aggregater ved opvarmning blev undersøgt i et hurtigere scanningshastighed (f.eks 120 ° C / h) for at undgå bidrag aggregater til den termiske overgang profil samt tilstopning kapillærer kalorimeteret. Det er værd at bemærke, at scanning sats kan påvirke resultatet af en DSC eksperiment 38. Udvidelse af den thermiske peak overgang er blevet observeret med stigende skannehastigheder i nogle proproteiner; Men T m været nogenlunde konstant 38. Desuden dialyse og afgasning skridt om prøveforberedelse er også meget afgørende for præcise resultater 31. Dialyse sikrer, at den eneste forskel i sammensætningen af prøven og bufferen er det protein; Således kan alle de overskydende varme, der absorberes af prøven tilskrives varmekapacitet af proteinet. Afgasning sikrer præcis volumen analyse, som ekstrapolering af den termodynamiske parameter forudsætter, at udfoldelsen begivenheden optræder under konstant volumen og tryk 31. Den konstante del tryk antagelsen går til kvælstof tryksætning af systemet i henhold til § 1.1 i proceduren.
I sammenligning med andre fremgangsmåder til bestemmelse af stabiliteten af protein konformationer såsom cirkulær dikroisme (CD) og fluorescens spektroskopier, DSC tilbyder en række fordele i et comkommerciel indstilling herunder omkostnings- og tidsbesparelser. Første den adiabatiske udformning af et differential scanning kalorimeter muliggør måling af termisk stabilitet med bedre temperatur præcision sammenlignet med målinger med instrumentering til CD og fluorescens spektroskopier 6. For det andet i modsætning til CD, nøjagtigheden af DSC data er ikke afhængig af helicitet af proteinet 39, 40; Men CD giver yderligere oplysninger om udfoldelsen af den sekundære struktur, som ville være gratis til DSC 41. Derudover tryk i DSC systemet giver mulighed for test med et stort temperaturområde uden kogning af prøven; Således kan en lang række proteiner testes ved DSC.
Mens DSC er en relativt hurtig og enkel metode til at bestemme den termiske stabilitet af biologiske, er det ikke uden begrænsninger. Først, basenline subtraktion trin introducerer en form for human inkonsistens i rå dataanalyse; således kan variationer i resultaterne observeret blandt forskellige brugere. For det andet, differential scanning varmemålere har minimum koncentrationsgrænser, som kan være vanskelig at opnå på bulk produktion skala. For det tredje, AH af irreversibel termisk denaturering er ikke absolut; hvilket indebærer, at afledt AG (en indikator for proteinstabilitet) i lignende scenarier kan være vildledende. Endvidere metoden fungerer bedst for oprensede prøver. Tilstedeværelse af urenheder kan enten forårsage en ændring i T m, hvis der er en interaktion med proteinet, der undersøges, eller fremkomst af nye termiske overgange, hvis der ikke er nogen interaktion. Under alle omstændigheder disse ekstra funktioner på de thermograms kan fejlagtigt tilskrives prøver, hvilket påvirker fortolkningen af resultaterne. På trods af disse begrænsninger, DSC forbliver en pålidelig metode, der kan give detaljerede termodynamiske oplysninger om the protein udfoldning proces, hvis de gennemføres korrekt 42.
Afslutningsvis DSC giver en betydelig fordel, eftersom en konformationel udlæsning værktøj til vaccineprodukter og deres mellemprodukter. De to parametre, T m og AH, indsamlet for en bred vifte af partier af det samme produkt kan blive en empirisk baseline, der kan bruges til at undersøge effekten af procesændringer, formulering og opbevaringsbetingelser på den tertiære struktur og stabilitet af protein og virale antigener 21, 43.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er meget taknemmelige for Joseph Mancini (tidligere med GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments begrænset) for deres rolle i installation og træning på differential scanning kalorimeter, Sasmit Deshmukh og Webster Magcalas for deres drøftelser.
Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ – A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |