Protokoller for å generere hPSC mutant linjer ved hjelp av iCRISPR plattform og å skille hPSCs til glukose-responsive e-lignende celler er beskrevet. Kombinere genom redigering teknologi med hPSC rettet differensiering gir en kraftig plattform for systematisk analyse av rollen avstamning determinants i menneskelig utvikling og progresjon av sykdommen.
Avhør gen-funksjon i selv fornye eller differensierende humane pluripotente stamceller (hPSCs) tilbyr en verdifull plattform mot å forstå menneskelig utvikling og dissekere sykdomsmekanismer i en skål. For å utnytte dette potensialet applikasjonen krever effektive genom-redigeringsverktøy for å generere hPSC mutanter i sykdomsassosierte gener, samt in vitro hPSC differensiering protokoller for å produsere sykdomsrelevant celletyper som tett rekapitulere sine in vivo kolleger. En effektiv genom-redigering plattform for hPSCs heter iCRISPR har blitt utviklet gjennom TALEN-mediert målretting av en Cas9 uttrykk kassett i AAVS1 locus. Her er de protokoller for generering av induserbare Cas9 hPSC linjer ved hjelp av celler dyrket i et kjemisk definert medium og en mater-fri tilstand er beskrevet. Detaljerte prosedyrer for bruk av iCRISPR system for genet knockout eller presise genetiske endringer i hPSCs, enten gjennom non-homolog ende bli (NHEJ) eller via presise nukleotid endringer ved hjelp av en homologi-rettet reparasjon (HDR) mal, henholdsvis, er inkludert. Disse tekniske prosedyrer inkluderer beskrivelser av design, produksjon og transfeksjon av CRISPR guide RNA (gRNAs); måling av CRISPR mutasjonsraten ved T7E1 eller RFLP analyser; og etablering og validering av klonal mutant linjer. Til slutt, vi krønike prosedyrer for hPSC differensiering til glukose-responsive bukspyttkjertelen beta-lignende celler ved å etterligne in vivo bukspyttkjertelen embryonal utvikling. Kombinere iCRISPR teknologi med rettet hPSC differensiering gjør at systematisk undersøkelse av gen-funksjon for å videreutvikle vår forståelse av bukspyttkjertelen utvikling og diabetes sykdomsmekanismer.
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har evnen til både å fornye seg selv og gi opphav til alle derivater av de tre embryonale bakterie linjene. De gir en verdifull ressurs for celle erstatning terapi og sykdom modellering ved å fungere som en unik plattform for å rekapitulere cellulære prosesser i en menneskelig utviklingssammenheng. De er også en kilde til eksperimentelle celler for skalerbare, high-throughput analyser. Imidlertid har fremgang vært begrenset på grunn av to hovedutfordringer: mangel på effektive genetisk modifikasjon verktøy og vanskeligheten med å rekapitulere de komplekse embryonale utviklingstrinn i en kultur tallerken.
Genetisk modifikasjon er en uunnværlig verktøy for å studere genfunksjon i normal utvikling og sykdom. Imidlertid, mens klassiske gene targeting tilnærminger via homolog rekombinasjon har vist seg å være et kraftig verktøy for å dissekere genfunksjon i mus embryonale stamceller (mESCs) 1, denne tilnærmingenhar vært svært ineffektiv når den brukes til hPSCs to, tre. Den nylige rask tiltredelse av programmerbare, stedsspesifikke nukleaser fra naturen til laboratoriebruk, blant annet sink finger nukleaser (ZFNs), transkripsjon aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), og gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-forbundet (Cas) systemer 4, innebærer at genom teknikk har blitt en mye enklere oppgave i et bredt spekter av organismer og cellelinjer, blant annet i hPSCs. Disse genet redigeringsverktøy dra nytte av det faktum at kimære nukleaser som Cas9 endonuklease kan tillate en hel rekke genetiske endringer ved å fremkalle dobbel-strandet pauser (DSB sin) på presise steder, utløser den endogene DNA reparasjon av veier for å aktivere enten ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR). Begge mekanismene kan utnyttes for genetisk manipulasjon ved å fremkalle either tilfeldig innsetting og sletting mutasjoner (indels, via NHEJ), for å skape rammeskifte mutasjoner som opphever genet alleler, eller presise nukleotidsubstitusjoner (via HDR), for å rekapitulere pasient mutasjoner for menneskelig sykdom modellering eller for å rette en sykdomsfremkallende mutasjon for genterapi .
CRISPR / Cas-mediert genomet teknikk krever to komponenter: konstant RNA-guidet Cas9 endonuklease nødvendig for DNA cleavage og en variabel CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktivering (tracrRNA) dupleks som angir DNA target anerkjennelse. Den crRNA / tracrRNA dupleks kan erstattes med en enkelt kimært guide RNA (gRNA), som er blitt funnet å fungere mer effektivt 5, 6, 7. Mens CRISPR / Cas9 systemet er tilpasset mest eksperimentelle organismer og cellelinjer, levering og uttrykk for Cas9 og gRNA varierer betydelig og må ytterligere optimalisert til Achieve effektiv genom redigering i mange systemer, inkludert hPSCs 8. En effektiv genom-redigering plattform, iCRISPR, har vært etablert i hPSCs 5. I dette system har en TALEN-mediert metode blitt benyttet til å målrette begge allelene av "transgene trygg havn locus" AAVS1 i trans, ett allel med en omvendt tetracyklin-kontrollert transaktivator (M2rtTA) og den andre med en tetracyklin-responselement (TRE ) kjører uttrykk for Cas9 (iCas9) i hPSCs. I etablerte klonale linjer (iCas9 hPSCs), er Cas9 sterkt uttrykt med doksycyklin behandling. I mellomtiden, på grunn av sin lille størrelse (100 nt), én eller flere gRNAs lett kan leveres inn iCas9 hPSCs med høy effektivitet og kan henvise Cas9 for stedsspesifikke cleavage, muliggjør effektiv NHEJ-mediert genet avbrudd, samt HDR-mediert presise nukleotid-endringer i nærvær av korte enkeltkjedet DNA (ssDNA) donor maler. Den iCRISPR systemet kan værebrukt for å kunne generere et panel av sykdomsligne hPSC linjer med biallelic (homozygot eller sammensatte heterozygot) eller heterozygote tap-av-funksjon mutasjoner i viktige utviklings gener 5, 9. Mens et antall grupper har rapportert effektiv gen redigering ved hjelp av CRISPR / Cas i hPSCs, forblir suksess begrenset til et lite antall teknologisk flinke laboratorier. Den iCRISPR plattformen tilbyr en effektiv men enkel løsning for rutine genet redigering av forskere på ulike ferdighetsnivåer, og det har allerede blitt brukt i en rekke publiserte studier av vår gruppe og andre 9, 10, 11, 12. Denne tilnærmingen har også blitt ytterligere utvidet til induserbar stanse basert på uttrykk for dCas9-KRAB 13.
Sammen med fremdriften i genomet-redigering technologi, betydelige forbedringer har også blitt oppnådd i hPSC vedlikehold og rettet differensiering. Kultur vilkår for hPSCs har utviklet seg fra bestrålte mus embryonale fibroblast (iMEF) mater avhengig til mater-frie forhold på definerte ekstracellulære matrise komponenter, og fra komplekse medie formuleringer til kjemisk definerte mellom forhold 14. Slike forbedringer har redusert variabilitet i hPSCs grunn av batch-til-batch-forskjeller i iMEF forberedelse og knockout serumreservekomponenter, og dermed gi en mer reproduserbar miljø for hPSC differensiering. I mellomtiden, bedre kunnskap om signalveier som styrer menneskelig embryoutvikling, samt funn fra high-throughput narkotika screenings, har ført til bedre differensiering protokoller 15, 16, 17, 18. Disse protokollene nærmere etterligne i vivo utviklingstrinn og generere celletyper som tett rekapitulere sine in vivo kolleger. For hPSC differensiering i bukspyttkjertelen avstamning, innledende protokoller lignet tidlig bukspyttkjertelen utvikling relativt godt, men til slutt generert polyhormonal betaceller som var av umodne foster fenotyper og respondert dårlig til glukose stimulering. Nylige fremskritt 16, 17, 19, 20 har tillatt for generering av glukose-responsive bukspyttkjertelen beta-lignende celler, noe som vil gjøre oss i stand til å undersøke senere hendelser, som for eksempel dannelse og den videre modning av monohormonal betaceller.
Her har vi detalj anvendelse av genom-modifisert linjer for studiet av pankreatisk utvikling ved å kombinere iCRISPR systemet med hPSC basert in vitro differensiering plattformen mot glukose-responsive pancreatic B-lignende celler. Denne koblingen av kraftige genome redigeringsverktøy med en forbedret hPSC differensiering protokollen tilbyr ikke bare hastigheten og omfanget er nødvendig for å møte den økende etterspørselen etter validering sykdom kausalitet, men gjør det også avanserte genetiske manipulasjoner for videre mekanistiske undersøkelser i transkripsjonen kontroll underliggende normal utvikling og sykdom 9 .
Tid Hensyn for å generere Mutant Lines
Selv om de siste tilnærminger basert på CRISPR / Cas systemer for genom redigering har ført til en vellykket satsing, ville en mer effektiv og universell plattform være å foretrekke for større skala analyser av gen-funksjon. Den iCRISPR plattformen gir en rask og effektiv metode for å innføre mutasjoner til hvilket som helst gen av interesse 5, 9. For det første tillater PCR-baserte gRNA syntesemetode fremstilling av hundrevis av gRNAs i kledd format i en dag uten de tidkrevende kloningstrinn. For det andre, med doksycyklin-induserbar Cas9 uttrykk i iCas9 hPSCs, trinn involverer gRNA transfeksjon krever bare minimalt med arbeid, og dermed kan flere gRNA rettet mot forsøkene gjennomføres samtidig. Tredje, på grunn av den høye målretting effektivitet oppnåelig med vårt system, analyse av ~ 24 – 48 kolonier pr gRNA transfektert bør være sufficient for å etablere multiple monoallelic og biallelic mutant linjer for et enkelt gen, selv om effektiviteten varierer avhengig av mål-locus. Siden det er mulig for en trent person til mekanisk plukke 384 kolonier (4 x 96-brønners plater) i en sittende, som bør ta ~ 4 timer under et dissekere mikroskop, kan et trent individ forventes å generere mutant linjer som påvirker 12 gener innen 12 måneder. Den strømlinjeformede generasjon hPSC mutanter på kort tid gir mulighet for systematisk analyse av en rekke transkripsjonsfaktorer og / eller signalveien komponenter som samhandler med hverandre, regulere utviklingsprosess 9. I tillegg effektiv multiplekset genet targeting åpner også døren for å undersøke genetiske interaksjoner underliggende komplekse menneskelige trekk.
Generering av Nøyaktige genetiske modifikasjoner
Avledning av pasientspesifikke iPSCs fra lett tilgjengelige somatisk celletype s og differensiering i sykdoms relevant celletyper gir en flott mulighet for den funksjonelle validering av sykdomsassosierte mutasjoner. Men på grunn av den betydelige variasjon i genetisk bakgrunn mellom individer, direkte sammenligninger mellom iPSCs fra pasienter og fra friske donorer ikke tillater en å skille sykdom fenotyper fra bakgrunnseffekter. Derfor er det nødvendig å generere isogene kontroll iPSCs ved å korrigere sykdommen mutasjonen tilbake til villtype-sekvensen, eller for å innføre de pasientspesifikke mutasjoner inn i en hPSC bakgrunn vill-type, som foreslått av andre 25, 26. I tillegg til tap-av-funksjon (null) mutasjoner, kan en nå mer presist dissekere sykdomsmekanismene gjennom innføring av en pasient-spesifikke sekvensendringer inn i den endogene locus i hPSCs, inkludert hypermorphic, hypomorphic, neomorphic, eller dominant-negativ pasient mutasjoner.
ntent "> Precise genetisk modifikasjon anvender HDR for DSB reparasjon, i nærvær av en reparasjon mal. Siden det er mye mindre effektiv enn NHEJ-mediert DNA-reparasjon, en donor plasmid inneholdende pasientspesifikk mutasjon, en medikamentseleksjon kassett, og homologi armene har tidligere blitt brukt som reparasjons templat 2. Etter medikamentseleksjon og verifisering av pasientspesifikk mutasjon, blir et andre trinn vanligvis nødvendig for å fjerne den medikamentseleksjon kassetten. Mens de mest brukte Cre-loxP og FLP-FRT-systemer etterlate gjenværende sekvens i det endogene locus, har bruken av piggyBac transposon tillatt for sømløs fjerning av medikamentseleksjon kassetten 27. i den senere tid korte ssDNA maler har også blitt vist å understøtte effektiv HDR med konstruerte DNA-endonukleaser 28. Sammenlignet med en donor plasmid , ssDNA kan direkte syntetiseres og således omgår tidkrevende kloningstrinn. Her må det blino vist at, ved ko-transfeksjon av gRNA og en ssDNA mal for å indusere homologi rettet reparasjon, kan iCRISPR anvendes for å innføre bestemte nukleotid-endringer med høy virkningsgrad. Dette er kritisk for ikke bare å dissekere rollen av essensielle nukleotider innenfor protein funksjonelle domener, men også for modellering av humane sykdoms mutasjoner og eventuelt korrigere disse sykdomsassosierte mutasjoner for terapeutisk intervensjon. På grunn av det store antallet mottakelighet loci som hver er forbundet med flere sekvensvarianter, å modellere komplekse og multigenic sykdommer slik som diabetes har vært en utfordring for genetikere. Som iCRISPR plattformen er ettergivende for den raske dannelse av en allelisk serie eller for multiplexable gen målretting, kan det lette undersøkelsen av flere sykdomsassosierte loci, enten individuelt eller i kombinasjon med isogene bakgrunn.Målrette Effektivitet og Off-målet Effects
Vi har funnet en god korrelasjon mellom T7E1 og RFLP-analyseresultatene, og antallet mutant linjer identifisert ved sekvensering. Dette understreker viktigheten av å utføre disse analyser parallelt med etableringen av klonale linjer. Mens de er målrettet mot effektiviteter oppnås kan variere avhengig av det genomiske loci i de fleste enkelt-gen-målsøkende eksperimenter, 20 – 60% av klonene ble funnet med begge alleler mutert (inklusive i-ramme og rammeskiftmutasjoner) 9. I tilfeller der multiplexed genet målretting ble utført, ble trippel biallelic mutante kloner med 5-10% effektivitet oppnås 5. ssDNA-mediert HDR av flere gener ble også utført for å oppnå presise genetiske endringer, med effektiviteten av å skaffe homozygot knock-in kloner fra 1 – 10% 5. Arbeide med CRISPR / Cas i hPSCs, eventuelle mutasjoner i potensielle off-target nettsteder som ikke deler samme gRNA målsekvensen er ennå ikke oppdagetlass = "xref"> 5, 9, 12. Hel-genomsekvensering utført i en fersk studie har også unnlatt å identifisere betydelige off-target mutasjoner i klonale hPSC linjer generert ved hjelp CRISPR / Cas 29. Likevel, for å minimalisere eventuelle effekten av konfunderende fenotyper introdusert av mutasjoner ved off-target effekt områder, er det foreslått å generere uavhengige mutant linjer ved hjelp av minst to uavhengige gRNAs rettet mot ulike sekvenser innenfor samme genet. Lignende fenotyper observert i flere linjer generert ved hjelp av ulike gRNAs kan prinsipielt utelukke muligheten for at fenotype kommer fra en off-target effekt.
Feeder-avhengige versus Uavhengig Kultur og målretting
Tradisjonelle metoder for hPSC kultur involvere deres vedlikehold og utvidelse på feeder-celler i medier som inneholder serum eller serum erstatning som inkluderer dyr proddukter, slik som bovint serumalbumin. Feeder celler, serum, serum erstatning, og albumin alle inneholder komplekse, udefinerte komponenter og viser stor batch variasjon. Tilpasning til materen fritt og kjemisk definert tilstand reduserer innsatsen for hPSC vedlikehold og, enda viktigere, øker konsistensen av differensiering eksperimenter. I dag er det svært få studier som beskriver genom redigering prosedyrer på hPSCs dyrket i fullt definerte kultur forhold 30. Vi har funnet høyere CRISPR rettet mot effektivitet når gRNA transfeksjon og klonal deponering ble utført i mater frie forhold i forhold til mateavhengige dyrkningsforhold. Vi tror at dette skyldes økt celle overlevelse etter transfeksjon og encellede seeding for kolonidannelse. Dessuten har feeder-celler tidligere er blitt vist å beslaglegge transfeksjon reagenser, for derved å senke transfeksjonseffektiviteten.
kombinereGenome Redigerer med Regissert Differensiering
Tidligere differensiering protokoller har gitt bare en liten brøkdel av insulin-positive celler, de fleste som var polyhormonal og lignet fosterets endokrine celler 23. Nyere fremskritt har tillatt differensiering av hPSCs til mer modne glukose-responsive beta-lignende celler 16, 17, 19, 20. Vi kan rutinemessig få minst 75% definitive endoderm celler, 40% PDX1 + NKX6.1 + pancreatic stamfedre, og rundt 20% NKX6.1 + CPEP + glukose-responsive beta-lignende celler ved hjelp HUES8 hPSCs 9. Når det kombineres med iCRISPR genomet redigeringssystem, har dette mer robust differensiering protokollen tilrettelagt analyse av transkripsjonsfaktorer som er avgjørende for bukspyttkjertelen progenitor og endokrine stadier av bukspyttkjertel differensiering. Dette vil gjøredet er mulig, i fremtidige studier for å undersøke et stort antall kandidat sykdomsgener for den funksjonelle validering og gransking av mekanismene som ligger til grunn diabetes 9.
Fremtidige applikasjoner eller Veibeskrivelse
Vår iCRISPR Systemet kan bidra til generering av mer komplekse genomiske modifikasjoner, for eksempel etableringen av reporter alleler gjennom HDR-mediert genet targeting bruker lang donor DNA maler koding protein tags eller fluoriserende journalister 12. Vi har vist at, på grunn av den høye CRISPR målretting effektivitet oppnådd i systemet, kan denne prosessen utføres i hPSCs, uten behov for ytterligere medikamentseleksjon 12. Videre kan multiplekset genet målretting bli brukt til å undersøke genetiske interaksjoner liggende kompleks sykdom hos mennesker, som vist i vår nylig studie, som vi mener er det første eksempel på et slikt arbeid 31. ICRISPR kan også brukes til å forstå gen regulatorisk kontroll ved å skape delesjoner enten i ikke-kodende RNA eller i-gen regulerende områder, slik som promotere og enhancere. Til effektivt å generere regulerings mutanter ved hjelp av iCRISPR kan gRNAs være utformet for å forstyrre bindingssetet av en DNA-bindende protein, inkludert, men ikke begrenset til basaltranskripsjonelle maskiner eller et vev-spesifikk transkripsjonsfaktor. ssDNA mal-mediert HDR kan også brukes for å mutere spesifikke proteinbindingsseter. Til slutt, ser vi for oss at ytterligere optimalisering vil muliggjøre bruken av iCRISPR plattformen i hPSCs for høyere gjennomstrømning genetiske analyser av pluripotency fenotyper eller sykdoms fenotyper når den kombineres med en in vitro differensiering protokollen. Disse iCRISPR-mediert studier kan gi rom for raskere identifisering av kandidatsykdomsassosierte gener og studier av deres funksjonelle relevans.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert delvis av NIH / NIDDK (R01DK096239) og New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ ble støttet av NYSTEM postdoktorstipend fra Center for Stem Cell Biology av Sloan Kettering Institute.
Chemically defined medium (E8) | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included |
Truncated recombinant human form of vitronectin | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | 1X, animal origin free, recombinant enzyme |
G418 Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | Geneticin Selective Antibiotic |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | Puromycin Selective Antibiotic |
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) | Agilent Technologies | 600679 | PCR kit |
MEGAshortscript T7 Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1354 | |
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
Opti-MEM medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Reduced Serum Medium |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | QIAGEN | 69504 | Genomic DNA extraction kit |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
MCDB 131 medium | Thermo Fisher Scientific | 10372-019 | |
BLAR medium | Thermo Fisher Scientific | Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014) | |
L-glutamine supplement (GlutaMAX) | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
NaHCO3 | Thermo Fisher Scientific | 144-55-8 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
BSA | LAMPIRE Biological Laboratories | 7500855 | Fatty acid free |
GDF8 | PeproTech | 120-00 | |
CHIR-99021 | Stemgent | 04-0004 | GSK-3 inhibitor |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Vitamin C |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG | |
SANT1 | Tocris Bioscience | 1974 | Hedgehog inhibitor |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | Retinoic acid |
LDN | Stemgent | 04-0019 | BMP inhibitor |
IWP-2 | Tocris Bioscience | 3533 | Wnt antagonist |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | |
TPB | EMD Millipore | 565740-1MG | PKC activator |
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
ALK5i II | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | ALK5 inhibitor II |
ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
GSiXX | EMD Millipore | 565789 | Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor |
N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Trolox | EMD Millipore | 648471 | Vitamin E analogue |
R428 | Selleck Chemicals | S2841 | AXL receptor tyrosine kinase inhibitor |
24mm Transwell with insert | Corning Life Sciences | 3414 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | |
0.4 cm Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652081 | |
AAVS1-TALEN-L | Addgene | 59025 | |
AAVS1-TALEN-R | Addgene | 59026 | |
AAVS1-Neo-M2rtTA | Addgene | 60843 | |
AAVS1-Puro-iCas9 | Addgene | 58409 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302L | |
Buffer 2 | NEB | B7002S | NEBuffer 2 |
Long oligonucleotide | Eton Bioscience or IDT | ||
SOX17 antibody | R&D Systems | AF1924 | 1: 500 |
FOXA2 antibody | Millipore | 07-633 | 1: 100 |
CXCR4-APC antibody | R&D Systems | FAB170A | 1: 25 |
PDX1 antibody | R&D Systems | AF2419 | 1: 500 |
NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12 | 1: 500 |
NKX2.2 antibody | DSHB | 74.5A5 | 1: 100 |
NEUROD1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1084 | 1: 100 |
Insulin antibody | Dako | A0564 | 1: 2000 |
C-peptide antibody | DSHB | GN-ID4-c | 1: 2000 |
Glucagon antibody | Sigma-Aldrich | G2654 | 1: 1000 |