Differensial skanningskalorimetri måler den termiske overgangstemperaturen (e) og total varmeenergi som kreves for å denaturere et protein. Oppnådde resultater er brukt for å vurdere den termiske stabilitet av proteinantigener i vaksinepreparater.
Differensiell scanning kalorimetri (DSC) er en analytisk teknikk som måler den molare varmekapasiteten av prøvene som en funksjon av temperaturen. I tilfelle av proteinprøver, DSC-profiler gir informasjon om termisk stabilitet, og til en viss grad tjener som en strukturell "fingeravtrykk" som kan brukes til å vurdere strukturelle konformasjon. Det er utført ved å bruke et differensielt scanning kalorimeter som måler den termiske overgangstemperatur (smeltetemperatur; T m), og den energi som kreves for å avbryte vekselvirkningene stabiliserings den tertiære strukturen (entalpi, AH) av proteiner. Sammenligninger er gjort mellom formuleringer samt produksjonspartier, og forskjeller i avledede verdier indikerer forskjeller i termisk stabilitet og strukturelle konformasjon. Data som illustrerer bruk av DSC i en industriell setting for stabilitetsstudier samt overvåke sentrale produksjonstrinn er gitt som bevis for effektiviteten av denne proprotokollen. I forhold til andre metoder for å vurdere den termiske stabilitet av protein konformasjoner, er DSC kostnadseffektiv, krever noen prøveopparbeidelse trinn, og gir også en komplett termodynamisk profil av proteinet utbrettingsprosessen.
Differensiell scanning kalorimetri (DSC) er en eksperimentell metode som direkte måler forskjellen i varmeenergi opptak finner sted i en prøve i forhold til en referanse under en regulert temperaturendring 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Utføres i et kalorimeter, innebærer fremgangsmåten innføring av varme-energi inn i en prøvecelle og en referansecelle samtidig mens identisk å øke temperaturen i begge celler over tid 2, 13,14. På grunn av forskjell i sammensetningen av prøven og referansen, blir forskjellig energimengde kreves for å heve temperaturen av cellene 2, 12, 13. Således blir den overskytende mengde energi som er nødvendig for å kompensere for temperaturforskjellen mellom cellene måles og direkte korrelert til bestemte termodynamiske egenskapene til prøven 1, 3.
I 1960, MJ O'Neil og E. Watson av Perkin Eimer utviklet den første differensiell scanning kalorimeter for å måle varmestrøm av faste materialer 2, 3, 4. Parallelt PL Privalov og DR Monaseldze EL ved Institutt for fysikk, Republikken Georgia (tidligere Sovjetunionen) skapt et unikt differensial adiabatisk kalorimeter som kan brukes for biokjemisk forskning 5, 6. Deretter Andronikashvili team ved Institutt for fysikk, Republikken Georgia, melder varmekapasitet av biomolekyler som fibrøs og globular proteiner, DNA og RNA ved hjelp av DSC 7, 8, 9. Flere lag ledet av Sturtevant 10, 11, 12, Brandts 13, og Privalov 14, 15, 16 med fokus på utvikling av teori og praktiske anvendelser av DSC å undersøke termodynamiske detaljer om protein utfoldelse. Verdien av DSC i å studere store supramolekylære strukturer som fager, kloroplast, fosfolipid-flytende krystaller, og kjøttproteiner er også blitt rapportert 17 </ sup>, 18, 19, 20.
DSC har nå blitt vanlig i farmasøytisk forskning og utvikling for vurdering av termisk stabilitet av biomolekyler, spesielt proteiner 1, 21, 22. Dette er hovedsakelig på grunn av fremskritt når det gjelder følsomhet og automatisering av instrumentering brukes til å utføre eksperimentet 23, 24. Her er den endelige resultatet av DSC forsøket, nemlig molar varmekapasitet som en funksjon av temperatur, blir brukt til å estimere de følgende termodynamiske parametere (endring i varmekapasitet (ΔCp), entalpi (AH), entropi (D s) og Gibbs fri energi (ΔG)) ved bruk av ligningen nedenfor:
eq1.jpg "/> (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Hvor Cp er målt varmekapasitet; q er varmestrømmen i testmaterialet; T 0 og T er de innledende og avsluttende temperatur på overgangen henholdsvis 22, 25. Det er også verdt å merke seg at ligningene ovenfor gjelder for single-domene proteiner som kan gjennomgå to-tilstands og reversibel varme utfolder 22. Analyse av mer komplekse proteiner (for eksempel ikke-to-state-proteiner og oligomerer) have blitt rapportert av Friere et al. 26; Johnson et al. 27; og Kasimova et al. 28.
For å bestemme hvorvidt et protein som gjennomgår en to-tilstandsovergang eller danner mellomprodukter i løpet av termisk denaturering, den eksperimentelt utledet entalpi (AH, også referert til som kalorimetrisk entalpi AH Cal) sammenlignes med den entalpi utledet ved hjelp av van't Hoff ligning gitt under (også referert til som van't Hoff entalpi; AH VH):
(6)
Hvor T m er midtpunktet temperaturen i overgangen, R er den ideelle gasskonstant (1,987 cal mol -1 K-1) og Y er den fraksjon av proteinet befolkningen i utfoldet tilstand 16, 29. HvisAH VH er lik AH Cal; eller AH VH / AH Cal er lik 1, da proteinet gjennomgår en "alt-eller-ingen" overgang (dvs. to-stats overgang) 16, 25, 29. Men hvis AH = VH er mindre enn AH Cal; eller AH VH / AH Cal er mindre enn 1, protein gjennomgår en ikke-to-tilstandsovergangen 16, 25, 29. Forholdet AH VH / AH Cal svarer også til den andel av proteinstruktur som smelter som en termodynamisk samarbeidende enhet eller domene 26.
De termodynamiske parametre som er nevnt ovenfor, for eksempel ΔG og AH gi nyttig informasjon om den termiske stabilitet av proteiner, inkludert biologiske 30. Imidlertid vil det bli lagt på T m og AH i denne publikasjonen, som de er de rapporterte verdier for denne protokollen. T m er midtpunktet temperatur av overgangen, hvor den foldede og de utspredte tilstander av proteinet er ved likevekt (dvs. ΔG = 0) 25, 31. Jo høyere T m av en protein, jo høyere dens termiske stabilitet 31. AH tilsvarer arealet under toppen (e) av varmekapasitet sammenlignet med temperaturgraf (også kjent som termogram) som ble generert ved slutten av forsøket DSC 16, 25. Det er energien som kreves for å denaturere proteiner og som kan brukes til å estimere den aktive fraksjon (F a) i en proteinformulering (dvs. andelen av proteiner med aktiv konformasjon i en prøve) ved hjelp av følgende ligning:
jove_content "> (7)Hvor AH er den eksperimentelt utledet entalpien av proteinprøven og Q er entalpien bestemt for et godt karakterisert referanse eller standardisert protein 22. Estimering av F a er vesentlig for å overvåke i sanntid stabilitet av produkter samt gjennomføre stabilitetsstudier under stress forhold som kreves av ICH retningslinjer 32. Sammenligning av AH gir også informasjon om kompakthet av tertiær struktur konformasjon av et protein 31.
Denne protokollen detaljer en fremgangsmåte for å bedømme den termiske stabilitet av proteiner i et industrielt miljø og har vært mye brukt for formulering av vaksiner. Det ble utviklet ved bruk av en automatisert differensiell scanning kalorimeter som genererer reproduserbare resultater feller proteinkonsentrasjoner så lave som 300 ug / ml.
Denne prosedyren har blitt innlemmet i ulike karaktertest pakker, inkludert stabilitet og produkt sammenlignbar studier 21. I sanntid stabilitetsstudier, blir DSC brukes til å overvåke T m, samt beregne en F av biologiske over tid for å bestemme deres holdbarhet. Med hensyn til produktet sammenlignbarhet, er det brukt for å vurdere effekten av prosessen og anlegget endring samt effekten av sentrale produksjonstrinn på den strukturelle konformasjon av produserte massevis. Dette innebærer vanligvis direkte sammenligning av AH av produsert mye til et referanseprodukt som har blitt utpekt som det ideelle produktet. I tillegg har DSC vist seg å være et nyttig analytisk verktøy for produktet formuleringsstudier 37. T m av en protein i forskjellige buffere og ved forskjellige konsentrasjoner kan brukes til å bestemme den formulering som proffers den mest stabilitet overforproteinet.
For å sikre påliteligheten av denne metoden, og objektivitet av sine resultater, er det viktig å holde testparametere konsistent fra gang til gang innen samme studie (f.eks vaksineformulering studien). Imidlertid kan fremgangsmåten bli endret for å tilpasse forskjellene i de fysikalske egenskapene til forskjellige proteiner. Et eksempel på en modifikasjon som kan foretas er å endre skannehastighet av eksperimentet 38, 39. Proteiner som var tilbøyelige til å danne aggregater når de oppvarmes ble undersøkt på en raskere skannehastighet (for eksempel 120 ° C / t) for å unngå bidraget av aggregater til den termiske overgangsprofil samt tilstopping kapillærene i kalorimeteret. Det er verdt å merke seg at skanning hastighet kan påvirke utfallet av en DSC eksperiment 38. Utvidelse av den termiske overgangen peak har blitt observert med økende skanning priser på noen proproteiner; men forble T m nokså konstant 38. Videre dialyse og avgassing trinnene for prøveopparbeidelse er også svært viktig for nøyaktige resultater 31. Dialyse sikrer at den eneste forskjell i sammensetningen av prøven og bufferen er protein; således kan alt overskuddsvarmen absorberes av prøven tilbakeføres til varmekapasiteten av proteinet. Avgassing sikrer nøyaktig volumanalyse, som ekstrapolering av den termodynamiske parameter forutsetter at utfoldelsen hendelsen skjer under konstant volum og trykk 31. Den konstante press del av forutsetningen som står for nitrogen trykk av systemet som angitt i del 1.1 av prosedyren.
I forhold til andre fremgangsmåter for å bestemme stabiliteten av protein konformasjoner som Sirkulær dikroisme (CD) og fluorescens-spektros, byr DSC en rekke fordeler i en comkommersiell setting med kostnads- og tidsbesparelser. For det første, den adiabatiske utforming av et differensial-kalorimeter tillater måling av termisk stabilitet med bedre temperatur nøyaktighet sammenlignet med målinger med instrumentering for CD og fluorescens-spektros 6. For det andre, i motsetning CD, er nøyaktigheten av DSC data ikke er avhengig av spiralformethet av proteinet 39, 40; men gir CD ytterligere informasjon om utfoldelsen av den sekundære struktur, som vil være gratis til DSC 41. I tillegg er trykksettingen av DSC-systemet gjør det mulig for testing med et bredt temperaturområde uten koking prøven; således kan et stort utvalg av proteiner bli testet ved DSC.
Mens DSC er en relativt rask og enkel måte for å bestemme den termiske stabilitet av biologiske, er det ikke uten begrensninger. Først, baselinjen subtraksjon skritt introduserer noen form for menneskelig inkonsekvens inn rådata analyse; således, vil variasjoner i resultatene observeres mellom forskjellige brukere. Sekund, differensial skanning kalori har minimum konsentrasjonsgrenser som kan være vanskelig å få til på bulk produksjon skala. For det tredje, AH for irreversibel termisk denaturering er ikke absolutte; som innebærer at avledet ΔG (en indikator for proteinstabilitet) i lignende situasjoner kan være misvisende. Videre er den metode som fungerer best for rensede prøver. Tilstedeværelsen av urenheter kan enten føre til en forskyvning i T m hvis det er en interaksjon med proteinet som undersøkes, eller fremkomst av nye termiske overganger hvis det ikke er noen interaksjon. I alle fall disse ekstra egenskaper på de termo kan feilaktig tilskrives prøver, og dermed påvirker tolkningen av resultatene. Til tross for disse begrensningene, forblir DSC en pålitelig metode som kan gi detaljert termodynamisk informasjon om the protein utbrettingsprosessen hvis implementert riktig 42.
I konklusjonen, DSC gir betydelig fordel som en konformasjonsendring avlesning verktøy for vaksineprodukter og deres mellomprodukter. De to parametere, T m og AH, innsamlet for en matrise av partier av samme produkt kan bli en empirisk grunnlinjen som kan brukes til å undersøke virkningen av prosessendringer, formulering, og lagringsbetingelser på den tertiære strukturen og stabiliteten av protein og virale antigener 21, 43.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er svært takknemlig til Joseph Mancini (tidligere med GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments begrenset) for sin rolle i installasjon og opplæring på kalorimeter, Sasmit Deshmukh og Webster Magcalas for sine diskusjoner.
Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ – A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |