अंतर स्कैनिंग उष्मामिति थर्मल संक्रमण तापमान (एस) और कुल गर्मी ऊर्जा एक प्रोटीन denature के लिए आवश्यक उपाय। प्राप्त परिणामों के टीके योगों में प्रोटीन एंटीजन के थर्मल स्थिरता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
अंतर स्कैनिंग उष्मामिति (डीएससी) एक विश्लेषणात्मक तकनीक है कि तापमान के एक समारोह के रूप में नमूने की दाढ़ गर्मी क्षमता को मापता है। प्रोटीन के नमूने के मामले में, डीएससी प्रोफाइल थर्मल स्थिरता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, और कुछ हद तक एक संरचनात्मक "" फिंगरप्रिंट कि संरचनात्मक रचना का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में कार्य करता है। (; टी एम पिघलने के तापमान) और ऊर्जा बातचीत तृतीयक संरचना स्थिर बाधित करने की आवश्यकता है, प्रोटीन की (तापीय धारिता ΔH) यह एक अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर कि थर्मल संक्रमण तापमान उपायों का उपयोग किया जाता है। तुलना योगों के साथ ही उत्पादन बहुत सारे के बीच बना रहे हैं, और व्युत्पन्न मूल्यों में मतभेद थर्मल स्थिरता और संरचनात्मक रचना में मतभेद का संकेत मिलता है। स्थिरता के अध्ययन के लिए एक औद्योगिक सेटिंग में डीएससी के उपयोग को दर्शाता हुआ तथा प्रमुख विनिर्माण कदम निगरानी डेटा इस समर्थक की प्रभावशीलता के सबूत के रूप में प्रदान की जाती हैंtocol। प्रोटीन रचना के थर्मल स्थिरता का आकलन करने के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, डीएससी, लागत प्रभावी है कुछ नमूना तैयार कदम की आवश्यकता है, और यह भी प्रोटीन खुलासा प्रक्रिया की पूरी thermodynamic प्रोफ़ाइल प्रदान करता है।
अंतर स्कैनिंग उष्मामिति (डीएससी) एक प्रयोगात्मक विधि है कि सीधे नियंत्रित तापमान परिवर्तन 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 के दौरान एक संदर्भ के लिए एक नमूना रिश्तेदार में हो रही गर्मी ऊर्जा तेज में अंतर की गणना करता है , 10, 11, 12। एक अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर में किए गए, विधि एक नमूना सेल और एक संदर्भ सेल एक साथ, जबकि हूबहू समय 2, 13 से अधिक दोनों कोशिकाओं के तापमान में वृद्धि में गर्मी ऊर्जा को शुरू करना शामिल है,14। नमूना और संदर्भ की संरचना में अंतर के कारण, ऊर्जा के विभिन्न राशि कोशिकाओं 2, 12, 13 के तापमान को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो जाएगा। इस प्रकार, कोशिकाओं के तापमान के बीच अंतर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए आवश्यक ऊर्जा की अतिरिक्त राशि मापा जाता है और सीधे नमूना 1, 3 की विशिष्ट thermodynamic के गुणों के लिए सहसंबद्ध।
1960 के दशक में, एम जे ओ 'नील और Perkin एल्मर का ई वाटसन ठोस सामग्री 2, 3, 4 की गर्मी प्रवाह को मापने के लिए पहली अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर विकसित की है। समानांतर में, पीएल Privalov और भौतिकी संस्थान के डॉ Monaseldze ईएल जॉर्जिया के गणराज्य (पूर्व सोवियत संघ) एक अद्वितीय अंतर adiabatic कैलोरीमीटर कि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता बनायाआर जैव रासायनिक अनुसंधान 5, 6। इसके बाद, भौतिकी संस्थान, जॉर्जिया के गणराज्य में Andronikashvili की टीम, ऐसे रेशेदार और गोलाकार प्रोटीन, डीएनए, आरएनए और डीएससी 7, 8, 9 का उपयोग कर के रूप में biomolecules की गर्मी क्षमता की सूचना दी। Sturtevant 10, 11, 12, 13 Brandts, और Privalov 14, 15, 16 के नेतृत्व में कई टीमों प्रोटीन खुलासा के thermodynamic विवरण की जांच करने के सिद्धांत और डीएससी के व्यावहारिक अनुप्रयोगों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया। ऐसे फगेस, क्लोरोप्लास्ट, फॉस्फोलिपिड तरल क्रिस्टल, और मांस प्रोटीन के रूप में बड़े supramolecular संरचनाओं का अध्ययन करने में डीएससी के मूल्य भी 17 सूचित किया गया है </ sup>, 18, 19, 20।
डीएससी अब, biomolecules के थर्मल स्थिरता के मूल्यांकन के लिए दवा अनुसंधान और विकास में आम हो गया है, विशेष रूप से प्रोटीन 1, 21, 22। यह ज्यादातर संवेदनशीलता और प्रयोग 23, 24 से बाहर ले जाने के लिए इस्तेमाल किया इंस्ट्रूमेंटेशन के स्वचालन के मामले में प्रगति के कारण है। इधर, डीएससी प्रयोग, अर्थात्, तापमान के एक समारोह के रूप में दाढ़ गर्मी क्षमता के अंतिम परिणाम, निम्नलिखित thermodynamic के मापदंडों का अनुमान किया जाता है (ΔS गर्मी क्षमता (ΔCp), तापीय धारिता (ΔH), एन्ट्रापी में परिवर्तन () और गिब्स मुक्त ऊर्जा (ΔG)) नीचे समीकरण का उपयोग:
eq1.jpg "/> (1)
(2)
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(5)
कहाँ सी.पी. गर्मी क्षमता मापा जाता है; क्यू परीक्षण सामग्री में गर्मी प्रवाह है; 0 टी और टी क्रमश: 22, 25 संक्रमण के प्रारंभिक और अंतिम तापमान हैं। यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि समीकरणों से ऊपर एकल डोमेन प्रोटीन है कि दो राज्य के संक्रमण और प्रतिवर्ती थर्मल खुलासा 22 गुजरना कर सकते हैं करने के लिए आवेदन के लायक है। और अधिक जटिल प्रोटीन (जैसे, गैर-दो राज्य प्रोटीन, और oligomers) का विश्लेषण जएवेन्यू Friere एट अल द्वारा सूचना दी गई। 26; जॉनसन एट अल। 27; और Kasimova एट अल। 28।
एक प्रोटीन दो राज्य के संक्रमण से होकर गुजरती है या थर्मल विकृतीकरण के दौरान मध्यवर्ती रूपों यह निर्धारित करने के लिए, प्रयोगात्मक निकाली गई तापीय धारिता (ΔH, के रूप में भी उष्मापन तापीय धारिता ΔH काल कहा जाता है) तापीय धारिता van't हॉफ समीकरण भी कम दिया (का उपयोग ली गई की तुलना में है van't हॉफ तापीय धारिता के रूप में भेजा, ΔH VH):
(6)
जहां टी एम संक्रमण के मध्य तापमान, आर आदर्श गैस निरंतर (1.987 कैलोरी मोल -1 कश्मीर -1) है और वाई सामने आया राज्य 16, 29 में प्रोटीन की आबादी का अंश है। अगरΔH VH ΔH काल के बराबर है; या ΔH VH / ΔH काल 1 के बराबर है, तो प्रोटीन एक "सभी या कोई नहीं" संक्रमण (यानी दो-राज्य संक्रमण) 16, 25, 29 से होकर गुजरती है। हालांकि, अगर ΔH VH ΔH काल से भी कम है; या ΔH VH / ΔH काल कम से कम 1 प्रोटीन एक गैर-दो राज्य संक्रमण 16, 25, 29 से गुज़रता है। ΔH VH / ΔH काल के अनुपात से भी प्रोटीन संरचना है कि एक thermodynamic सहकारी इकाई या डोमेन के रूप में 26 के अनुपात में पिघला देता है से मेल खाती है।
ΔG और ΔH के रूप में इस तरह के ऊपर उल्लेख किया thermodynamic के मापदंडों के प्रोटीन के थर्मल स्थिरता, बायोलॉजिक्स सहित के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान 30। हालांकि, जोर दिया है, इस प्रकाशन में टी मी और ΔH पर रखा जाएगा के रूप में वे इस प्रोटोकॉल के लिए सूचना मान रहे हैं। टी एम संक्रमण, जहां मुड़ा और प्रोटीन के सामने आया राज्यों संतुलन पर हैं (यानी, ΔG = 0), 25, 31 के मध्य बिंदु तापमान है। उच्च एक प्रोटीन की टी एम, उच्च अपने थर्मल स्थिरता 31। ΔH बनाम तापमान ग्राफ (भी thermogram के रूप में जाना जाता है) गर्मी क्षमता के शिखर (एस) के तहत क्षेत्र से मेल खाती है डीएससी प्रयोग 16, 25 के अंत में उत्पन्न। यह ऊर्जा प्रोटीन denature करने के लिए और एक प्रोटीन तैयार करने में सक्रिय अंश (एफ) एक अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता जरूरी है (यानी, एक नमूने में सक्रिय रचना के साथ प्रोटीन के अनुपात में) निम्न समीकरण का उपयोग:
jove_content "> (7)कहाँ ΔH प्रोटीन नमूने की प्रयोगात्मक निकाली गई तापीय धारिता है और क्यू तापीय धारिता एक अच्छी तरह से विशेषता संदर्भ या मानकीकृत प्रोटीन 22 के लिए चुना गया है। एफ एक के आकलन तनाव की स्थिति के तहत उत्पादों की वास्तविक समय की निगरानी स्थिरता के साथ ही स्थिरता अध्ययन करने के रूप में आईसीएच दिशा निर्देशों 32 द्वारा अपेक्षित के लिए महत्वपूर्ण है। ΔH की तुलना भी एक प्रोटीन 31 के तृतीयक संरचना रचना की सघनता के बारे में जानकारी प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल एक औद्योगिक सेटिंग में प्रोटीन की थर्मल स्थिरता का आकलन करने के लिए एक प्रक्रिया का विवरण और बड़े पैमाने पर टीके के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह एक स्वचालित अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम एफ उत्पन्न का उपयोग कर विकसित किया गया थाया 300 माइक्रोग्राम / एमएल के रूप में के रूप में कम प्रोटीन सांद्रता।
इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक स्थिरता और उत्पाद तुलनीयता के अध्ययन के 21 सहित विभिन्न लक्षण वर्णन परीक्षण संकुल, में शामिल किया गया है। वास्तविक समय स्थिरता अध्ययन में, डीएससी टी मीटर पर नजर रखने के लिए, साथ ही समय के साथ एफ बायोलॉजिक्स के एक अनुमान उनकी शेल्फ जीवन का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। साथ उत्पाद तुलनीयता करने का संबंध है, यह प्रक्रिया और सुविधा परिवर्तन के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से उत्पादित लॉट के संरचनात्मक रचना पर कुंजी विनिर्माण कदम के प्रभाव का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आमतौर पर एक संदर्भ उत्पाद है कि आदर्श उत्पाद के रूप में नामित किया गया है करने के लिए उत्पादन बहुत की ΔH के प्रत्यक्ष तुलना शामिल है। इसके अलावा, DSC उत्पाद तैयार करने के अध्ययनों से 37 के लिए एक उपयोगी विश्लेषणात्मक उपकरण साबित हो गया है। विभिन्न बफ़र्स में और अलग सांद्रता में एक प्रोटीन की टी एम सूत्रीकरण कि सबसे करने के लिए स्थिरता proffers निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताप्रोटीन।
इस विधि और उसके परिणामों की निष्पक्षता की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए, यह एक ही अध्ययन (जैसे, वैक्सीन तैयार करने अध्ययन) के भीतर चलाने के लिए रन से लगातार परीक्षण मानकों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, प्रक्रिया विभिन्न प्रोटीन के भौतिक गुणों में मतभेद को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक संशोधन का एक उदाहरण है कि बनाया जा सकता प्रयोग 38, 39 की स्कैनिंग दर में फेरबदल किया गया है। प्रोटीन है कि गठन के समुच्चय से ग्रस्त थे जब गरम एक तेजी से स्कैनिंग दर पर जांच की गई है (जैसे, 120 डिग्री सेल्सियस / एच) थर्मल संक्रमण प्रोफ़ाइल के समुच्चय के योगदान कैलोरीमीटर की केशिकाओं clogging के रूप में से बचने के लिए भी है। यह ध्यान देने योग्य है कि स्कैनिंग की दर एक डीएससी प्रयोग 38 के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं लायक है। थर्मल संक्रमण चोटी के विस्तार कुछ समर्थक में स्कैनिंग की दरों में वृद्धि के साथ देखा गया हैteins; हालांकि, टी एम काफी लगातार 38 बने रहे। इसके अलावा, नमूना तैयार करने के लिए डायलिसिस और degassing कदम भी सही परिणाम 31 के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। डायलिसिस सुनिश्चित करता है कि नमूना और बफर की संरचना में फर्क सिर्फ इतना प्रोटीन होता है; इस प्रकार, सभी अतिरिक्त गर्मी नमूना द्वारा अवशोषित प्रोटीन की गर्मी क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। के रूप में thermodynamic पैरामीटर के एक्सट्रपलेशन मानता है कि खुलासा घटना निरंतर मात्रा और दबाव 31 के तहत हो रहा है degassing, सटीक मात्रा विश्लेषण करता है। इस धारणा के लगातार दबाव भाग प्रक्रिया की धारा 1.1 के अनुसार इस प्रणाली के नाइट्रोजन दबाव से हिसाब है।
इस तरह के परिपत्र Dichroism (सीडी) और प्रतिदीप्ति spectroscopies के रूप में प्रोटीन रचना की स्थिरता का निर्धारण करने के अन्य तरीकों की तुलना में, डीएससी एक कॉम में लाभ के एक नंबर प्रदान करता हैलागत और समय की बचत सहित तौर पर वाणिज्यिक सेटिंग। सबसे पहले, एक अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर के समोष्ण डिजाइन सीडी और प्रतिदीप्ति spectroscopies 6 के लिए उपकरण के साथ माप की तुलना में बेहतर तापमान परिशुद्धता के साथ थर्मल स्थिरता की माप के लिए अनुमति देता है। दूसरे, सीडी के विपरीत, डीएससी डेटा की सटीकता नहीं प्रोटीन 39, 40 के helicity पर निर्भर है; हालांकि, सीडी माध्यमिक संरचना है, जो डीएससी 41 के लिए मानार्थ होगा के खुलासा के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, डीएससी प्रणाली के दबाव नमूना उबलते के बिना एक व्यापक तापमान रेंज के साथ परीक्षण के लिए अनुमति देता है; इस प्रकार, प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला डीएससी द्वारा परीक्षण किया जा सकता है।
डीएससी एक अपेक्षाकृत तेजी से और सीधा बायोलॉजिक्स के थर्मल स्थिरता का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण है, यह सीमाओं के बिना नहीं है। सबसे पहले, आधारलाइन घटाव कदम कच्चे डेटा विश्लेषण में मानव विसंगति के कुछ फार्म का परिचय; इस प्रकार, परिणाम में बदलाव के विभिन्न उपयोगकर्ताओं के बीच मनाया जा सकता है। दूसरा, अंतर स्कैनिंग calorimeters न्यूनतम एकाग्रता की सीमा जो थोक विनिर्माण पैमाने पर प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है। तीसरा, अपरिवर्तनीय थर्मल विकृतीकरण के ΔH निरपेक्ष नहीं है; जो अर्थ है कि ली गई ΔG (प्रोटीन स्थिरता का सूचक) समान स्थितियों में गुमराह किया जा सकता है। इसके अलावा, विधि शुद्ध नमूने के लिए सबसे अच्छा काम करता है। अशुद्धियों की उपस्थिति या तो टी मीटर में बदलाव का कारण हो सकता है अगर वहाँ जांच के तहत प्रोटीन, या नए थर्मल संक्रमण की उपस्थिति के साथ एक बातचीत है अगर कोई बातचीत है। किसी भी मामले में thermograms पर इन अतिरिक्त सुविधाओं को गलत तरीके से नमूने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, इस प्रकार परिणामों की व्याख्या को प्रभावित। इन सीमाओं के बावजूद, डीएससी एक विश्वसनीय तरीका है कि वें के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते thermodynamic रहता हैई प्रोटीन प्रक्रिया खुलासा अगर ठीक से 42 लागू किया है।
अंत में, डीएससी टीका उत्पादों और उनके मध्यवर्ती के लिए एक गठनात्मक readout उपकरण के रूप में काफी लाभ प्रदान करता है। दो मापदंडों, टी एम और ΔH, एक ही उत्पाद की बहुत सारी की एक सरणी के लिए एकत्र एक अनुभवजन्य आधारभूत है कि इस प्रक्रिया में परिवर्तन, निर्माण, और तृतीयक संरचना पर भंडारण की स्थिति और प्रोटीन की स्थिरता के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और हो सकता है वायरल एंटीजन 21, 43।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों की स्थापना और अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर, Sasmit देशमुख और वेबस्टर Magcalas अपनी चर्चा के लिए पर प्रशिक्षण में उनकी भूमिका के लिए यूसुफ मैनसिनी (जीई हेल्थकेयर के साथ पूर्व), पावेल Czudec, थॉमस केज (Malvern उपकरण लिमिटेड) के लिए बहुत आभारी हैं।
Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ – A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |