Protokoller til at generere hPSC mutante linjer ved hjælp af iCRISPR platformen og til at differentiere hPSCs til glucose-responsive p-lignende celler er beskrevet. Kombinere genom redigering teknologi med hPSC-rettet differentiering giver en stærk platform for systematisk analyse af den rolle, slægt determinanter i menneskelig udvikling og sygdomsprogression.
Afhøre genfunktion i selvfornyende eller differentiere menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) tilbyder en værdifuld platform til at forstå den menneskelige udvikling og dissekere sygdomsmekanismer i et fad. For at udnytte dette potentiale applikation kræver effektive genom-redigeringsværktøjer til at generere hPSC mutanter i sygdoms-associerede gener, samt in vitro hPSC differentiering protokoller til at producere sygdomsrelaterede relevant celletyper, der nøje rekapitule- deres in vivo modstykker. Et effektivt genom-redigering platform for hPSCs opkaldt iCRISPR er udviklet gennem Talen-medieret målretning af en Cas9 ekspressionskassette i AAVS1 locus. Her er de protokoller for generering af inducerbare Cas9 hPSC linjer ved hjælp celler dyrket i et kemisk defineret medium, og en feeder-fri tilstand beskrevet. Detaljerede procedurer for brug af iCRISPR systemet til gen-knockout eller præcise genetiske ændringer i hPSCs, enten gennem non-homolog ende sammenføjning (NHEJ) eller via præcise nukleotidændringer bruger homologi-dirigeret reparation (HDR) skabelon henholdsvis er inkluderet. Disse tekniske procedurer omfatter beskrivelser af design, produktion og transfektion af CRISPR guide RNA (gRNAs); målingen af CRISPR mutation renten med T7E1 eller RFLP analyser; og etablering og validering af klonede mutant linjer. Endelig har vi krønike procedurer for hPSC differentiering til glucose-responsive pankreatiske p-lignende celler ved at efterligne in vivo bugspytkirtlen fosterudvikling. Kombinere iCRISPR teknologi med instrueret hPSC differentiering muliggør systematisk undersøgelse af gen-funktion til at fremme vores forståelse af pancreas udvikling og diabetes sygdomsmekanismer.
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har evnen til både selv-forny og giver anledning til alle derivater af de tre embryonale kim slægter. De giver en værdifuld ressource for celleerstatningsterapi og sygdom modellering ved at fungere som en unik platform til at rekapitulere cellulære processer i et menneske udviklingsmæssig sammenhæng. De er også en kilde til eksperimentelle celler til skalerbare, high-throughput analyser. Imidlertid har fremskridtene været begrænset på grund af to hovedudfordringer: manglen på effektive genetisk modificering værktøjer og vanskeligheden ved den gentog de komplekse embryonale udviklingsmæssige trin i en kultur fad.
Gensplejsning er et uundværligt redskab til at studere genfunktion i normal udvikling og sygdom. Men mens klassisk gen målretningsmetoder via homolog rekombination har vist sig at være et effektivt redskab til at dissekere genfunktion i muse embryonale stamceller (mESCs) 1, denne tilganghar været yderst ineffektiv, når den anvendes til hPSCs 2, 3. Den nylige rask tiltrædelse af programmerbare, stedspecifikke nukleaser fra naturen til laboratoriebrug, herunder zink finger nukleaser (ZFNs), transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens), og de grupperede regelmæssigt spatierede korte palindrome gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associerede (Cas) systemer 4, betyder, at genom engineering er blevet en meget lettere opgave i en bred vifte af organismer og cellelinjer, herunder hPSCs. Disse gen redigeringsværktøjer drage fordel af den kendsgerning, at kimære nucleaser såsom Cas9 endonuklease kan tillade en hel række genetiske modifikationer ved at inducere dobbeltstrengede pauser (DSBs) på præcise placeringer, udløser det endogene DNA-reparation maskiner til at aktivere enten ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) eller homologi-dirigeret reparation (HDR). Begge mekanismer kan udnyttes til genetisk manipulation ved at inducere eithis tilfældig isætning og deletionsmutationer (indels; via NHEJ), for at skabe rammeskift mutationer, ophæve gen alleler, eller præcise nukleotidsubstitutioner (via HDR), at rekapitulere patient mutationer til human sygdom modellering eller at korrigere en sygdomsfremkaldende mutation til genterapi .
CRISPR / Cas-medieret genom engineering kræver to komponenter: den konstante RNA-guidede Cas9 endonuklease nødvendig for DNA spaltning og en variabel CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktiverende (tracrRNA) dupleks, der angiver DNA-mål anerkendelse. Den crRNA / tracrRNA duplex kan erstattes med et enkelt kimært guide RNA (gRNA), som har vist sig at arbejde mere effektivt 5, 6, 7. Mens CRISPR / Cas9 system er blevet tilpasset til de fleste eksperimentelle organismer og cellelinjer, levering og ekspressionen af Cas9 og gRNA varierer betydeligt og skal yderligere optimeres til Achieve effektiv genom redigering i mange systemer, herunder hPSCs 8. Et effektivt genom-redigering platform, iCRISPR, er blevet etableret i hPSCs 5. I dette system har en Talen-medieret fremgangsmåde blevet anvendt til at målrette begge alleler af "transgen safe harbor locus" AAVS1 i trans, én allel med en omvendt tetracyclin-reguleret transaktivator (M2rtTA) og den anden med en tetracyclin-responselement (TRE ) driver ekspressionen af Cas9 (iCas9) i hPSCs. I etablerede klonale linjer (iCas9 hPSCs), er Cas9 kraftigt udtrykt med doxycyclin behandling. I mellemtiden, på grund af sin lille størrelse (100 nt), enkelte eller multiple gRNAs let kan leveres ind iCas9 hPSCs med høj effektivitet og kan direkte Cas9 for site-specifik spaltning, hvilket muliggør effektiv NHEJ-medieret gen forstyrrelser, samt HDR-medieret præcise nucleotid modifikationer i nærværelse af korte enkeltstrenget DNA (ssDNA) donor skabeloner. Den iCRISPR system kan væreanvendes med succes generere et panel af sygdomsfremkaldende efterligne hPSC linjer med biallel (homozygot eller heterozygot forbindelse) eller heterozygote tab-af-funktion-mutationer i vigtige udviklingsmæssige gener 5, 9. Mens en række grupper har rapporteret effektiv gen redigering ved hjælp CRISPR / Cas i hPSCs, succesen fortsat begrænset til et lille antal af teknologisk dygtige laboratorier. Den iCRISPR platformen tilbyder en effektiv endnu enkel løsning til rutinemæssig gen redigering af forskere fra forskellige faglige niveauer, og det er allerede blevet anvendt i en række offentliggjorte undersøgelser af vores gruppe og andre 9, 10, 11, 12. Denne tilgang er også blevet yderligere udvidet til inducerbare lyddæmpning baseret på ekspressionen af dCas9-KRAB 13.
Sammen med udviklingen i genom-redigering technoer også blevet opnået logy, betydelige forbedringer i hPSC vedligeholdelse og instrueret differentiering. Dyrkningsbetingelser for hPSCs har udviklet sig fra bestrålede mus embryonale fibroblast (iMEF) feeder-afhængige til feeder-fri betingelser på definerede ekstracellulære matrix komponenter, og fra komplekse medier formuleringer til kemisk definerede medium vilkår 14. Sådanne forbedringer har reduceret variabilitet i hPSCs grundet batch-til-batch forskelle i iMEF forberedelse og knockout serum udskiftning komponenter, og dermed give en mere reproducerbar miljø for hPSC differentiering. I mellemtiden, forbedret kendskab til signalveje for humane embryonale udvikling, samt fund fra high-throughput narkotika screeninger, har ført til forbedrede differentiering protokoller 15, 16, 17, 18. Disse protokoller mere nøje efterligner i vivo udviklingsmæssige trin og generere celletyper, der nøje rekapitule- deres in vivo modstykker. For hPSC differentiering i bugspytkirtlen afstamning, indledende protokoller efterlignede tidlige pancreas udvikling relativt godt, men til sidst genererede polyhormonal p-celler, der var af umodne føtale fænotyper og responderet dårligt til glukose stimulation. Nylige fremskridt 16, 17, 19, 20 har tilladt til generering af glucose-responsive pankreatiske p-lignende celler, der vil sætte os i stand til at undersøge senere begivenheder, såsom dannelsen og den videre modning af monohormonal p-celler.
Her har vi detaljeret anvendelsen af genom-modificerede linjer for studiet af pancreas udvikling ved at kombinere iCRISPR systemet med hPSC-baserede in vitro differentiering platform mod glucose-responsive pancreatic p-lignende celler. Denne kobling af kraftfulde genom redigeringsværktøjer med en forbedret hPSC differentiering protokol tilbyder ikke kun den hastighed og omfang er nødvendige for at imødekomme den stigende efterspørgsel efter validering sygdom kausalitet, men også muliggør avancerede genetiske manipulationer for yderligere mekanistiske undersøgelser transkriptionel kontrol underliggende normal udvikling og sygdom 9 .
Tid Overvejelser til generering Mutant Lines
Selv om de seneste metoder baseret på CRISPR / Cas-systemer til genom-redigering har ført til vellykket målretning, vil en mere effektiv og universel platform være at foretrække for større skala analyser af gen-funktion. Den iCRISPR platformen tilbyder en hurtig og effektiv metode til at introducere mutationer ethvert gen af interesse 5, 9. For det første PCR-baserede gRNA syntese metode tillader produktionen af hundredvis af gRNAs i klædt format på én dag uden tidskrævende kloningstrin. Sekund, med doxycyclin-inducerbar Cas9 ekspression i iCas9 hPSCs, det trin, der involverer gRNA transfektion kræver kun en minimal mængde arbejde og således kan udføres flere gRNA eksperimenter rettet mod samtidigt. Tredje, på grund af den høje målretning effektiviteter opnåelige med vores system, analysen af ~ 24 – 48 kolonier pr gRNA transficeret bør være sufficient at etablere flere monoallelisk og biallele mutante linjer for et enkelt gen, selvom effektivitet varierer afhængigt af mållocuset. Da det er muligt for en uddannet person til mekanisk at gå 384 kolonier (4 x 96-brønds plader) i et møde, som bør tage ~ 4 timer under et dissektionsmikroskop, kan en uddannet person forventes at generere mutante linjer påvirkede 12 gener i 12 måneder. Den strømlinede generation af hPSC mutanter på kort tid giver mulighed for systematisk analyse af et array af transkriptionsfaktorer og / eller signalvejen komponenter, der interagerer med hinanden, regulering udviklingsprocessen 9. Derudover effektiv multiplex gen targeting åbner også døren for at undersøge genetiske interaktioner underliggende komplekse menneskelige træk.
Generation af præcise genetiske modifikationer
Udledningen af patient-specifikke iPSCs fra let tilgængelige somatiske celletype s og differentiering i sygdoms-relevant celletyper giver en stor mulighed for den funktionelle validering af sygdom-associerede mutationer. Men på grund af den betydelige variation i genetisk baggrund mellem individer, direkte sammenligninger mellem iPSCs fra patienter og fra raske donorer kan ikke tillader en at skelne sygdomsfænotyper fra baggrundseffekter. Derfor er det nødvendigt at generere isogene kontrol iPSCs ved at korrigere sygdomsmutationen tilbage til vildtypesekvensen eller at indføre de patientspecifikke mutationer i en vildtype hPSC baggrund, som foreslået af andre 25, 26. Ud over tab af funktion (null) mutationer, kan man nu mere præcist dissekere sygdomsmekanismer ved indførelse af en patient-specifikke sekvensændringer i det endogene locus i hPSCs, herunder hypermorphic, hypomorphic, neomorphic eller dominant-negative patient mutationer.
ntent "> Præcis genetisk modifikation anvender HDR for DSB-reparation i nærværelse af en reparation skabelon. Da det er meget mindre effektiv end NHEJ-medieret DNA-reparation, en donor plasmid indeholdende patient-specifik mutation, et udvalg medikamentkassetten, og homologiarme tidligere har været anvendt som reparationen template to. Efter udvælgelse narkotika og kontrol af patienten-specifik mutation, er et andet trin generelt nødvendig for at fjerne markeringen narkotika kassette. Mens de mest udbredte Cre-loxP og FLP-FRT-systemer efterlade resterende sekvens i det endogene locus har anvendelsen af piggyBac transposon tilladt for den sømløse fjernelse af lægemiddel-selektion kassetten 27. for nylig korte ssDNA-skabeloner har også vist sig at understøtte effektiv HDR med konstruerede DNA-endonukleaser 28. Sammenlignet med en donorplasmid , ssDNA direkte kan syntetiseres og omgår således tidskrævende kloningstrin. Her har det væreOr vist, at ved co-transfektion af gRNA og en ssDNA template til at inducere homologi-dirigeret reparation, kan iCRISPR anvendes til at indføre specifikke nucleotid modifikationer med høj effektivitet. Dette er kritisk for ikke kun dissecting rolle essentielle nukleotider inden protein- funktionelle domæner, men også til modellering humane sygdomstilstande mutationer og potentielt korrigere disse sygdomsassocierede mutationer for terapeutisk intervention. På grund af det store antal modtagelighed loci, der hver er forbundet med flere sekvensvarianter, modellering komplekse og multigenic sygdomme som diabetes har været en udfordring for genetikere. Da iCRISPR platformen er eftergivende for en hurtig generering af en allel serie eller for multiplexable gen targeting, kan det lette efterforskningen af multiple sygdom-associeret loci, enten individuelt eller i kombination med isogene baggrunde.Målretning effektivitet og Off-target effekter
Vi har fundet en god sammenhæng mellem T7E1 og RFLP analyseresultater og antallet af mutant linjer identificeret ved sekventering. Dette understreger vigtigheden af at udføre disse assays parallelt med etableringen af klonale linjer. Mens målretning effektiviteter opnås, kan variere afhængigt af den genomiske loci, i de fleste single-gen-targeting eksperimenter, 20 – blev 60% af klonerne fundet med begge alleler muteret (herunder i ramme og læserammeforskydningsmutationer) 9. I tilfælde, hvor multiplex gen targeting blev udført, blev tredobbelt biallele mutant kloner med 5-10% effektivitet opnået fem. ssDNA-medieret HDR af flere gener blev også udført for at opnå præcise genetiske ændringer, med effektivitetsgevinster for at opnå homozygot knock-i kloner fra 1 – 10% 5. Arbejde med CRISPR / Cas i hPSCs eventuelle mutationer i potentielle off-target sites, der ikke deler den samme gRNA target sekvens endnu ikke opdagetlass = "xref"> 5, 9, 12. Whole-genom sekventering udført i en nylig undersøgelse har også undladt at identificere væsentlige off-target-mutationer i klonede hPSC linier genereres ved hjælp af CRISPR / Cas 29. Ikke desto mindre, at minimere enhver potentiel effekt af confounding fænotyper indført ved mutationer ved off-target effekt sites, foreslås det at generere uafhængige mutant linjer ved hjælp af mindst to uafhængige gRNAs målrettet forskellige sekvenser inden for samme gen. Lignende fænotyper observeret i flere linjer frembragt ved anvendelse af forskellige gRNAs kunne hovedsagelig udelukke muligheden for, at fænotypen kommer fra en off-target effekt.
Feeder-afhængige versus Uafhængig Kultur og målretning
Traditionelle metoder til hPSC kultur involverer deres vedligeholdelse og ekspansion på feeder-celler i medier, der indeholder serum eller serum udskiftning, der omfatter dyr proddukter, såsom bovint serumalbumin. Feeder celler, serum, serum udskiftning, og albumin alle indeholder komplekse, udefinerede komponenter og viser betydelig batch variation. Tilpasning til feeder-fri og kemisk definerede tilstand reducerer indsatsen for hPSC vedligeholdelse og, endnu vigtigere, øger konsistensen af differentiering eksperimenter. På nuværende tidspunkt er der meget få undersøgelser, der beskriver genom redigering procedurer på hPSCs dyrket i fuldt definerede dyrkningsbetingelser 30. Vi har fundet højere CRISPR målretning effektiviteter når gRNA transfektion og klonal aflejring blev udført i fødefri betingelser sammenlignet med feeder-afhængig dyrkningsbetingelser. Vi mener, at dette skyldes øget overlevelse celle efter transfektion og enkeltstrenget cellepodning for kolonidannelse. Desuden har fødeceller tidligere vist sig at sekvestrere transfektionsreagenser, derved sænke transfektionseffektiviteten.
KombinationGenome Redigering med Directed Differentiering
Tidligere differentiering protokoller har givet kun en lille brøkdel af insulin-positive celler, hvoraf størstedelen var polyhormonal og lignede føtale endokrine celler 23. Nylige fremskridt har muliggjort differentiering af hPSCs til mere modne glucose-responsive beta-lignende celler 16, 17, 19, 20. Vi kan rutinemæssigt opnå mindst 75% endelige endoderm celler, 40% Pdx1 + NKX6.1 + pancreas stamceller og omkring 20% NKX6.1 + CPEP + glucose-responsive beta-lignende celler under anvendelse HUES8 hPSCs 9. Når det kombineres med den iCRISPR genom redigering system, har det mere robust differentiering protokol lettet analysen af transkriptionsfaktorer, der er afgørende for de pancreasstamfaderceller og endokrine stadier af bugspytkirtlen differentiering. Dette vil gøredet muligt, i fremtidige studier, for at undersøge et stort antal kandidat sygdomsgener for funktionelle validering og undersøgelse af de mekanismer, der ligger til grund for diabetes 9.
Fremtidige Programmer eller vejvisning
Vores iCRISPR systemet kan lette dannelsen af mere komplekse genomiske modifikationer, såsom skabelse af reporter alleler gennem HDR-medieret gen-targeting under anvendelse lange donor-DNA skabeloner indkoder protein tags eller fluorescerende reportere 12. Vi har vist, at på grund af den høje CRISPR målretning virkningsgrader opnået i systemet, kan denne proces udføres i hPSCs, uden behov for yderligere lægemiddelselektion 12. Endvidere kan multipleksede gen-targeting anvendes til at undersøge genetisk samspil underliggende kompleks menneskelig sygdom som vist i vores nyere undersøgelse, som vi mener er det første eksempel på et sådant arbejde 31. ICRISPR kan også anvendes til at forstå genregulatorisk Ved at oprette deletioner enten i ikke-kodende RNA'er eller i gen-regulatoriske regioner, såsom promotorer og enhancere. Til effektivt at generere regulatoriske mutanter under anvendelse iCRISPR, kan gRNAs designes til at forstyrre bindingsstedet af et DNA-bindende protein, herunder, men ikke begrænset til det basale transkriptionelle maskineri eller en vævsspecifik transskriptionsfaktor. ssDNA template-medieret HDR kan også anvendes til at mutere specifikke proteinbindingssteder. Endelig har vi forestiller at yderligere optimering ville muliggøre brugen af iCRISPR platform i hPSCs for højere gennemløb genetiske analyser af pluripotens fænotyper eller sygdomstilstande fænotyper, når de kombineres med en in vitro differentiering protokol. Disse iCRISPR-medierede undersøgelser kan give mulighed for en hurtigere identifikation af kandidat sygdom-associerede gener og undersøgelser af deres funktionelle relevans.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret delvist af NIH / NIDDK (R01DK096239) og New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ blev støttet af NYSTEM postdoc stipendium fra Center for Stamcelleforskning Biology af Sloan Kettering Institute.
Chemically defined medium (E8) | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included |
Truncated recombinant human form of vitronectin | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | 1X, animal origin free, recombinant enzyme |
G418 Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | Geneticin Selective Antibiotic |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | Puromycin Selective Antibiotic |
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) | Agilent Technologies | 600679 | PCR kit |
MEGAshortscript T7 Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1354 | |
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
Opti-MEM medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Reduced Serum Medium |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | QIAGEN | 69504 | Genomic DNA extraction kit |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
MCDB 131 medium | Thermo Fisher Scientific | 10372-019 | |
BLAR medium | Thermo Fisher Scientific | Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014) | |
L-glutamine supplement (GlutaMAX) | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
NaHCO3 | Thermo Fisher Scientific | 144-55-8 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
BSA | LAMPIRE Biological Laboratories | 7500855 | Fatty acid free |
GDF8 | PeproTech | 120-00 | |
CHIR-99021 | Stemgent | 04-0004 | GSK-3 inhibitor |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Vitamin C |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG | |
SANT1 | Tocris Bioscience | 1974 | Hedgehog inhibitor |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | Retinoic acid |
LDN | Stemgent | 04-0019 | BMP inhibitor |
IWP-2 | Tocris Bioscience | 3533 | Wnt antagonist |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | |
TPB | EMD Millipore | 565740-1MG | PKC activator |
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
ALK5i II | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | ALK5 inhibitor II |
ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
GSiXX | EMD Millipore | 565789 | Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor |
N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Trolox | EMD Millipore | 648471 | Vitamin E analogue |
R428 | Selleck Chemicals | S2841 | AXL receptor tyrosine kinase inhibitor |
24mm Transwell with insert | Corning Life Sciences | 3414 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | |
0.4 cm Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652081 | |
AAVS1-TALEN-L | Addgene | 59025 | |
AAVS1-TALEN-R | Addgene | 59026 | |
AAVS1-Neo-M2rtTA | Addgene | 60843 | |
AAVS1-Puro-iCas9 | Addgene | 58409 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302L | |
Buffer 2 | NEB | B7002S | NEBuffer 2 |
Long oligonucleotide | Eton Bioscience or IDT | ||
SOX17 antibody | R&D Systems | AF1924 | 1: 500 |
FOXA2 antibody | Millipore | 07-633 | 1: 100 |
CXCR4-APC antibody | R&D Systems | FAB170A | 1: 25 |
PDX1 antibody | R&D Systems | AF2419 | 1: 500 |
NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12 | 1: 500 |
NKX2.2 antibody | DSHB | 74.5A5 | 1: 100 |
NEUROD1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1084 | 1: 100 |
Insulin antibody | Dako | A0564 | 1: 2000 |
C-peptide antibody | DSHB | GN-ID4-c | 1: 2000 |
Glucagon antibody | Sigma-Aldrich | G2654 | 1: 1000 |