Summary
Qui si descrive un protocollo a 4 stadi per differenziare le cellule staminali embrionali umane per NKX6-1 + progenitori pancreatici in vitro. Questo protocollo può essere applicata ad una varietà di linee di cellule staminali pluripotenti umane.
Abstract
cellule staminali pluripotenti hanno la capacità di auto rinnovarsi e differenziarsi in molteplici linee cellulari, che li rende una fonte interessante per la generazione di cellule progenitrici pancreatiche che può essere utilizzato per lo studio di e futuro trattamento del diabete. Questo articolo descrive un protocollo di differenziazione a quattro stadi progettato per generare cellule progenitrici del pancreas da cellule staminali embrionali umane (hESC). Questo protocollo può essere applicato a un numero di (HPSC) linee di cellule staminali pluripotenti umana. L'approccio adottato per generare cellule progenitrici del pancreas è quello di differenziare hESC per modellare con precisione le fasi chiave dello sviluppo del pancreas. Questo inizia con l'induzione della endoderma definitiva, che si ottiene coltivando le cellule in presenza di Activin A, fattore base di crescita dei fibroblasti (bFGF) e CHIR990210. Ulteriore differenziazione e patterning con fibroblasti fattore di crescita 10 (FGF10) e Dorsomorphin genera cellule simili a foregut posteriore. L'aggiunta di RetinOico, NOGGIN, SANT-1 e FGF10 differenzia le cellule posteriore foregut in cellule caratteristici di endoderma al pancreas. Infine, la combinazione di Epidermal Growth Factor (EGF), nicotinammide e NOGGIN porta alla generazione efficiente di cellule PDX1 + / + NKX6-1. Citometria a flusso viene eseguita per confermare l'espressione di marcatori specifici nelle fasi chiave dello sviluppo del pancreas. I Pdx1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici al termine della fase 4 sono in grado di generare cellule beta mature sul trapianto in topi immunodeficienti e possono essere ulteriormente differenziati per generare cellule che producono insulina in vitro. Così, l'efficiente generazione di PDX1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici, come dimostrato in questo protocollo, è di grande importanza in quanto fornisce una piattaforma per studiare lo sviluppo del pancreas umano in vitro e fornisce una fonte di cellule con il potenziale di differenziazione per le cellule beta che potrebbe eVentually essere utilizzato per il trattamento del diabete.
Introduction
La prevalenza del diabete è in aumento e, secondo la Canadian Diabetes Association, si stima che oltre 11 milioni di persone in Canada sono diabetici o prediabetici, con il 5-10% di questi individui che hanno il diabete di tipo 1 (diabete di tipo 1) 1. T1D è una malattia autoimmune che è causata dalla distruzione delle cellule beta produttrici di insulina che si trovano all'interno delle isole di Langerhans. Attualmente, le persone che vivono con diabete di tipo 1 richiedono fonti esogene di insulina 2. Nonostante i progressi nella terapia insulinica, i pazienti T1D continuano ad avere un momento difficile che regola i livelli di glucosio nel sangue e continua a soffrire sia ipo e iperglicemia. Una forma promettente trattamento per ripristinare la normoglicemia nel diabete di tipo 1 è l'uso di cellule staminali embrionali umane (hESC), che potrebbero essere utilizzati per generare una quantità illimitata di cellule produttrici di insulina beta sia in vivo che in vitro 3,
Il tentativo più riuscito a generare le cellule produttrici di insulina dalle hESC in vitro è di ricapitolare gli eventi embrionali che si verificano durante lo sviluppo del pancreas 4, 5. Ciò comporta la manipolazione di vie di segnalazione distinti per modellare con precisione le fasi essenziali del pancreas in via di sviluppo. Sviluppo pancreas inizia con l'induzione della endoderma definitiva, che si caratterizza per l'espressione di CXCR4 e CD117 (c-KIT) 8, 9. regolazione precisa della definitorganizzazione endoderma ive è necessaria per la formazione del tubo intestinale, che poi subisce anteriore-posteriore patterning e ventrale-dorsale. La dorsale e gemme pancreatico ventrale emergono dalla regione del foregut posteriori che esprime il gene homeobox pancreatiche e duodenali (Pdx1), che è necessario per lo sviluppo del pancreas 10. Il fusibile dorsale e ventrale gemme per formare il pancreas, che poi viene ampiamente rimodellamento epiteliale e di espansione 11. L'impegno per il sistema endocrino e esocrina lignaggio è accompagnata dalla generazione di cellule progenitrici multipotenti (PPM) che esprimono, tra gli altri, i fattori di trascrizione Pdx1, Nkx6.1 e Ptf1a 12, 13. PPM che diventeranno cellule endocrine e duttali continuano ad esprimere Nkx6-1 riducendo espressione Ptf1a. Contrariamente a questo, le cellule esocrine lignaggio perderanno expression di Nkx6-1 e mantenere Ptf1a espressione 12.
Il fattore di trascrizione Nkx6-1 ha un ruolo chiave nello sviluppo del pancreas, in particolare durante la differenziazione delle cellule progenitrici endocrine di beta cellule. Come descritto in precedenza, l'eliminazione di Nkx6-1 risultati in formazione ridotta di cellule beta durante lo sviluppo del pancreas 14. Pertanto, generando cellule ß che producono insulina sia in vitro che in vivo richiede l'induzione efficiente Nkx6-1.
Recentemente abbiamo sviluppato un protocollo per generare in modo efficiente Pdx1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici da hPSCs. Questi progenitori pancreatici HPSC-derivati generano cellule beta mature su trapianto in topi immunodeficienti 3. Il protocollo differenziazione può essere diviso in 4 stadi caratteristici di: 1) induzione endoderma definitivo, 2) posteriori foregut patterning, 3) le specifiche del pancreas e 4) l'induzione NKX6-1. Qui forniamo una descrizione dettagliata di ogni fase della differenziazione diretto.
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Protocol
1. preparazione di soluzioni e supporti
NOTA: Preparare tutti i supporti per colture cellulari in un ambiente sterile. Media deve essere fatto e utilizzato immediatamente. Dettagli reagenti sono forniti nella tabella materiali.
- differenziazione media
- Preparare Giorno 0 differenziazione di media: RPMI medio con 1% glutammina, 2 micron CHIR 99021, 100 ng / ml Activin A, 10 4 M MTG.
- Preparare Giorno 1-2 Differenziazione di media: RPMI medio con 1% glutammina, 100 ng / ml Activin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, Acid 50 mg / ml ascorbico.
- Preparare Giorno 3-5 Differenziazione di media: RPMI medio con 1% glutammina, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 micron Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
- Preparare Giorno 6-7 Differenziazione di media: DMEM con 1% glutammina, 1% B27, 50 mg / ml di acido ascorbico, 50 ng / ml FGF10, 0,25 micron SANT-1, 2 mM acido retinoico, 50 ng / ml NOGGIN.
NOTA: retinoicoAcido deve essere aggiunto ai media dell'ultimo e dei media deve essere protetto dalla luce per evitare la degradazione ossidativa 15. - Preparare Giorno 8-12 Differenziazione di media: DMEM con 1% glutammina, 1% B27, 50 mg / ml di acido ascorbico, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nicotinamide.
- Preparare FACS buffer: 10% FBS in PBS, meno calcio e magnesio.
2. HESC Differenziazione
NOTA: HESC vengono scongelati, diversi passaggi e ampliato di topo irradiati fibroblasti embrionali in presenza di un supporto KOSR-based integrato con bFGF 16. HESCs sono pronti per la differenziazione quando le cellule raggiungono 80-95% di confluenza. In questo momento le colonie dovrebbero essere grandi con bordi definiti e un 'a forma di cupola' struttura (Figura 1A). Tutti coltura cellulare viene eseguita in fondo piatto, tessuto di coltura trattata piastre rivestite con 0,1% di gelatina. Tipicamente, le cellule sono coltivate in 6 opiastre da 12 pozzetti, in volumi dei media di 2 ml o 1 ml, rispettivamente.
- Il giorno 0, iniziare la differenziazione sostituendo il materiale KOSR-based con Giorno 0 Differenziazione Media.
- Nei giorni 1 e 2, agitare delicatamente la piastra per rimuovere tutte le cellule morte dal monostrato prima aspirazione. Sostituire con il giorno 1-2 Differenziazione Media.
- Il giorno 3, Celle di raccolta per citometria a flusso. Se le cellule esprimono più del 90% CXCR4 + / CD117 +, procedere al punto 2.4.
- Nei giorni 3 e 5, agitare delicatamente la piastra per rimuovere tutte le cellule morte dal monostrato prima di aspirazione. Sostituire con il giorno 3-5 Differenziazione Media.
- Nei giorni 6 e 7, sostituirlo con il giorno 6-7 Differenziazione Media.
- Nei giorni 8, 10 e 12, sostituire con la Giornata 8-12 Differenziazione Media.
- Il giorno 13, Celle di raccolta per citometria a flusso per determinare PDX1 ed espressione NKX6-1.
3. Cellule di raccolta per l'analisi Citometria a Flusso
- Separa celle consoluzione di tripsina commerciale 1x secondo il protocollo del produttore e incubare a 37 ° C per 3 min.
- Rimuovere la soluzione tripsina commerciale e sospendere nuovamente le cellule singole a 1.000 ml FACS tampone con 30 microlitri DNasi I.
- Celle filtranti con un colino cella di rete di nylon 35 micron e trasferire in una provetta.
- cellule centrifugare a 455 xg per 5 min. Preparare le cellule sia per la colorazione dal vivo o fisso.
4. La colorazione per citometria a flusso
- Flusso di preparazione per la colorazione dal vivo il giorno 3
- Risospendere le cellule in 1.000 ml FACS tampone. Trasferimento 200 ml (circa 1-3 x 10 5 cellule) in due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (per entrambi i campioni non colorati e macchiati).
- Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
- Macchia con anticorpi primari coniugati, CXCR4: APC e CD117: PE (vedi Tabella M ateriali) per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
- Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
- campioni risospendere in 100 microlitri FACS tampone.
- Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
- Risospendere ogni campione e trasferimento in un volume totale di 300-500 microlitri FACS tampone a 1 ml provette micro o 5 ml tubi a fondo rotondo.
- Campioni eseguito sul citofluorimetro 17. Se i campioni non possono essere eseguite immediatamente, conservare a 4 ° C al riparo dalla luce.
- Flusso di preparazione per la colorazione fissato il giorno 13
- Risospendere il pellet di cellule in soluzione di fissaggio / permeabilizzazione commerciale per 24 ore a 4 ° C.
- Centrifugare il campione a 455 xg per 5 min. Risospendere in 400 ml soluzione di Perm / Wash.
- Trasferire 200 microlitri del campione (circa 0,5-1 x 10 6 cellule) per twO pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (per il controllo IgG e PDX1 / NKX6-1 colorazione). Centrifugare a 931 xg per 2 minuti.
- Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri soluzione di Perm / Wash contenente anti-PDX1 e gli anticorpi di controllo primario o isotipo anti--NKX6-1 (vedi Materiali Tavolo). Incubare per una notte a 4 ° C.
- Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra. campioni risospendere in 100 microlitri soluzione di Perm / Wash.
- Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
- Risospendere i campioni in 100 microlitri Perm / Wash contenenti anticorpi secondari a temperatura ambiente per 1 ora al riparo dalla luce.
- Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
- campioni risospendere in 100 microlitri Perm Solution / lavaggio.
- Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
- rappresentantemangiare passo 4.2.9 e 4.2.10.
- Risospendere ogni campione e trasferimento in un volume totale di 300-500 microlitri FACS tampone a 1 ml provette micro o 5 ml tubi a fondo rotondo.
- Campioni eseguito sul citofluorimetro 17. Se i campioni non possono essere eseguite immediatamente, conservare a 4 ° C al riparo dalla luce.
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Representative Results
Generazione efficiente di progenitori pancreatici basa sulla corretta crescita e il mantenimento di cellule indifferenziate seguita dalla precisa aggiunta di specifiche molecole di segnalazione durante il protocollo di differenziazione, come illustrato nello schema di Figura 1A. Il giorno 0, cellule indifferenziate dovrebbe essere 80-95% confluenti e le colonie devono avere bordi definiti (Figura 1A). Durante la fase 1, i media sarà probabilmente apparire torbida dopo la morte delle cellule è abbastanza comune in questa fase. Entro la fine della fase 1, le cellule dovrebbero co-esprimono i marcatori endoderma definitivo, CXCR4 e CD117, in una percentuale superiore al 90% (Figura 1B).
Come cellule si differenziano in tutto il protocollo a quattro stadi, i loro cambiamenti morfologia da un aspetto allungato ovale come (osservati nelle fasi 1 e 2), cellule rotonde più piccole (come visto nelle fasi 3 e 4) (
Figura 1: Schema di differenziazione progenitore pancreatiche da hESC e dati di supporto. (A) Schema di induzione di progenitore del pancreas da hESC. Giorno di differenziazione, Sviluppo deil palco, mezzi di base, e le citochine aggiunto in ogni fase sono inclusi. Qui di seguito, vengono mostrati immagini contrasto di fase nelle fasi chiave di differenziazione del pancreas. In tutte le figure rappresentative, le cellule H1 sono stati differenziati in base al protocollo di differenziazione 4 stadi descritto sopra. Giorno 0, hESC indifferenziato; Fase 1, Endoderma definitiva; Fase 2, posteriore Foregut; Fase 3, PDX1 + Endoderma; Fase 4, NKX6-1 + endoderma / progenitori pancreatici. Barra di scala = 200 micron. (B) 3 ° giorno rappresentante citometria a flusso Terreni in CXCR4: PE e CD117: APC anticorpi colorazione. campione senza macchia a sinistra, campione colorato sulla destra. (C) 13 ° giorno rappresentante trama citometria a flusso per le cellule progenitrici del pancreas stadio-4 derivati che esprimono NKX6-1 e PDX1. Controllo IgG a sinistra, campione colorato sulla destra. hESC - cellule staminali embrionali umane, ACT A - Activin A; bFGF - fattore di crescita dei fibroblasti di base, FGF10 - fattore di crescita dei fibroblasti 10, DM - dorsomorphin, NOG - NOGGIN, RA - acido retinoico, EGF - epidermal growth factor, NA - nicotinamide. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Generando con successo NKX6-1 + progenitori pancreatici da hPSCs in vitro si basa su l'uso di colture di alta qualità di hPSCs e differenziazione diretto che coinvolgono la regolazione precisa delle specifiche vie di segnalazione che regolano principali fasi di sviluppo durante lo sviluppo del pancreas. Sebbene questo protocollo può essere usato per indurre robusta espressione di NKX6-1 attraverso una varietà di linee HPSC come precedentemente indicata 3, per assicurare la generazione NKX6-1 efficiente le seguenti considerazioni dovrebbero essere fatte. È importante che tutta la preparazione coltura cellulare e supporto viene eseguita in un ambiente sterile per evitare contaminazioni. È importante che le colonie hESC hanno raggiunto appropriata confluenza e non hanno cominciato a differenziarsi prima di iniziare giorno 0 di differenziazione. Partendo differenziazione hESC non ottimali possono causare induzione inefficiente del endoderma e procedimento elaborazione definitivaAl fasi. Questo è il motivo per cui è fondamentale per analizzare le cellule a giorno 3 mediante citometria di flusso per garantire efficiente induzione di endoderma definitivo. La percentuale di doppia CXCR4 positivo + cellule CD117 + al giorno 3 dovrebbe essere superiore al 90% per un efficiente sviluppo del pancreas 3. Se la percentuale di cellule che esprimono sia CXCR4 e CD117 è inferiore al 90%, efficiente induzione alla progenitori pancreatici sarà probabilmente compromessa (risultati non mostrati). Inoltre, contrariamente a quanto precedentemente pubblicato, non è necessario lavare le cellule con RPMI prima di alimentare con stadio 1 media 16. agitazione delicata della piastra prima aspirazione del supporto è sufficiente rimuovere le cellule morte dalla monostrato.
L'aggiunta di dorsomorphin allo stadio 2 ha dimostrato di essere richiesto solo per specifiche linee HPSC 18. Pertanto, è importante determinare se dorsomorphin è necessaria quando si lavora con di Linee HPSC fferent. Inoltre, la durata della fase 3 è stato dimostrato essere critico per specificare sia cellule progenitrici monohormonal o polyhormonal ed è line-dipendente 3 celle. Così, quando si lavora con una nuova linea HPSC è importante determinare la durata che le cellule devono essere coltivate in Fase 3 mezzi per determinare le condizioni ottimali per NKX6-1 induzione. Per determinare questo, le cellule devono essere coltivate in fase 3 mezzi per 1-4 giorni e analizzati 5 giorni più tardi mediante citometria di flusso per l'espressione NKX6-1.
Generando in modo efficiente le popolazioni arricchite in cellule NKX6-1 + è importante, come Nkx6-1 è fondamentale per lo sviluppo βcell 14. Mentre altri hanno sviluppato protocolli che possono differenziare hESC alle cellule NKX6-1 + (cellule H1-derivato circa il 60% NKX6-1 + e cellule HUES8 di derivazione 55% PDX + / NKX6-1 +) 4,"xref"> 5, il nostro metodo genera costantemente> cellule Pdx1 H1-derivato 80% + / + NKX6-1. Tuttavia, il nostro protocollo di differenziazione si basa sull'utilizzo di fibroblasti embrionali di topo, che limita il suo uso per la ricerca solo, come dobbiamo ancora ottimizzare il metodo Good Manufacturing Practices. Anche se non abbiamo cercato di cryopreserve nostre cellule stadio-4 derivati Pdx1 + / + NKX6-1, questo approccio è stata eseguita con successo da Schulz et al. , Che ha dimostrato che crioconservati aggregati pancreatiche erano in grado di mantenere la loro funzione in vivo 19.
In questo articolo descriviamo un protocollo a 4 stadi per generare in modo efficiente Pdx1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici da una serie di linee HPSC. Differenziando HPSC attraverso quattro fasi principali dello sviluppo del pancreas, questo protocollo fornisce un modello per studiare lo sviluppo del pancreas umano in vitro. Furthermore, poiché le cellule Pdx1 + / + NKX6-1 hanno il potenziale per generare cellule che producono insulina sia in vivo che in vitro (dati non riportati) 3, 4, 5, il PDX1 hESC derivate + / + NKX6-1 pancreatica progenitori forniscono una possibile fonte per il trattamento del diabete.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo manoscritto è stato sostenuto da un finanziamento della Toronto Generale e Fondazione occidentale e il premio Graduate Banting & Best Diabetes Centre-University Health Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
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