Differentialscanningskalorimetri mäter termiska övergångstemperaturen (er) och den totala värmeenergi som krävs för att denaturera ett protein. Erhållna resultaten används för att bedöma den termiska stabiliteten hos proteinantigener i vaccinformuleringar.
Differentiell svepkalorimetri (DSC) är en analytisk teknik som mäter den molära värmekapaciteten för proverna som en funktion av temperaturen. När det gäller proteinprover, DSC-profiler ger information om termisk stabilitet, och till viss del fungerar som ett strukturellt "fingeravtryck" som kan användas för att bedöma den strukturella konformation. Den utförs med användning av en differentiell avsökningskalorimeter som mäter termiska övergångstemperaturen (smälttemperatur, T m) och den energi som krävs för att störa interaktionerna som stabiliserar tertiärstrukturen (entalpi; AH) av proteiner. Jämförelser görs mellan formuleringar samt tillverkningssatser, och skillnader i beräknade värdena visar på skillnader i termisk stabilitet och strukturell konformation. Data illustrerar användningen av DSC i en industriell miljö för stabilitetsstudier samt övervakningsknapp tillverkningssteg tillhandahålls som ett bevis på effektiviteten i denna proprotokoll. I jämförelse med andra metoder för att bedöma den termiska stabiliteten av proteinkonformationer, är DSC kostnadseffektivt, kräver några provberedningsstegen, och ger också en fullständig termodynamisk profil av proteinet utspelas processen.
Differentiell svepkalorimetri (DSC) är en experimentell metod som direkt mäter skillnaden i värmeenergi-upptag som äger rum i ett prov i förhållande till en referens under en reglerad temperaturändring 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Utförs i en differentiell avsökningskalorimeter, involverar metoden att införa värmeenergi i en provcell och en referenscell samtidigt medan identiskt ökning av temperaturen för båda cellerna över tiden 2, 13,14. På grund av skillnader i kompositionen av provet och referensen, kommer olika mängd energi att krävas för att höja temperaturen hos cellerna 2, 12, 13. Således är det överskjutande beloppet av energi som krävs för att kompensera för temperaturskillnaden mellan cellerna mäts och direkt korrelerad till specifika termodynamiska egenskaperna hos prov 1, 3.
På 1960-talet, MJ O'Neil och E. Watson av Perkin Elmer utvecklade den första differentialsvepkalorimeter för att mäta värmeflödet av fasta material 2, 3, 4. Parallellt PL Privalov och DR Monaseldze EL av Institute of Physics, Georgien (forna Sovjetunionen) skapat en unik differential adiabatisk kalori som kan användas for biokemisk forskning 5, 6. Därefter Andronikashvili team vid Institute of Physics, Georgien, rapporterade värmekapaciteten för biomolekyler, såsom fibrösa och globulära proteiner, DNA och RNA med hjälp av DSC 7, 8, 9. Flera grupper ledda av Sturtevant 10, 11, 12, Brandts 13, och Privalov 14, 15, 16 med fokus på utveckling av teori och praktiska tillämpningar av DSC för att undersöka de termodynamiska detaljer protein utspelas. Värdet på DSC i att studera stora supramolekylära strukturer såsom fager, kloroplast, fosfolipid flytande kristaller, och köttproteiner har också rapporterats 17 </ sup>, 18, 19, 20.
DSC har nu blivit vardagsmat i farmaceutisk forskning och utveckling för att bedöma den termiska stabiliteten hos biomolekyler, särskilt proteiner 1, 21, 22. Detta beror till största delen framsteg i termer av känslighet och automatisering av instrumentering som används för att utföra experimentet 23, 24. Här, det slutliga resultatet av DSC experiment, nämligen molar värmekapacitet som en funktion av temperaturen, används för att beräkna följande termodynamiska parametrar (förändring i värmekapacitet (ACp), entalpi (AH), entropi (AS) och Gibbs fria energi (AG)) med användning av ekvationen nedan:
eq1.jpg "/> (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Där Cp mäts värmekapacitet; q är värmeflödet in i testmaterialet; T 0 och T är de initiala och slutliga temperaturer övergången respektive 22, 25. Det är också värt att notera att ekvationerna ovan gäller enkeldomänproteiner som kan genomgå två-tillståndsövergång och reversibel termisk utspelas 22. Analys av mera komplexa proteiner (t.ex., icke-två-state-proteiner, och oligomerer) have rapporterats av Friere et al. 26; Johnson et al. 27; och Kasimova et al. 28.
För att bestämma huruvida ett protein genomgår två-tillståndsövergång eller bildar mellan under termisk denaturering, det experimentellt härledda entalpin (AH, även kallad kalorimetrisk entalpi AH Cal) jämförs med entalpin härleds med hjälp av van't Hoff ekvationen nedan (också kallas van't Hoff entalpi, AH VH):
(6)
Där Tm är mittpunkten temperatur övergången, R är idealisk gaskonstanten (1,987 cal mol -1 K -1) och Y är den del av proteinet befolkningen i ovikt skick 16, 29. OmAH VH är lika med AH Cal; eller AH VH / AH Cal är lika med ett, då proteinet genomgår en "allt-eller-inget" övergång (dvs två-tillståndsövergång) 16, 25, 29. Men om AH VH är mindre än AH Cal; eller AH VH / AH Cal är mindre än 1, proteinet undergår en icke-två-tillståndsövergång 16, 25, 29. Förhållandet AH VH / AH Cal motsvarar också den andel av proteinstrukturen som smälter som en termodynamisk kooperativ enhet eller domän 26.
De termodynamiska parametrar som nämns ovan, såsom AG och AH ge värdefull information om den termiska stabiliteten hos proteiner, inklusive biologiska 30. Dock kommer tyngdpunkten att läggas på Tm och AH i denna publikation, eftersom de är de rapporterade värdena för detta protokoll. Tm är den Mitttemperaturen för övergången, där den vikta och ovikta tillstånd hos proteinet är vid jämvikt (dvs AG = 0) 25, 31. Ju högre Tm för ett protein, desto högre är dess termiska stabilitet 31. AH motsvarar arean under toppen (er) i värmekapacitet som funktion av temperaturen grafen (även känd som termogram) som genereras vid slutet av DSC experiment 16, 25. Det är den energi som krävs för att denaturera proteiner och kan användas för att uppskatta den aktiva fraktionen (F a) i en formulering protein (dvs andelen av proteiner med aktiv konformation i ett prov) med användning av följande ekvation:
jove_content "> (7)Där AH är den experimentellt härledda entalpin av proteinprovet och Q är entalpin bestämts för en väl karakteriserad referens eller standardiserade protein 22. Uppskattningen av Fa är viktig för att övervaka realtids stabilitet produkter samt genomföra stabilitetsstudier under stressförhållanden i enlighet med ICH riktlinjer 32. Jämförelse av AH ger också information om kompaktheten tertiärstrukturen konforma av ett protein 31.
Detta protokoll detaljer ett förfarande för bedömning av den termiska stabiliteten hos proteiner i en industriell miljö och har i stor utsträckning använts för formulering av vacciner. Det har utvecklats med en automatiserad differentialscanningkalorimeter som genererar reproducerbara resultat feller proteinkoncentrationer så låga som 300 mikrogram / ml.
Detta förfarande har framgångsrikt införlivats i olika karakterisering testförpackningar, även stabilitet och produktjämförelsestudier 21. I realtid stabilitetsstudier är DSC används för att övervaka Tm, samt uppskatta Fa av biologiska över tiden för att bestämma deras hållbarhet. När det gäller produktjämförelse används den för att bedöma effekten av processen och anläggningen förändring samt effekten av viktiga tillverkningssteg på den strukturella konforma producerade partier. Detta innebär vanligtvis direkt jämförelse av AH producerad mycket att en referensprodukt som har utsetts till den perfekta produkten. Dessutom har DSC visat sig vara ett användbart analytiskt verktyg för produktformuleringsstudier 37. Tm för ett protein i olika buffertar och vid olika koncentrationer kan användas för att bestämma den formulering som visar istället det mest stabilitet vidproteinet.
För att säkerställa tillförlitligheten hos denna metod och objektivitet av dess resultat är det viktigt att hålla testparametrar konsekvent från körning till körning inom samma studie (t.ex. vaccinformulering studien). Emellertid kan förfarandet modifieras för att rymma skillnader i de fysikaliska egenskaperna hos olika proteiner. Ett exempel på en modifiering som kan göras är att förändra avsökningshastighet av experimentet 38, 39. Proteiner som var benägna att bilda aggregat vid uppvärmning undersöktes i en snabbare avsökningshastighet (t.ex. 120 ° C / h) för att undvika bidrag av aggregat till det termiska övergångs profil samt igensättning kapillärerna i kalorimetern. Det är värt att notera att scanningshastighet kan påverka resultatet av en DSC experiment 38. Breddning av den termiska omvandlingstopp har observerats med ökande rotationshastighet i vissa proproteiner; dock Tm förblev relativt konstant 38. Dessutom dialys och avgas steg för provberedning är också mycket viktigt för korrekta resultat 31. Dialys säkerställer att den enda skillnaden i kompositionen av provet och bufferten är proteinet; sålunda kan all överskottsvärme som absorberas av provet tillskrivas värmekapaciteten hos proteinet. Avgasning säkerställer exakt volymanalys, som en extrapolering av den termodynamiska parametern förutsätter att den pågående händelsen inträffar under konstant volym och tryck 31. Det konstanta trycket delen av antagandet utgörs av kväve trycksättning av systemet enligt punkt 1.1 i förfarandet.
I jämförelse med andra metoder för bestämning av stabiliteten av proteinkonformationer, såsom cirkulär dikroism (CD) och fluorescensspektroskopi, erbjuder DSC ett antal fördelar i en comkommersiell miljö inklusive kostnads- och tidsbesparingar. För det första, den adiabatiska utformningen av en differentiell avsökningskalorimeter möjliggör mätning av termisk stabilitet med bättre temperatur precision jämfört med mätningar med instrumentering för CD och Fluorescence spektroskopier 6. För det andra, till skillnad från CD, är noggrannheten i DSC-data inte beroende av helicitet av proteinet 39, 40; Men CD ger ytterligare information om den pågående av sekundärstrukturen, vilket skulle vara ett komplement till DSC 41. Dessutom möjliggör trycksättningen av DSC systemet för provning med ett brett temperaturområde utan kokning av provet; således kan ett stort antal olika proteiner testas genom DSC.
Medan DSC är en relativt snabb och okomplicerad metod för att bestämma den termiska stabiliteten av biologiska, är det inte utan begränsningar. Först, basenline subtraktion steg införs någon form av mänsklig inkonsekvens i rådataanalys; således kan variationer i resultaten observeras mellan olika användare. För det andra, differentialavsökande kalorimetrar har minimikoncentrationsgränser som kan vara svåra att uppnå på bulktillverkningsskala. För det tredje, den AH av irreversibel termisk denaturering är inte absolut; vilket innebär att härledd AG (en indikator på proteinstabilitet) i liknande situationer kan vara missvisande. Dessutom fungerar metoden bäst för renade prover. Närvaron av föroreningar kan antingen orsaka en förskjutning i T m om det finns en interaktion med proteinet under utredning, eller uppkomsten av nya termiska övergångar, om det inte finns någon interaktion. I varje fall dessa extra funktioner på termo kan felaktigt tillskrivas prover, vilket påverkar tolkningen av resultaten. Trots dessa begränsningar fortfarande DSC en tillförlitlig metod som kan ge detaljerad termodynamisk information om thE-proteinet utspelas process om de genomförs på rätt sätt 42.
Sammanfattningsvis erbjuder DSC avsevärd fördel som en konforma avläsning verktyg för vaccinprodukter och deras mellanhänder. De två parametrar, Tm och AH, som samlats för en rad partier av samma produkt kan bli en empirisk baslinje som kan användas för att undersöka effekterna av processförändringar, formulering och lagringsförhållanden på den tertiära strukturen och stabiliteten av protein och virala antigener 21, 43.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är mycket tacksamma till Joseph Mancini (tidigare med GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments Limited) för sin roll i installation och utbildning på differentialsvepkalorimeter, Sasmit Deshmukh och Webster Magcalas för sina diskussioner.
Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ – A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |