Summary
Her beskriver vi en fire-trinns protokoll for å skille humane embryonale stamceller til NKX6-1 + pancreatic stamceller in vitro. Denne protokollen kan brukes på en rekke forskjellige humane pluripotent stamcelle linjer.
Abstract
Pluripotente stamceller har evnen til å fornye seg selv og differensiere til flere linjene, noe som gjør dem til et attraktivt kilde for generering av bukspyttkjertelen stamceller som kan anvendes for å studere og fremtidig behandling av diabetes. Denne artikkelen skisserer en fire-trinns differensiering protokoll utviklet for å generere bukspyttkjertelen stamceller fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs). Denne protokollen kan anvendes på et antall av human flerpotent stamcelle (hPSC) linjer. Tilnærmingen tatt å generere bukspyttkjertelen stamceller er å skille hESCs å nøyaktig modellere viktige faser av bukspyttkjertelen utvikling. Dette begynner med induksjonen av definitive endoderm, noe som oppnås ved dyrking av cellene i nærvær av aktivin A, basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og CHIR990210. Ytterligere differensiering og mønstring med Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) og Dorsomorphin genererer celler som ligner den bakre forutgående. Tilsetningen av Retinsyre, noggin, SANT-en og FGF10 skiller posterior forutgående celler i celler som er karakteristiske for bukspyttkjertel endoderm. Til slutt, en kombinasjon av epidermal vekstfaktor (EGF), nikotinamid og noggin fører til effektiv generering av PDX1 + / NKX6-1 + -celler. Strømningscytometri er utført for å bekrefte ekspresjonen av spesifikke markører på viktige faser av pankreatisk utvikling. De PDX1 + / + NKX6-1 bukspyttkjertelen progenitorceller ved slutten av trinn 4 er i stand til å generere modne p-celler ved transplantasjon inn i immunodefekte mus og kan bli ytterligere differensieres for å generere insulinproduserende celler in vitro. Således er effektiv generering av PDX1 + / + NKX6-1 bukspyttkjertelen stamceller, som vist i denne protokollen, er av stor betydning da det tilveiebringer en plattform for å studere bukspyttkjertelen utvikling human in vitro og gir en kilde for celler med potensiale til å differensiere til betaceller som kunne EVentually brukes til behandling av diabetes.
Introduction
Forekomsten av diabetes er økende og i henhold til den kanadiske Diabetes Association, er det anslått at over 11 millioner mennesker i Canada er diabetiker eller prediabetic, med 5-10% av disse personene som har type 1 diabetes (T1D) 1. T1D er en autoimmun sykdom som er forårsaket av ødeleggelse av de insulinproduserende p-celler som befinner seg innenfor de Langerhanske øyer. Foreløpig personer som lever med T1D krever eksogene kilder insulin to. Til tross for fremskritt i insulinbehandling, T1D pasientene fortsetter å ha en vanskelig tid å regulere blodsukkeret og fortsette å lide, både hypo- og hyperglykemi. En lovende form for behandling for å gjenopprette normoglykemi i T1D er bruken av humane embryonale stamceller (hESCs), som kan brukes til å generere en ubegrenset tilførsel av insulinproduserende beta-celler både in vivo og in vitro 3,
De mest vellykkede forsøk på å generere insulinproduserende celler fra hESCs in vitro er å rekapitulere de embryonale hendelser som oppstår i løpet av bukspyttkjertelen utvikling 4, 5. Dette innebærer manipulering av forskjellige signalveier til nøyaktig modellere viktige faser av utviklings bukspyttkjertelen. Pankreatisk utvikling begynner med induksjonen av definitive endoderm, som er kjennetegnet ved ekspresjon av CXCR4 og CD117 (c-KIT) 8, 9. Presis regulering av definitive endoderm organisasjon er nødvendig for dannelsen av tarmen rør, som deretter gjennomgår anterior-posterior til-og ventral-dorsal mønster. Den dorsale og ventrale pancreatic knopper komme ut av området for den bakre forutgående som uttrykker bukspyttkjertelen og duodenal homeobox gen (Pdx1), som er nødvendig for utvikling pancreatic 10. Rygg og ventral knopper smelter sammen til bukspyttkjertelen, som deretter gjennomgår omfattende epitel ombygging og utvidelse 11. Forpliktelse til det endokrine og eksokrine avstamning er ledsaget av den generasjonen av multipotente stamceller (MPCS) som uttrykker blant andre transkripsjonsfaktorer Pdx1, Nkx6.1 og Ptf1a 12, 13. MPCS som vil bli endokrine og duktale cellene fortsetter å uttrykke Nkx6-1 samtidig redusere Ptf1a uttrykk. I motsetning til dette, vil eksokrine avstamning cellene mister expression av Nkx6-1 og vedlikeholde Ptf1a uttrykk 12.
Transkripsjonsfaktor Nkx6-1 har en nøkkelrolle i bukspyttkjertelen utvikling, spesielt i løpet av differensiering av endokrine stamceller til betaceller. Som tidligere beskrevet, delesjon av Nkx6-1 resulterer i nedsatt dannelse av p-cellene i løpet av pankreatisk utvikling 14. Derfor genererer insulinproduserende beta-celler både in vitro og in vivo krever effektiv induksjon av Nkx6-1.
Vi har nylig utviklet en protokoll for å effektivt generere PDX1 + / NKX6-1 + bukspyttkjertelen stamfedre fra hPSCs. Disse hPSC-avledet bukspyttkjertelen stamfedre generere modne betaceller ved transplantasjon inn immunsvikt mus tre. Differensieringen protokollen kan deles inn i fire stadier karakteristiske for: 1) definitiv endoderm induksjon, 2) bakre forutgående mønster, 3) pankreatisk beskrivelsen og 4) NKX6-1 induksjon. Her gir vi en detaljert beskrivelse av hvert trinn i den rettede differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Solutions og Media
MERK: Klargjør alle medier for cellekultur i et sterilt miljø. Media må gjøres og brukes umiddelbart. Reagent detaljer er gitt i Materials tabell.
- differensiering Media
- Forbered Dag 0 Differensiering Media: RPMI medium med 1% glutamin, 2 mikrometer tsjir 99021, 100 ng / ml activin A, 10 4 M MTG.
- Forbered Dag 1-2 Differensiering Media: RPMI medium med 1% glutamin, 100 ng / ml activin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 mikrogram / ml Ascorbic Acid.
- Forbered Dag 3-5 Differensiering Media: RPMI medium med 1% glutamin, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 mikrometer Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
- Forbered Dag 6-7 Differensiering Media: DMEM med 1% glutamin, 1% B27, 50 ug / ml askorbinsyre, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM SANT-1, 2 uM retinsyre, 50 ng / ml noggin.
MERK: RetinoicAcid bør legges til media siste og media bør beskyttes mot lys for å forhindre oksidativ degradering 15. - Forbered Dag 8-12 Differensiering Media: DMEM med 1% glutamin, 1% B27, 50 ug / ml askorbinsyre, 50 ng / ml noggin, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nikotinamid.
- Forbered FACS-buffer: 10% FBS i PBS, minus kalsium og magnesium.
2. hESC Differensiering
MERK: hESC er tint, passert og utvidet på bestrålte mus embryonale fibroblaster i nærvær av en KOSR-baserte medier supplert med bFGF 16. HESCs er klare for differensiering når cellene når 80-95% konfluens. På denne tiden koloniene bør være stor med definerte grenser og en domelike 'struktur (figur 1A). Alle cellekultur er utført i flatbunnede, vevs kultur behandlet plater belagt med 0,1% gelatin. Typisk, blir cellene dyrket i 6 eller12-brønners plater, i medievolum på 2 ml eller 1 ml, henholdsvis.
- På dag 0, begynner differensiering ved å erstatte KOSR baserte medier med Dag 0 Differensiering Media.
- På dag 1 og 2, rist platen for å fjerne eventuelle døde celler fra monolaget før aspirere. Erstatt med Dag 1-2 Differensiering Media.
- På dag tre, høste celler for flowcytometri. Hvis cellene uttrykker mer enn 90% CXCR4 + / CD117 +, går du videre til trinn 2.4.
- På dag 3 og 5, rist platen for å fjerne eventuelle døde celler fra monolaget forut for aspirering. Erstatt med Dag 3-5 Differensiering Media.
- På dager 6 og 7, erstatte med Dag 6-7 Differensiering Media.
- På dager 8, 10 og 12, erstatte med Dag 8-12 Differensiering Media.
- På dag 13, høste celler for flowcytometri for å bestemme PDX1 og NKX6-1 uttrykk.
3. Høsting Cells for flowcytometrisystemer Analysis
- Distansere celler med1x kommersiell trypsinoppløsning i henhold til produsentens protokoll og inkuber ved 37 ° C i 3 minutter.
- Fjern kommersielle trypsin løsning og resuspender enkeltceller i 1000 mL FACS buffer med 30 mL DNase I.
- Filter celler ved hjelp av en 35 mikrometer nylon mesh celle sil og overføring til et mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger cellene ved 455 xg i 5 min. Forbered celler for enten bor eller fast farging.
4. Farging for flowcytometrisystemer
- Flow forberedelse for live flekker på dag 3
- Resuspender celler i 1000 ul FACS-buffer. Overføre 200 ul (ca. 1-3 x 10 5 celler) i to brønner på en 96-brønns plate (både for ufargete og farget prøver).
- Sentrifuger plate på 931 x g i 2 min. Fjern supernatanten ved å snu platen.
- Flekk med primære konjugerte antistoffer, CXCR4: APC og CD117: PE (se M aterials Table) for tre0 min ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
- Sentrifuger plate på 931 x g i 2 min. Fjern supernatanten ved å snu platen.
- Resuspender prøvene i 100 ul FACS-buffer.
- Sentrifuger plate på 931 x g i 2 min. Fjern supernatanten ved å snu platen.
- Resuspender hver prøve og overføring i et totalvolum på 300-500 ul FACS-buffer til 1 ml mikrotestrør eller 5 ml rundbunnet rør.
- Kjør prøver på strømningscytometeret 17. Hvis prøvene ikke kan kjøres umiddelbart, oppbevar ved 4 ° C beskyttet mot lys.
- Flow forberedelse til faste flekker på dag 13
- Resuspender cellepelleten i kommersiell fiksering / permeabiliseringen løsning i 24 timer ved 4 ° C.
- Sentrifuger prøven ved 455 xg i 5 minutter. Resuspender i 400 ul Perm / vaskeløsning.
- Overfør 200 ul av prøven (ca. 0,5-1 x 10 celler 6) for å two brønner i en 96-brønns plate (for IgG-kontroll og PDX1 / NKX6-1 farging). Sentrifuger ved 931 xg i 2 min.
- Resuspender cellepelletene i 100 ul Perm / vaskeløsning inneholdende anti-PDX1 og anti-NKX6-1 primær eller isotype kontroll-antistoff (se Materialer tabell). Inkuber over natten ved 4 ° C.
- Sentrifuger plate på 931 x g i 2 min. Fjern supernatanten ved å snu platen. Resuspender prøver i 100 ul Perm / vaskeløsning.
- Sentrifuger plate på 931 x g i 2 min. Fjern supernatanten ved å snu platen.
- Resuspender prøvene i 100 ul Perm / Wash inneholdende sekundære antistoffer ved romtemperatur i 1 time beskyttet mot lys.
- Sentrifuger plate på 931 x g i 2 min. Fjern supernatanten ved å snu platen.
- Resuspender prøver i 100 ul Perm / vaskeløsning.
- Sentrifuger plate på 931 x g i 2 min. Fjern supernatanten ved å snu platen.
- Repspise trinn 4.2.9 og 4.2.10.
- Resuspender hver prøve og overføring i et totalvolum på 300-500 ul FACS-buffer til 1 ml mikrotestrør eller 5 ml rundbunnet rør.
- Kjør prøver på strømningscytometeret 17. Hvis prøvene ikke kan kjøres umiddelbart, oppbevar ved 4 ° C beskyttet mot lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiv produksjon av pankreas progenitorceller er avhengig av riktig vekst og vedlikehold av udifferensierte celler, etterfulgt av den nøyaktige tilsetning av bestemte signalmolekyler under differensiering protokollen, som vist i skjematisk i figur 1A. På dag 0, bør udifferensierte celler være 80-95% konfluens og kolonier bør ha definerte kanter (figur 1A). Under Trinn 1, vil medie sannsynlig uklart ettersom celledød er ganske vanlig på dette stadiet. Ved slutten av trinn 1, bør celler co-express definitive endoderm markører, CXCR4 og CD117, på en del større enn 90% (figur 1B).
Som cellene differensieres i løpet av fire-trinns protokoll, deres morfologi endres fra en langstrakt, ovallignende utseende (observert ved trinn 1 og 2) til mindre, rundere-celler (som sett på stadiene 3 og 4) (
Figur 1: Skjematisk av bukspyttkjertelen stamfar differensiering fra hESCs og støtte data. (A) Skjematisk av induksjon av bukspyttkjertelen stamfar fra hESCs. Day of differensiering, developmentâl scenen, base media, og cytokinene lagt på hvert trinn er inkludert. Nedenfor er fase kontrast på de viktigste fasene av bukspyttkjertelen differensiering vist. I alle representative tall, ble H1 celler differensiert i henhold til fire-trinns differensiering protokollen avbildet ovenfor. Dag 0, udifferensiert hESCs; Stage 1, Definitive endoderm; Stage 2, Posterior forutgående; Stage 3, PDX1 + endoderm; Stage 4, NKX6-1 + endoderm / bukspyttkjertelen stamfedre. Scale bar = 200 mikrometer. (B) Dag 3 representant flowcytometri tomter for CXCR4: PE og CD117: APC antistoff farging. Ufarget prøven på venstre, farget prøven på høyre side. (C) Dag 13 representative flowcytometri tomten for scene-4 avledet bukspyttkjertelen stamceller uttrykker NKX6-1 og PDX1. IgG kontroll på venstre, farget prøven på høyre side. hESC - humane embryonale stamceller, handle - activin A; bFGF - basisk fibroblast vekstfaktor, FGF10 - fibroblast vekstfaktor 10, DM - dorsomorphin, NOG - noggin, RA - retinsyre, EGF - epidermal vekstfaktor, NA - nikotinamid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vellykket generere NKX6-1 + bukspyttkjertelen stamfedre fra hPSCs in vitro er avhengig av bruk av høykvalitets kulturer av hPSCs og rettet differensiering involverer presis regulering av spesifikke signalveier som styrer viktige utviklingsstadier under bukspyttkjertelen utvikling. Selv om denne protokollen kan brukes til å indusere robust uttrykk for NKX6-1 tvers av en rekke hPSC linjer som tidligere vist 3, for å sikre effektiv NKX6-1 generasjon følgende hensyn bør gjøres. Det er viktig at alle cellekulturmedier, og fremstillingen blir utført i et sterilt miljø for å hindre forurensning. Det er viktig at hESC koloniene har nådd passende konfluens og har ikke begynt å skille før begynnelsen dag 0 av differensiering. Starter differensiering med hESCs som ikke er optimal kan resultere i ineffektiv induksjon av den definitive endoderm og fortsetter utviklingal etapper. Dette er grunnen til at det er viktig å analysere celler på dag 3 ved strømningscytometri for å sikre effektiv induksjon av definitive endoderm. Prosentandelen av dobbel positiv CXCR4 + CD117 + celler på dag 3 skal være større enn 90% for effektiv utvikling pancreatic 3. Dersom prosentandelen av celler som uttrykker både CXCR4 og CD117 er lavere enn 90%, vil effektiv induksjon i bukspyttkjertelen progenitorceller sannsynligvis bli kompromittert (resultater ikke vist). Videre, i motsetning til hva som tidligere ble publisert, er det ikke nødvendig å vaske cellene med RPMI før mating med stadium 1 media 16. Forsiktig risting av platen forut for aspirering av mediet er tilstrekkelig til å fjerne døde celler fra monolaget.
Tilsetningen av dorsomorphin i trinn 2 har vist seg å bare være nødvendig for bestemte hPSC linjer 18. Derfor er det viktig å finne ut om dorsomorphin er nødvendig når man arbeider med di fferent hPSC linjer. I tillegg er varigheten av trinn 3 er vist å være kritisk for å angi enten monohormonal eller polyhormonal progenitorceller og er cellelinje avhengig 3. Så når du arbeider med en ny hPSC linjen er det viktig å bestemme varigheten at cellene skal dyrkes i Stage 3 media for å bestemme de optimale forhold for NKX6-1 induksjon. For å finne ut dette, bør cellene dyrkes i Stage 3 media for 1-4 dager og analysert 5 dager senere av flowcytometri for NKX6-1 uttrykk.
Effektivt generere populasjoner beriket i NKX6-1 + celler er viktig, som Nkx6-1 er avgjørende for βcell utvikling 14. Mens andre har utviklet protokoller som kan skille hESC til NKX6-1 + celler (ca 60% H1-avledet NKX6-1 + celler og 55% HUES8-avledet PDX + / NKX6-1 + celler) 4,"xref"> 5, vår metode konsekvent genererer> 80% H1-avledet PDX1 + / NKX6-1 + celler. Men avhengig vår differensiering protokoll om bruk av mus embryonale fibroblaster, som begrenser bruken til forsknings bare, som vi har ennå til å optimalisere metoden i Good Manufacturing Practices. Selv om vi ikke har forsøkt å cryopreservere våre stadium-4 avledet PDX1 + / NKX6-1 + -celler, og denne fremgangsmåten blitt utført av Schulz et al. , Som viste at cryopreserved bukspyttkjertelen aggregater var i stand til å beholde sin funksjon in vivo 19.
I denne beskrivelsen beskriver vi et fire-trinns protokoll til effektivt å generere PDX1 + / + NKX6-1 bukspyttkjertelen progenitorceller fra en rekke hPSC linjer. Ved å skille hPSC gjennom fire viktige faser av pankreatisk utvikling, denne protokollen tilveiebringer en modell for å studere utviklingen av humane bukspyttkjertel in vitro. Furthermore, siden PDX1 + / NKX6-1 + celler har potensial til å generere insulinproduserende celler både in vivo og in vitro (data ikke vist) 3, 4, 5, den hESC-avledede PDX1 + / + NKX6-1 pankreatisk progenitorceller tilveiebringe en mulig kilde for behandling av diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette manuskriptet ble støttet av midler fra Toronto Generelt og Vest-stiftelsen og Banting og Best Diabetes Centre-University Health Network Graduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
