Protokoll för att generera hPSC muterade linjer med hjälp av iCRISPR plattformen och att differentiera hPSCs till glukos-responsiv p-liknande celler beskrivs. Kombinera genomet redigering teknik med hPSC riktad differentiering ger en kraftfull plattform för systematisk analys av den roll som linjebestämnings i mänsklig utveckling och sjukdomsprogression.
Fråge geners funktion i självförnyande eller differentiera humana pluripotenta stamceller (hPSCs) erbjuder en värdefull plattform mot att förstå människans utveckling och dissekera sjukdomsmekanismer i en skål. Att kapitalisera på denna potential ansökan kräver effektiva genomet redigeringsverktyg för att skapa hPSC mutanter i sjukdomsassocierade gener, liksom in vitro hPSC differentieringsprotokoll för att producera sjukdoms relevanta celltyper som är nära rekapitulera sina in vivo motsvarigheter. En effektiv genomet redigering plattform för hPSCs namnges iCRISPR har utvecklats genom talen-medierad inriktning av en Cas9 expressionskassett i AAVS1 locus. Här, är protokollen för generering av inducerbara Cas9 hPSC linjer med celler som odlats i ett kemiskt definierat medium och en matare fritt tillstånd beskrivas. Detaljerade förfaranden för användning av iCRISPR system för gen knockout eller exakta genetiska förändringar i hPSCs, antingen genom non-homologa ände sammanfogning (NHEJ) eller via exakta nukleotidförändringar med användning av en homologi-riktad reparations (HDR) mall, respektive, är inkluderade. Dessa tekniska procedurer omfattar beskrivningar av konstruktion, produktion och transfektion av crispr styr RNA (gRNAs); mätningen av crispr mutationshastighet av T7E1 eller RFLP-analyser; och upprättande och validering av klonade muterade linjer. Slutligen, vi krönika förfaranden för hPSC differentiering till glukos-responsiv pankreatiska p-liknande celler genom att härma in vivo pankreas embryonal utveckling. Kombinera iCRISPR teknik med riktad hPSC differentiering möjliggör systematisk undersökning av geners funktion för att främja vår förståelse av bukspottkörteln utveckling och diabetes sjukdomsmekanismer.
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) har förmågan att både själv förnya och ge upphov till alla derivat av de tre embryonala köns linjerna. De ger en värdefull resurs för cellersättningsterapi och sjukdom modellering genom att fungera som en unik plattform för att rekapitulera cellulära processer i ett mänskligt utvecklingssammanhang. De är också en källa av experimentella celler för skalbara, hög kapacitet analyser. Framstegen har dock varit begränsad på grund av två huvudsakliga utmaningar: bristen på effektiva genetisk modifiering verktyg och svårigheten att rekapitulera de komplexa embryonala utvecklingssteg i en odlingsskål.
Genmodifiering är ett oumbärligt verktyg för att studera geners funktion i normal utveckling och sjukdomar. Men medan klassisk gen med inriktning på metoder via homolog rekombination har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att analysera geners funktion i mus embryonala stamceller (mESCs) 1, detta tillvägagångssätthar varit mycket ineffektiv när det appliceras på hPSCs 2, 3. Den senaste tidens rask anslutning programmerbara, platsspecifika nukleaser från naturen till laboratorieanvändning, inklusive zinkfinger nukleaser (ZFNs), transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (Talens), och de klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) / crispr-associerade (Cas) system 4, innebär att genomet engineering har blivit en mycket enklare uppgift i ett brett spektrum av organismer och cellinjer, inklusive i hPSCs. Dessa gen redigeringsverktyg dra fördel av det faktum att chimära nukleaser såsom Cas9 endonukleas kan tillåta en hel rad genetiska modifieringar genom att inducera dubbelsträngade avbrott (DSB) vid exakta platser, utlöser den endogena DNA-reparation maskiner för att aktivera antingen icke-homolog sluta att gå (NHEJ) eller homologi riktad reparation (HDR). Båda mekanismerna kan utnyttjas för genetisk manipulation genom att inducera either slumpmässig insättning och deletionsmutationer (InDels, via NHEJ), för att skapa ramskiftningsmutationer som upphäver gen alleler, eller exakta nukleotidsubstitutioner (via HDR), för att rekapitulera patientens mutationer för humant modellering sjukdom eller för att korrigera en sjukdomsorsakande mutation för genterapi .
Crispr / Cas-medierad genom teknik kräver två komponenter: den ständiga RNA-styrda Cas9 endonukleas som krävs för DNA-klyvning och en rörlig crispr RNA (crRNA) och trans-aktiverande (tracrRNA) duplex som anger DNA måligenkännande. Den crRNA / tracrRNA duplex kan ersättas med en enda chimär styr RNA (gRNA), som har visat sig fungera mer effektivt 5, 6, 7. Medan crispr / Cas9-systemet har anpassats till de experimentella organismer och cellinjer, leverans och uttryck av Cas9 och gRNA varierar avsevärt och behöver optimeras ytterligare för att Achieve effektiv genomet redigering i många system, inklusive hPSCs 8. En effektiv genom-redigering plattform, iCRISPR, har etablerats i hPSCs 5. I detta system har en Talen-medierad tillvägagångssätt använts för att rikta in de båda allelerna av "transgen säker hamn locus" AAVS1 i träns, ett allel med en omvänd tetracyklin-kontrollerad transaktivator (M2rtTA) och den andra med en tetracyklin responselement (TRE ) som driver uttrycket av Cas9 (iCas9) i hPSCs. I etablerade klonala linjer (iCas9 hPSCs) är Cas9 starkt uttrycks med doxycyklin behandling. Samtidigt, på grund av sin ringa storlek (100 nt), enstaka eller flera gRNAs kan lätt levereras till iCas9 hPSCs med hög verkningsgrad och kan rikta Cas9 för platsspecifik klyvning, möjliggör en effektiv NHEJ-medierad gen störningar, liksom HDR-medierad precisa nukleotid modifieringar i närvaro av korta enkelsträngat DNA (ssDNA) donator mallar. Den iCRISPR systemet kan varaanvänds för att framgångsrikt generera en panel av sjukdomsliknande hPSC rader med bialleliska (homozygot eller förening heterozygot) eller heterozygota förlust av funktionsmutationer i viktiga utvecklings gener 5, 9. Medan ett antal grupper har rapporterat effektiv gen redigering med hjälp av crispr / Cas i hPSCs förblir framgång begränsad till ett litet antal tekniskt skickliga laboratorier. Den iCRISPR plattformen erbjuder en effektiv men ändå enkel lösning för rutin gen redigering av forskare på olika nivåer, och det har redan använts i ett antal publicerade studier av vår grupp och andra 9, 10, 11, 12. Detta tillvägagångssätt har också utvidgas till inducerbar tysta baserat på uttrycket av dCas9-KRAB 13.
Tillsammans med framsteg inom genomet redigering technonik, betydande förbättringar har också gjorts i hPSC underhåll och riktade differentiering. Odlingsbetingelser för hPSCs har utvecklats från bestrålad mus embryonala fibroblaster (Imef) matar beroende på matarfria förhållanden på definierade extracellulära matrixkomponenter och från komplexa medier formuleringar för att kemiskt definierade mediumförhållanden 14. Sådana förbättringar har minskat variationen i hPSCs på grund av sats till sats skillnader i Imef förberedelse och knockout serumersättningskomponenter, och därmed ge en mer reproducerbar miljö för hPSC differentiering. Samtidigt ökad kunskap om signalvägar som styr mänsklig embryonal utveckling, samt upptäckter från hög genomströmning drog filmvisningar, har lett till förbättrade differentieringsprotokoll 15, 16, 17, 18. Dessa protokoll närmare efterlikna i vivo utvecklingssteg och generera celltyper som är nära rekapitulera sina in vivo motsvarigheter. För hPSC differentiering i bukspottkörtelns härstamning, första protokoll härmade tidig pancreatic utveckling relativt väl men så småningom genererade polyhormonal p-celler som var omogna foster fenotyper och svarade dåligt på glukosstimulering. Senaste framstegen 16, 17, 19, 20 har gjort det möjligt för genereringen av glukoskänslig pankreatiska p-liknande celler, som gör det möjligt för oss att undersöka senare händelser, såsom bildningen och den ytterligare mognaden av monohormonal p-celler.
Här, vi detalj tillämpningen av genomet modifierade linjer för studien av pankreatisk utveckling genom att kombinera iCRISPR systemet med hPSC-baserade in vitro differentiering plattformen mot glukos-responsiv pancreatic p-liknande celler. Denna koppling av kraftfulla genomet redigeringsverktyg med ett förbättrat hPSC differentiering protokollet ger inte bara snabbare och krävs för att möta den växande efterfrågan för att validera sjukdom kausalitet, utan möjliggör även avancerade genetiska manipulationer för ytterligare mekanistiska undersökningar transkriptionskontroll underliggande normal utveckling och sjukdomar 9 .
Tids Överväganden för att generera Mutant Lines
Även de senaste metoder baserade på crispr / Cas system för genom redigering har lett till en framgångsrik inriktning skulle en mer effektiv och universell plattform vara att föredra för större skala analyser av geners funktion. Den iCRISPR plattformen erbjuder en snabb och effektiv metod för att introducera mutationer i någon gen av intresse 5, 9. För det första medger det PCR-baserade gRNA syntesmetod produktionen av hundratals gRNAs i klädd format i en dag utan de tidskrävande kloningssteg. För det andra, med doxycyklin-inducerbara Cas9 uttryck i iCas9 hPSCs steget involverar gRNA transfektion kräver endast en minimal mängd arbete, och därmed kan flera gRNA inriktnings experiment genomföras samtidigt. Tredje, på grund av den höga inriktning effektiviteter kan uppnås med vårt system, analysen av ~ 24 – 48 kolonier per gRNA transfekterade bör vara sufficient att etablera flera monoallel och bialleliska muterade linjer för en enda gen, även om effektivitet varierar beroende på målstället. Eftersom det är möjligt för en utbildad person att mekaniskt plocka 384 kolonier (4 x 96 brunnar) i ett sammanträde, som ska ta ~ 4 timmar under ett dissektionsmikroskop, kan man räkna med en utbildad person att generera muterade linjer som påverkar 12 gener inom 12 månader. Den strömlinjeformade generation hPSC mutanter på kort tid gör det möjligt att systematisk analys av en uppsättning av transkriptionsfaktorer och / eller signaleringsvägen komponenter som samverkar med varandra, genom utvecklingsprocessen 9. Dessutom, effektiv multiplex genmålinriktning öppnar också dörren för att undersöka genetiska interaktioner underliggande komplexa mänskliga drag.
Generation av Precise genetiska modifieringar
Härledningen av patientspecifika iPSCs från lättillgänglig somatisk celltyp s och differentieringen till sjukdomsrelevanta celltyper ger en stor möjlighet för den funktionella validering av sjukdomsassocierade mutationer. Men på grund av den stora variationen i genetisk bakgrund mellan individer, direkta jämförelser mellan iPSCs från patienter och från friska donatorer kan inte tillåta en att skilja sjukdoms fenotyper från bakgrundseffekter. Därför är det nödvändigt att generera isogena kontroll iPSCs genom att korrigera sjukdomen mutationen tillbaka till vildtypssekvensen eller att införa patientspecifika mutationer i en vild-typ hPSC bakgrund, som föreslagits av andra 25, 26. Förutom förlust-of-funktion (null) mutationer, kan man nu mer exakt dissekera sjukdomsmekanismer genom införandet av ett patientspecifika sekvensförändringar i det endogena lokus i hPSCs, inklusive hypermorphic, hypomorphic, neomorphic eller dominant-negativa patienter mutationer.
ntent "> Precise genetisk modifiering sysselsätter HDR för DSB-reparation i närvaro av en mall reparation. Eftersom det är mycket mindre effektiv än NHEJ-medierad DNA-reparation, en donatorplasmid som innehåller den patientspecifika mutationen, en läkemedelsselektionskassett, och homologiarmarna har tidigare använts som reparations mall 2. Efter val av läkemedel och kontroll av patientspecifika mutationen är ett andra steg i allmänhet krävs för att ta bort markeringen läkemedelskassetten. Även de mest använda Cre-loxP och FLP-FRT-system lämnar bakom restsekvensen i den endogena lokuset, har användningen av piggyBac transposon tillåts för sömlös avlägsnande av läkemedelsselektionskassetten 27. Mer nyligen korta ssDNA mallar har också visats att stödja effektiv HDR med konstruerade DNA-endonukleaser 28. Jämfört med en donatorplasmid , ssDNA kan direkt syntetiseras och kringgår därmed tidskrävande kloningssteg. Här har det varasv visat att genom att samtransfektera gRNA och en ssDNA-mall för att inducera homologi riktad reparation kan iCRISPR användas för att introducera specifika nukleotid ändringar med hög verkningsgrad. Detta är avgörande för att inte bara dissekera roll essentiella nukleotider inom protein funktionella domäner, utan också för att modellera mutationer humana sjukdoms och potentiellt korrigera dessa sjukdomsassocierade mutationer för terapeutisk intervention. På grund av det stora antalet susceptibility loci som var och en är associerad med multipla sekvensvarianter, modellering komplexa och multigena sjukdomar såsom diabetes har varit en utmaning för genetiker. Eftersom iCRISPR plattformen är tillåtande för snabb generering av en allel serie eller multiplexable gen inriktning kan det underlätta utredningen av flera sjukdomsassocierad loci, antingen enskilt eller i kombination med isogena bakgrunder.Inriktning effektiviteten och Off-mål Effekter
Vi har funnit en god korrelation mellan den T7E1 och RFLP-analysresultat och antalet mutanta linjer som identifieras genom sekvensering. Detta understryker vikten av att utföra dessa analyser parallellt med etableringen av klonala linjer. Medan de inriktnings effektiviteter uppnås kan variera beroende på den genomiska loci i de flesta enkel-gene-targeting experiment, 20 – var 60% av klonema hittades med båda allelerna muterade (inklusive in-ram och ramskiftningsmutationer) 9. I de fall där multiplex gen inriktning utfördes, var trippel bialleliska muterade kloner med 5-10% effektivitet erhållits 5. ssDNA-medierad HDR av flera gener utfördes också för att få exakta genetiska förändringar, med effektivitet för att erhålla homozygota knock-in kloner som sträcker sig från 1 till 10% 5. Arbeta med crispr / Cas i hPSCs eventuella mutationer i potentiella utanför mål webbplatser som inte delar samma gRNA målsekvensen ännu inte upptäcktlass = "xref"> 5, 9, 12. Helgenom-sekvensering utförs i en färsk studie har också misslyckats med att identifiera betydande utanför mål mutationer i klon hPSC linjer genereras med hjälp crispr / Cas 29. Ändå, för att minimera eventuella effekten av confounding fenotyper infördes genom mutationer vid off-mål effekt platser, föreslås det att generera oberoende muterade linjer med åtminstone två oberoende gRNAs inriktade på olika sekvenser inom samma gen. Liknande fenotyper som observerats i flera rader som genereras med hjälp av olika gRNAs kunde huvudsakligen utesluta möjligheten att fenotypen kommer från en off-target effekt.
Feeder-beroende kontra oberoende kultur och inriktning
Traditionella metoder för hPSC kultur involverar deras underhåll och expansion på matarceller i media som innehåller serum eller ersättnings serum som innehåller djur proddukter, såsom bovint serumalbumin. Matarceller, serum, serumersättnings och albumin alla innehåller komplexa odefinierade komponenter och visar betydande parti variabilitet. Anpassning till mataren fria och kemiskt definierade tillstånd minskar avsevärt ansträngningar för hPSC underhåll och, ännu viktigare, ökar konsekvens av differentieringsexperiment. För närvarande finns det mycket få studier som beskriver genomredigerings förfaranden för hPSCs odlade i fullständigt definierade odlingsbetingelser 30. Vi har funnit högre crispr inriktning effektiviteten när gRNA transfektion och klon avsättning utfördes i matarfria förhållanden jämfört med matarberoende odlingsbetingelser. Vi tror att detta beror på ökad cellöverlevnad efter transfektion och encelliga sådd för kolonibildning. Dessutom har matarceller som tidigare visats binda transfektionsreagens och därigenom sänka transfektionseffektivitet.
KombinerandeGenome redigering med riktad differentiering
Har gett tidigare differentiering protokoll endast en liten del av insulinpositiva celler, varav de flesta var polyhormonal och liknade foster endokrina celler 23. Den senaste tidens framsteg har gjort det möjligt differentieringen av hPSCs i mer mogna glukoskänslig beta-liknande celler 16, 17, 19, 20. Vi kan rutinmässigt erhålla åtminstone 75% definitiva endoderm celler, 40% PDX1 + NKX6.1 + bukspottkörteln stamceller, och cirka 20% NKX6.1 + CPEP + glukoskänslig beta-liknande celler med hjälp av HUES8 hPSCs 9. I kombination med iCRISPR genomet redigering system, har detta mer robust differentiering protokoll underlättade analysen av transkriptionsfaktorer som är avgörande för bukspottkörteln progenitorceller och endokrina stadier av pankreas differentiering. Detta kommer att göradet möjligt att i framtida studier för att undersöka ett stort antal kandidat sjukdomsgener för funktionell validering och utredning av mekanismer som ligger bakom diabetes 9.
Framtida Program eller Vägbeskrivning
Vårt iCRISPR systemet kan underlätta skapandet av mer komplexa genomiska modifieringar, såsom skapandet av reporter alleler genom HDR-medierad gen inriktning med lång givar DNA-mallar som kodar för protein taggar eller fluorescerande reportrar 12. Vi har visat att, beroende på den höga crispr inriktnings effektiviteter uppnås i systemet, kan denna process utföras i hPSCs, utan behov av urvalet 12 ytterligare läkemedel. Dessutom kan multiplex genmålinriktning användas för att undersöka genetiska interaktioner underliggande komplexa mänskliga sjukdomar, som visas i vår senaste studie, som vi tror är det första exemplet på sådant arbete 31. ICRISPR kan också användas för att förstå gen tillsyn genom att skapa deletioner antingen icke-kodande RNA eller i genen regulatoriska regioner, såsom promotorer och förstärkare. Att effektivt generera regulatoriska mutanter med användning iCRISPR kan gRNAs vara utformade för att störa bindningsstället av ett DNA-bindande protein, innefattande men inte begränsad till den basala transkriptionsmaskineriet eller en vävnadsspecifik transkriptionsfaktor. ssDNA-mall-förmedlad HDR kan också användas för att mutera specifika proteinbindande ställen. Slutligen föreställa vi att ytterligare optimering skulle möjliggöra användningen av iCRISPR plattform i hPSCs för högre genomströmning genetiska analyser av pluripotens fenotyper eller sjukdoms fenotyper när de kombineras med en in vitro-differentieringsprotokoll. Dessa iCRISPR-medierad studier kan göra det möjligt att snabbare identifiera kandidatsjukdomsassocierade gener och studier av deras funktionella betydelse.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats delvis av NIH / NIDDK (R01DK096239) och New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ stöddes av NYSTEM postdoktorsstipendium från Centrum för Stem Cell Biology av Sloan Kettering Institute.
Chemically defined medium (E8) | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included |
Truncated recombinant human form of vitronectin | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | 1X, animal origin free, recombinant enzyme |
G418 Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | Geneticin Selective Antibiotic |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | Puromycin Selective Antibiotic |
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) | Agilent Technologies | 600679 | PCR kit |
MEGAshortscript T7 Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1354 | |
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
Opti-MEM medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Reduced Serum Medium |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | QIAGEN | 69504 | Genomic DNA extraction kit |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
MCDB 131 medium | Thermo Fisher Scientific | 10372-019 | |
BLAR medium | Thermo Fisher Scientific | Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014) | |
L-glutamine supplement (GlutaMAX) | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
NaHCO3 | Thermo Fisher Scientific | 144-55-8 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
BSA | LAMPIRE Biological Laboratories | 7500855 | Fatty acid free |
GDF8 | PeproTech | 120-00 | |
CHIR-99021 | Stemgent | 04-0004 | GSK-3 inhibitor |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Vitamin C |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG | |
SANT1 | Tocris Bioscience | 1974 | Hedgehog inhibitor |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | Retinoic acid |
LDN | Stemgent | 04-0019 | BMP inhibitor |
IWP-2 | Tocris Bioscience | 3533 | Wnt antagonist |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | |
TPB | EMD Millipore | 565740-1MG | PKC activator |
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
ALK5i II | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | ALK5 inhibitor II |
ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
GSiXX | EMD Millipore | 565789 | Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor |
N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Trolox | EMD Millipore | 648471 | Vitamin E analogue |
R428 | Selleck Chemicals | S2841 | AXL receptor tyrosine kinase inhibitor |
24mm Transwell with insert | Corning Life Sciences | 3414 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | |
0.4 cm Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652081 | |
AAVS1-TALEN-L | Addgene | 59025 | |
AAVS1-TALEN-R | Addgene | 59026 | |
AAVS1-Neo-M2rtTA | Addgene | 60843 | |
AAVS1-Puro-iCas9 | Addgene | 58409 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302L | |
Buffer 2 | NEB | B7002S | NEBuffer 2 |
Long oligonucleotide | Eton Bioscience or IDT | ||
SOX17 antibody | R&D Systems | AF1924 | 1: 500 |
FOXA2 antibody | Millipore | 07-633 | 1: 100 |
CXCR4-APC antibody | R&D Systems | FAB170A | 1: 25 |
PDX1 antibody | R&D Systems | AF2419 | 1: 500 |
NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12 | 1: 500 |
NKX2.2 antibody | DSHB | 74.5A5 | 1: 100 |
NEUROD1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1084 | 1: 100 |
Insulin antibody | Dako | A0564 | 1: 2000 |
C-peptide antibody | DSHB | GN-ID4-c | 1: 2000 |
Glucagon antibody | Sigma-Aldrich | G2654 | 1: 1000 |