Summary
ここでは、in vitroで NKX6-1 +膵臓前駆細胞にヒト胚性幹細胞を区別するために4段階のプロトコルを記述します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞株の多様に適用することができます。
Abstract
多能性幹細胞は、自己に更新し、それらの研究および糖尿病の将来の治療のために使用することができる膵臓前駆細胞の生成のための魅力的なソース作り、複数の系統に分化する能力を有します。この記事では、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）から膵臓前駆細胞を生成するように設計された4段階の分化プロトコルの概要を説明します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞（HPSC）行数に適用することができます。膵臓前駆細胞を生成するために取られたアプローチは、正確に膵臓発生の主要な段階をモデル化するためにヒトES細胞を区別することです。これは、アクチビンA、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）およびCHIR990210の存在下で細胞を培養することによって達成される胚体内胚葉の誘導で始まります。線維芽細胞増殖因子10（FGF10）とドルソモルフィンとのさらなる分化とパターニングは、後部前腸に似た細胞を生成します。レチンの追加OIC酸、ノギンは、SANT-1およびFGF10は膵臓内胚葉に特徴的な細胞内に後部前腸細胞を区別します。最後に、上皮成長因子（EGF）の組合せは、ニコチンアミドとノギンは、PDX1 + / NKX6-1 +細胞の効率的な生成につながります。フローサイトメトリーは、膵臓の発達の重要な段階に特異的なマーカーの発現を確認するために行われます。ステージ4の終わりにPDX1 + / NKX6-1 +膵臓前駆細胞は、免疫不全マウスへの移植時に、成熟β細胞を生成することができ、さらに、インビトロでのインスリン産生細胞を生成するように分化させることができます。それは、in vitroでヒト膵臓の開発を研究するためのプラットフォームを提供し、に分化する能力を有する細胞の供給源を提供するようしたがって、このプロトコルで示されているようにPDX1 + / NKX6-1 +膵臓前駆細胞の効率的な生成は、非常に重要ですEVができβ細胞entually糖尿病の治療のために使用されます。
Introduction
糖尿病の有病率は増加しており、カナダ糖尿病協会によると、1型糖尿病（T1D）1を持つこれらの個体5〜10％の、カナダで1100万人が糖尿病または前糖尿病であると推定されています。 T1Dは、ランゲルハンス島の中に配置されているインスリン産生β細胞の破壊により引き起こされる自己免疫疾患です。現在、T1Dとの生活の個人は、インスリン2の外因性の源を必要とします。インスリン療法の進歩にもかかわらず、T1D患者は、血糖値を調節する困難な時期を持っており、ハイポや高血糖の両方を苦しみ続けるために続けています。 T1Dにおいて正常血糖を回復させる治療の有望な形は、in vivoおよびin vitro 3 の両方で β細胞のインスリン産生の無制限の供給を生成するために使用することができるヒト胚性幹細胞（hESC）の使用であります
in vitroでのヒトES細胞からのインスリン産生細胞の生成で最も成功した試みは、膵臓の開発4、5中に発生する胚のイベントを再現することです。これは、正確に開発膵臓の主要な段階をモデル化するための明確なシグナル伝達経路の操作を必要とします。膵臓の開発は、CXCR4およびCD117（C-KIT）8、9の発現によって特徴付けられる胚体内胚葉の誘導で始まります。 definitの正確なレギュレーションアイブ内胚葉組織は、その後、前方対後方と腹側背パターニングを受け、腸管の形成のために必要とされます。背側と腹側膵臓芽は、膵臓の開発10のために必要である膵臓および十二指腸ホメオボックス遺伝子（ のPdx1）を発現する後部前腸の領域から出てきます。背側と腹側芽ヒューズはその後、大規模な上皮再構築および展開11を受ける膵臓を形成します。内分泌と外分泌系統へのコミットメントを表明多能性前駆細胞（MPCは）の生成を伴っている、とりわけ、転写ははPdx1、NKX6.1およびPtf1a 12、13因子 。内分泌および導管細胞になるだろうMPCがPtf1a発現を減少させながらNkx6-1を発現し続けます。これに反して、外分泌系統細胞はexpressioを失うことになりますNkx6-1のnおよびPtf1a式 12を維持します 。
転写因子Nkx6-1、特にβ細胞する内分泌前駆細胞の分化の間に、膵臓の発達において重要な役割を有しています。前述のように、Nkx6-1の欠失は、膵臓の発達14中β細胞の障害の形成をもたらします。したがって、 インビトロおよびインビボの両方において 、インスリン産生β細胞を生成するNkx6-1の効率的な誘導を必要とします。
我々は最近、効率的にhPSCsからPDX1 + / NKX6-1 +膵臓前駆細胞を生成するためのプロトコルを開発しました。これらのHPSC由来の膵臓前駆細胞は、免疫不全マウス3への移植の際に成熟β細胞を生成します。 1）胚体内胚葉誘導：分化プロトコルは、特徴的な4段階に分けることができます、2）後部前腸パターニング、3）膵臓仕様および4）NKX6-1誘導。ここでは、有向分化の各ステップの詳細な説明を提供します。
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Protocol
ソリューションとメディアの作製
注：無菌環境での細胞培養のためのすべてのメディアを準備します。媒体を作製し、直ちに使用しなければなりません。試薬の詳細は材料表で提供されます。
- 分化培地
- 1％グルタミンを含むRPMI中、2μMCHIR 99021、100ng / mlのアクチビンA、10 4 M MTG：0日分化メディアを準備します。
- 1％グルタミン、100ng / mlのアクチビンA、10 4 M MTG、5 ngの/ mlのbFGF、50μg/ mlのアスコルビン酸を含むRPMI培地：日1-2分化のメディアを準備します。
- 1％グルタミン、1％のB27、10 4 M MTG、0.75μMドルソモルフィン、50 ngの/ mlのFGF10を含むRPMI培地：日3-5分化のメディアを準備します。
- 日6-7分化メディアを準備しますDMEMを1％グルタミン、1％のB27、50μg/ mlのアスコルビン酸、50 ngの/ mlのFGF10、0.25μMのSANT-1、2μMレチノイン酸、50 ngの/ mlのノギンで。
注：レチノイン酸は、最後の培地に添加されるべきであり、メディアが酸化分解15を防止するために、光から保護されるべきです。 - 日8-12分化メディアを準備しますDMEMを1％グルタミン、1％のB27、50μg/ mlのアスコルビン酸、50 ngの/ mlのノギン、100ng / mlののhEGF、10 mMのニコチンアミドと。
- PBS中10％FBS、マイナスカルシウムとマグネシウム：FACS緩衝液を準備します。
2. HESC分化
注：HESC、解凍継代およびbFGF 16を補充しKOSRベースのメディアの存在下で照射したマウス胚性線維芽細胞上で展開されます。細胞は、80から95までパーセントの集密度に達したときのhESCは、分化の準備ができています。この時点でコロニーが定義された境界線と'domelike」構造（ 図1A）との大きさであるべきです。すべての細胞培養は、平底、0.1％ゼラチンでコーティングした組織培養処理プレート中で行われます。典型的に、細胞は6で増殖させますかそれぞれ2ミリリットルまたは1ミリリットルのメディアボリュームで12ウェルプレート、。
- 0日目に、0日目の分化メディアでKOSRベースのメディアを交換することによって分化を始めます。
- 1日目および2日目に、静かに吸引する前に、単層から任意の死んだ細胞を除去するためにプレートを振ります。日1-2分化のメディアと交換してください。
- 3日目に、フローサイトメトリーのための収穫細胞。細胞が90％以上CXCR4 + / CD117 +を発現した場合は、2.4に進みます。
- 3日目および5日目に、静かに前吸引に単分子層から任意の死んだ細胞を除去するためにプレートを振ります。日3-5分化のメディアと交換してください。
- 日6および7に、日6-7分化のメディアと交換してください。
- 8日、10と12日、日8-12分化のメディアと交換してください。
- 13日目に、フローサイトメトリーのための収穫細胞は、PDX1とNKX6-1式を決定します。
フローサイトメトリー分析のため3.収穫細胞
- で細胞を解離1X商業トリプシン溶液を製造業者のプロトコールに従って、3分間37℃でインキュベートします。
- 30μlのDNアーゼIと千μlのFACS緩衝液中で単一細胞を商業トリプシン溶液を除去し、再懸濁
- マイクロチューブに35μmのナイロンメッシュセルストレーナーと転送を使用してフィルタ細胞。
- 5分間、455×gで遠心分離した細胞。ライブまたは固定のいずれかの染色のための細胞を準備します。
フローサイトメトリー用4.染色
- 3日目のライブ染色のための準備を流れます
- 千μlのFACSバッファーで細胞を再懸濁し。 （未染色および染色された両方のサンプル用）96ウェルプレートの2ウェルに200μlの（約1-3×10 5細胞）を転送。
- 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。
- APC及びCD117：PE（Mは表をaterials参照）3用の一次結合抗体、CXCR4とステイン光から保護し、室温で0分。
- 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。
- 100μlのFACS緩衝液中に再懸濁サンプル。
- 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。
- 1ミリリットルマイクロ試験管または5ミリリットル丸底チューブに300〜500μlのFACSバッファーの全体積で各サンプル、転送を再懸濁します。
- 17フローサイトメーター上で実行したサンプル。サンプルはすぐに実行することができない場合は、4°Cで保存光から保護します。
- 13日目に固定された染色のための準備を流れます
- 4℃で24時間、商業固定/透過処理溶液中の細胞ペレットを再懸濁します。
- 5分間、455×gでサンプルを遠心。 400μlのパーマ/洗浄溶液中に再懸濁します。
- TWにサンプル（約0.5〜1×10 6細胞）の200μLを移します（IgGコントロールとPDX1 / NKX6-1染色用）を、96ウェルプレートのウェルO。 2分間931×gで遠心分離します。
- 抗PDX1および抗NKX6-1プライマリまたはアイソタイプ対照抗体を含有する100μlのパーマ/洗浄溶液中で細胞ペレットを再懸濁（ 材料表を参照してください）。 4℃で一晩インキュベートします。
- 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。 100μlのパーマ/洗浄溶液中に再懸濁サンプル。
- 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。
- 光から保護し、室温で1時間、二次抗体を含有する100μlのパーマ/洗浄でサンプルを再懸濁します。
- 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。
- 100μlのパーマ/洗浄溶液中に再懸濁サンプル。
- 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。
- 代表ステップ4.2.9と4.2.10を食べます。
- 1ミリリットルマイクロ試験管または5ミリリットル丸底チューブに300〜500μlのFACSバッファーの全体積で各サンプル、転送を再懸濁します。
- 17フローサイトメーター上で実行したサンプル。サンプルはすぐに実行することができない場合は、4°Cで保存光から保護します。
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Representative Results
図1（a）の模式的に示したように、膵臓前駆細胞を効率的に生成するには、分化プロトコル中に特定のシグナル伝達分子の正確加え、続いて未分化細胞の適切な成長および維持に依存しています。 0日目に、未分化細胞は、80から95パーセントのコンフルエントであるべきであり、コロニーは、定義されたエッジ（ 図1A）を持っている必要があります。細胞死は、この段階では非常に一般的ですので、ステージ1の間に、メディアはおそらく曇って表示されます。ステージ1の終わりまでに、細胞は90％（ 図1B）よりも高い割合で、胚体内胚葉マーカー、CXCR4およびCD117を共発現する必要があります。
細胞は、4段のプロトコルを通じて区別するように、細長い楕円状の外観から、それらの形態の変化は（ステージ1で観察され、2）より小さな、丸い細胞に（段階3で見として4）（
図1：ヒトES細胞およびサポートするデータから膵臓前駆分化の概略図。ヒトES細胞から膵臓前駆の誘導の（A）の回路図。分化の日、developmentaリットルのステージ、ベースのメディア、およびすべての段階で追加されたサイトカインが含まれています。以下、膵臓分化の重要な段階での位相差画像を示しています。すべての代表的な図において、H1細胞は、上に示した4段階の分化プロトコールに従って分化させました。 0日目、未分化hESCに。ステージ1、胚体内胚葉。ステージ2、後部前腸。ステージ3、PDX1 +内胚葉。ステージ4、NKX6-1 +内胚葉/膵臓前駆細胞。スケールバー=200μmです。 PEおよびCD117：APC抗体染色（B）3日目の代表は、CXCR4のためのプロットフローサイトメトリー。右に左に、染色されたサンプルに染色されていないサンプル。 （C）日NKX6-1およびPDX1を発現している段階-4由来の膵臓前駆細胞のための13の代表的なフローサイトメトリープロット。右に左に、染色された試料上のIgGコントロール。 ヒトES細胞-ヒト胚性幹細胞 、 法A -アクチビンA; bFGFの-塩基性線維芽細胞増殖因子、FGF10 -線維芽細胞成長因子10、DM - 、NOG -ノギン、RA -レチノイン酸、EGF -上皮増殖因子、NA -ニコチンアミド。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
成功し、in vitroで hPSCsからNKX6-1 +膵臓前駆細胞を生成する膵臓の開発中にキーの発達段階を管理する特定のシグナル伝達経路の正確なレギュレーションを伴うhPSCsの高品質の文化と向かう分化の使用に依存しています。このプロトコルは、以下の考慮がなされるべきである効率的なNKX6-1生成を確実にするために、先に示したように3 HPSC線の多様にわたってNKX6-1の強い発現を誘導するために使用することができます。すべての細胞培養および培地製剤は、汚染を防止するために、無菌環境で行われることが重要です。 hESCコロニーは、適切なコンフルエントに達していると分化前の0日目を開始するに区別するために開始していないことが重要です。最適ではないヒトES細胞と分化を開始すると、非効率的な胚体内胚葉の誘導および進行の開発につながることができますアル・ステージ。胚体内胚葉の効率的な誘導を確保するために、フローサイトメトリーによって3日目に細胞を分析することが重要である理由です。 3日目に二重陽性CXCR4 + CD117 +細胞の割合は、効率的な膵臓の開発3用の90％以上でなければなりません。 CXCR4とCD117の両方を発現する細胞の割合が90％未満である場合、膵臓前駆細胞への効率的な誘導は、おそらく（結果は示さず）危険にさらされます。また、以前に出版されたものとは逆に、前のステージ1メディア16に供給するRPMIで細胞を洗浄する必要はありません。前のメディアを吸引するプレートを穏やかに振とうは、単層から死んだ細胞を除去するのに十分です。
段階2でドルソモルフィンの添加は、特定HPSC線18のために必要とされることが示されています。従って、ディでの作業時ドルソモルフィンが必要であるかどうかを判断することが重要です fferent HPSCライン。さらに、第3段階の持続時間はmonohormonalまたはpolyhormonal前駆細胞と細胞株に依存3のいずれかを指定するために重要であることが示されています。新しいHPSCラインで作業する場合したがって、細胞はNKX6-1誘導のための最適な条件を決定するために、ステージ3培地で培養する必要があること時間を決定することが重要です。これを決定するために、細胞を1-4日間のステージに3メディアを培養し、NKX6-1発現についてフローサイトメトリーで5日後に分析する必要があります。
Nkx6-1が βcell開発14のために重要であるとして、効率的にNKX6-1 +細胞に富む集団を生成することは、重要です。他の人は+ NKX6-1に細胞（約60％のH1由来NKX6-1 +細胞および55％HUES8由来PDX + / NKX6-1 +細胞）4のhESCを区別することができるプロトコルを開発してきたが、"外部参照"> 5は、我々の方法が一貫して> 80％のH1由来のPDX1 + / NKX6-1 +細胞を生成します。しかし、私たちの分化プロトコルは、我々は適正製造規範のメソッドを最適化するためにまだ持っているように、研究だけに、その使用を制限したマウス胚性線維芽細胞の使用に依存しています。私たちは、ステージ-4由来のPDX1 + / NKX6-1 +細胞を凍結保存することを試みていないが、このアプローチは成功しシュルツらによって行われてきました。 、誰が凍結保存された膵臓の凝集体が生体内 19 でその機能を保持することができることを実証しました。
本稿では、効率的にHPSCラインの様々なPDX1 + / NKX6-1 +膵臓前駆細胞を生成するための4段階のプロトコルを記述します。膵臓の開発の4つの主要な段階を経てHPSCを微分して、このプロトコルは、 インビトロでヒト膵臓の開発を研究するためのモデルを提供します。フュルトPDX1 + / NKX6-1 +細胞は、 インビボおよびインビトロの両方でインスリン産生細胞を生成する能力を有するのでermore、4、5、hESC由来PDX1 + / NKX6-1 +膵臓、3（データは示していません）前駆細胞は、糖尿病の治療のための可能な供給源を提供します。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この原稿は、トロント一般と西洋財団とバンティング＆ベスト糖尿病センター、大学健康ネットワーク大学院賞からの資金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
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