Summary
공기 액정 성 인터페이스 megamolecular 생체 고분자의 건조 - 유도 된자가 통합을위한 방법이 여기에 제공된다. 이 방법은 생체 고분자의 거시적 인 잠재력을 이해뿐만 아니라, 생물 의학, 환경 분야의 부드러운 소재에 대한 평가 방법으로뿐만 아니라 도움이 될 것입니다.
Abstract
물을 사용 살아있는 유기체는 항상 환경에서 건조하는 경향이 있습니다. 관다발 물을 이동 및 피부 층에 물 보습의 경우에서 볼 수 있듯이 이들의 활동은 생체 고분자 기반의 마이크로 및 매크로 구조에 의해 구동된다. 본 연구에서는 건조 생체 고분자로 이루어지는 수계 결정 (LC) 용액의 효과를 평가하기위한 방법을 개발 하였다. LC의 바이오 폴리머가 megamolecular 무게를 가지고, 우리는 다당류, 세포 골격 단백질과 DNA를 연구하기로 결정했습니다. 편광하에 건조시 생체 고분자 용액의 관찰 불안정한 공기 LC 인터페이스부터 milliscale자가 통합을 보여준다. 수성 LC 생체 고분자 용액의 역학은 일측 개방 셀로부터 물을 증발에 의해 모니터링 될 수있다. 교차 편광을 이용하여 촬영 된 영상을 분석함으로써, 배 양성 위해 파라미터의 시공간적 변화를 인식 할 수있다. 이방법은 인공 다양한 분야에서 물질뿐만 아니라 자연의 살아있는 조직뿐만 아니라의 특성 유용 할 수 있습니다. 우리는 생물 의학 및 환경 분야에서의 부드러운 소재에 대한 평가 방법을 제공 할 것입니다 믿습니다.
Introduction
생체 고분자의 강성, 막대 형상의 구조체에 초점을 동적 부드러운 물질은 다당류 생물막 행렬 1, 세포 골격 단백질이 이루어지는 "활성 겔"을 원하는 형상 (3)의 "DNA 접기」등, 다양한 용도로 사용되고있다. 구조적 특성을 명확히하기 위해, 많은 전략들이 이러한 투과형 전자 현미경, 주사 전자 현미경, 원자력 현미경, 및 공 초점 형광 현미경으로, 탐구되었다. 이러한 방법은 대부분 건조 또는 정적 상태에서 수행되기 때문에 그러나, 실제 생활 시스템에서 볼 수 있듯이, 거시적 규모의 동적 행동을 설명하기 어렵다. 최근에는 성공적으로 편광 된 광 (4)를 통해 수성 공기 LC 인터페이스 생체 고분자의 동적 거동을 관찰 하였다. 배향 구조의 시각화 동안 고분자 물질을 건조하는 동안용액의 시간적 변화는 불안정한 공기 LC 인터페이스 생체 고분자의자가 통합을 나타냈다.
여기서는 편광 수단을 이용하여, 공기 계면에서 LC LC 생체 고분자 용액의 건조를위한 프로토콜을 기술한다. 5,6 건조 고려하지 않는다는 LC상의 다른 분석 달리, 건조 공정 동안 LC 역학은 일측 개방 셀 내의 유체의 상 측면도의 배 양성 위해 파라미터를 평가하여 현재 조사했다 . 셀 증착의 조합 제어 증발 방향 육안 모니터링 허용 편광 수단의 사용. 또한,이 방법의 효과를 입증하기 위해, 분자량, 농도 등의 영향을받은 흡착 마이크로 도메인의 결정 구조에 집중하여 건조 기록을 확인할 수 있었다 건조 프로다당류, 미세 소관 (MTS), 및 DNA 등의 딱딱한 막대 모양 기본 생체 고분자의 세 스는 조사 하였다. 그들이 megamolecular 무게와 계층 거대 분자의 전형적인 예이며, 자신의 분자간 상호 작용 LC 상태를 형성 할 수 있도록하기 때문에 우리는이 생체 고분자를 선택했다.
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Protocol
1. 악기
- 편광 장치
- 편광 소자를 구성하는, 할로겐 램프, 도광판, 편광판, 시료 스테이지, 광학 레일로드 스탠드, 디지털 일안 리플렉스 카메라 (갖는 광원을 제공하는 편광에 대한도 1C와 자재 목록 참조 장치 부).
생체 고분자의 용액의 제조 (2)
- 다당류 솔루션
- 이상 ~ 12 시간 동안 80 ℃에서 교반하여 순수한 물 (100 mL) 중 sacran 7 (0.5 g)을 녹인다. 용해 중에, 증발을 방지하기 위해 플라스틱 포장으로 용기 커버. 동일하게 크 산탄 검의 수용액을 준비한다.
- 0.5 중량 % 수용액을 얻었다 ~ 25 ℃에서 용액을 냉각.
- 불순물 (48,400 XG, 4 ℃, 1 시간, 3 팀을 제거하는 용액을 원심 sacranES).
- MT 솔루션
- 브리튼 - 로빈슨 완충액에서 0.5 중량 %의 튜 불린 용액 (1 ml)에 준비 (80 mm의 N, N '비스은 피페 라진 (2- 에탄 설 폰산) (PIPES), 1 mM의 에틸렌 글리콜 비스 (β 아미노 에틸 에테르) - N, N, N ', N'-tetraacetic 아세트산 (EGTA); 얼음 8 5 밀리미터의 MgCl 2, pH를 6.8).
- 0.5 중량 % 튜 불린 용액 (50 μL) 및 사용 구아노 신 - 5 '- [(α, β) -methyleno] 포스페이트 (GpCpp) (5 μL)는 GpCpp 함유 튜 불린 용액 (50 μL)을 제조 하였다. 안정한 MT 핵을 얻기 위해 3 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
참고 : GpCpp의 역할은 MT 형성을 지원하기 위해 완전히 튜 불린에 MT의 해중합을 억제하는 것입니다. - 안정한 0.5 중량 % MT 용액을 수득 1 일 ~ 25 ° C에서 0.5 중량 % 튜 불린 용액 (950 μL) 및 GpCpp 튜 불린 - 함유 용액 (50 μL)를 섞는다.
- DNA 솔루션
- (1mM의 EDTA 10 개 mM 트리스, pH를 8.0) 트리스 EDTA 완충액에서 0.5 중량 %의 DNA 용액 (1 ml)로 준비한다.
- 건조 실험을 25 ℃에서 0.5 중량 %의 시료 생체 고분자 용액을 유지한다.
교차 편광 3. 건조 실험 및 관찰
- 한 측면에서 개방 셀 솔루션 (도 1a)
- 실리콘 낱장 1mm의 두께를 적절한 형상으로 (자재 목록 참조) (5-15 mm의 1mm의 내부 크기 및 ~ 20mm;도 1a).
- ~ 20mm 두 비 개질 된 유리 슬라이드 (76mm × 1 mm × 26 mm)을 5-15 mm 1 mm의 내 치수를 갖는 실리콘으로 이루어지는 스페이서의 한쪽 개방 셀을 조립하고. 누출에서 시료 용액을 유지하기 위해 사전에 더블 클립 셀의 양면을 수정합니다.
- 천천히 ~ 1 mm의 기공 크기를 피펫을 사용하여 0.5 중량 %의 생체 고분자 용액 (100-300 μL)을 각각 추가~ 25 ℃에서 각 셀에 TE 팁. 주사기 바늘을 사용하여 세포로부터 기포를 제거한다.
- 증발 대기압하에 60 ℃에서 공기 순환 오븐에서 함께 세포로; 증착 방향이 중력의 반대이다.
- 실리콘 낱장 1mm의 두께를 적절한 형상으로 (자재 목록 참조) (5-15 mm의 1mm의 내부 크기 및 ~ 20mm;도 1a).
- 교차 편광하에 관찰 (도 1B-1C)
- 광역 (80mm X 80mm) 위에 평평한면 광원으로는 100 W 할로겐 램프를 통해 직선 가시 광선을 제공한다. 홀더 (도 1C)를 사용하여 45 ° 및 135 °에 편광판을 조정한다.
- 광학 레일로드 스탠드 (도 1C)를 사용하여, 광원, 편광기, 샘플 스테이지, 카메라의 위치를 고정한다. 두 편광판 사이에 시료 스테이지를 배치 (편광판 사이의 거리는 5cm ~이어야한다). 집중 할 수 있도록 샘플 단계부터 ~ 20cm를 카메라를 놓습니다.
- 주어진 시간에, 폴라 사이의 단계 3.1.3에서 샘플을 배치XZ 평면에 평행 한 단에 rizers 검은 커튼 장치를 커버; 실제 장치가도 1c에 도시되어있다.
- 표준 줌 렌즈와 디지털 일안 리플렉스 카메라를 사용하여 선형 교차 편광판을 통해 샘플을 촬영 (재료 목록 참조). 컴퓨터 소프트웨어 (자료 목록을 참조)을 사용하여, 같은 초점 거리와 같은 카메라 설정을 제어 할 수 있습니다.
- 투과광 강도의 시공간적 분석 (도 1C)
- 건조 공정의 순서 배 양성 파라미터의 변화를 평가하기 위해 24 시간 동안 시간당 사진을 수집한다.
- (예 ImageJ에) 화상 처리 프로그램을 사용하여 그레이 값과 Z 방향의 중심선을 따라 투과광의 강도를 측정한다.
- 상부 개방 측으로부터의 거리의 함수로서 그레이 값의 그래프를 그린다.
- 교차 편광 조명 관리에서 현미경 관찰t (도 1D)
- , 방법을 확인 CCD 카메라 (9)가 장착 된 편광 현미경 현미경 관찰을합니다. 빛의 경로에 일차 위상차 판을 보관하십시오. PC에 소프트웨어를 사용하여 사진에 대한 조건을 제어합니다.
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Representative Results
도 1에 도시 된 바와 같은 장치를 사용하여 미소 영역에서 자기 통합 에어 LC 인터페이스 평가 건조 (도 2A)에 macrodomain한다. 건조 실험의 처음 입증 된 바와 같이, megamolecular 다당류 sacran (M w = 1.9 × 10 7g 몰 -1) 및 크 산탄 검 (4.7 × 106 그램 몰 -1) 두 종류, 비교 하였다. 도 2b는 교차 편광하에 셀 내의 용액의 사진을 보여준다. 건조 전에 두 솔루션의 산란 상태에서의 투과광 여러 밝은 영역을 관찰 할 수 있었다. 6 시간 동안 60 ℃에서 건조시킨 후, 용액 sacran 공기 LC 인터페이스 아래의 영역은 상당히 높은되었다. 이것은 도메인 겔 수축 과정에서 스킨 층의 형성과 동일한 인터페이스에서의 거시적 배향 구조를 형성한다는 것을 의미"외부 참조"> 10. 온도는 단지 60 ℃까지 25 ℃로 증가시키고, 일부 작은 macrodomains 인터페이스 아래 관찰시 한편, 잔탄 용액의 강도가 급격히 감소 하였다. 산탄 마이크로 도메인의 이동이 훨씬 더 민감 sacran 마이크로 도메인보다 온도 때문이다. 인터페이스의 방향의 중요한 차이점 따라서 편광 장치를 사용하여 검출 하였다.
도 2C 및 영화 S1은 sacran 용액의 건조 공정에 대한 시공간적 분석 결과를 나타낸다. 투과 된 빛의 강도는 마이크로 도메인의 배 양성 위해 파라미터를 나타낸다. 공기 - 액체 계면 주위의 피크 강도가 현저하게 증가하고, 두께가 1 ~ 2 mm로 증가했다. 이러한 결과는 명확 마이크로 도메인 공기-LC 인터페이스에서 동양으로 시작을 나타냅니다인터페이스에 milliscale 도메인 병렬로 성장 거라고. 편광 하에서 이러한 관찰로부터, 건조 공정 내의 유체 운동을 가시화하는 것이 가능하다.
macrodomain 크기와 배향 방향의 관점에서 sacran와 크 산탄 검의 차이는 일차 위상차 판 (도 2d)을 편광 현미경에 의해 확인 하였다. sacran 유체 상 번의 macrodomain 인터페이스에 형성 즉, 하나 개의 청색 영역을 나타내었다. 반대로, 크 산탄 검 유체 상 다수 macrodomains 임의의 방향으로 형성되는 것을 의미하는, 청색, 노란색, 핑크 영역을 나타내었다.
이 방법은 또한 megamolecular 무게와 기본 생체 고분자 강성 세 가지 유형의 비교 탐구 하였다 - 다당류 (sacran : M w = 1.9 × 10 7g 몰 -1, 마이크로 도메인길이> 20 μm의), 이동 단말 (w M = 10 9 -10 10g 몰 -1, 마이크로 도메인 길이> ~ 10㎛), 및 DNA (M 1.3 × 10 6g 몰 -1 = w 마이크로 도메인의 길이 <1 ㎛) - 37 ℃에서 생리적 환경이다. 그림 (b)에 도시 된 바와 같이 건조하기 전에 sacran 솔루션과 MT 솔루션은 전 지역에 흩어져 도메인과 유사한 LC 상태를 보여 주었다. 건조 과정에서 MT 솔루션의 도메인은 공기-LC 인터페이스에서 자기 통합을 시행하고, 흩어져 도메인은 하나의 macrodomain에 통합되었다. 한편, DNA 용액 액상 특정 방향 없었다. 이동 단말의 버퍼 용액으로 제조 된 DNA 용액의 경우에는, 그 통합은 건조 중에 염 농도, 산도 및 이온 강도의 변동에 의해 영향을받는 것이 중요하다.
(도 3c)을 편광 현미경으로 관찰 하였다 명확히한다. sacran 건조 레코드 때문에 milliscale 단일 macrodomain 형성의 중요한 복굴절 강도를 나타내었다. 이동 단말 건조 기록을 위해, 우리는 장축이 X 축에 평행 한 물결이었다 번들을 관찰 하였다. 반면, DNA 용액의 건조 기록 입자 형상 macrodomains <지름 5 ㎛의 임의의 방향을 나타내었다. 이러한 관찰에서, macrodomain 크기가 막대와 같은 마이크로 도메인의 길이에 의해 영향을받는 것은 분명하다. 이 편광 현미경을 사용하여 건조 레코드를 관찰하여 생체 고분자 마이크로 도메인의 배향 방향을 평가하는 것이 가능했다.
결론적으로 편광 된 광을 사용하는 방법을 사용 하였다건조 공기 LC 인터페이스 megamolecular 바이오 폴리머의 자기 통합. 수성 LC 용액의 역학은 일측 개방 셀로부터 물을 증발에 의해 모니터링 하였다. 교차 편광을 이용하여 촬영 된 영상을 분석함으로써, 공간 - 시간 변화와 배 양성 위해 파라미터를 인식 할 수 있었다. 입증 된 건조 과정이 자연적인 과정과 유사하다는 점을 감안,이 방법은 다양한 분야에서뿐만 아니라 인공 재료의 특성에 유용 할뿐만 아니라, 자연의 살아있는 조직의 것입니다. 우리는이 생물 의학 및 환경 분야에서의 부드러운 소재에 대한 평가 방법을 제공 할 수 있다고 생각합니다.
그림 1 : 실험을 건조. (A) 편면 오픈 셀 내의 용액의 도식 그림. (B)교차 편광하에 관찰에 사용되는 실험 장치의 개략도. 편광판은 일반적으로 45 °, 135 °로 조정 하였다. (C) 실제 장치. 이 수치는 문헌 6에서 수정되었다. 저작권 : 미국 화학 학회, 2016 년은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : 다당류 sacran와 크 산탄 검의 수용액의 건조 공정. (A) 건조 공기-LC 인터페이스에서 자기 통합의 개략도. (B) 초기 상태에서 이후 다당류 솔루션 두 가지 종류의 사이드 뷰교차 편광하에 60 ℃에서 6 시간 건조. 초기 중합체의 농도는 0.5 중량 %였다. (C) 주어진 시간에서 촬상 된 각 화상에 대한 Z 방향의 선에 교차 니콜 통하여 광 강도를 전송된다. (D) 60 ° C에서 6 시간 건조 후 셀 내의 고분자 용액의 편광 현미경 이미지. 빨간색 화살표 : 인터페이스에 macrodomains. 이 수치는 문헌 6에서 수정되었다. 저작권 : 미국 화학 학회, 2016 년은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 생체 고분자 수용액 및 건조 레코드 건조 공정. (A)가 폴리곤의 소스accharides (시아 노 박테리아), 이동 단말 (돼지의 뇌), 및 DNA (연어의 정소). (B) 교차 편광하에 37 ℃에서 건조시 sacran, MT 및 DNA 용액의 측면도. 초기 중합체의 농도는 0.5 중량 %였다. (C) 교차 니콜의 소정의 방향을 통해 유리 기판 상에 건조 된 중합체 필름의 현미경 이미지. 모든 규모의 바는 50 μm의 수 있습니다. 이 수치는 문헌 6에서 수정되었다. 저작권 : 미국 화학 학회, 2016 년은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 S1 : 60 ° C에서 건조 중에 sacran 용액 공정, 건조하여 관찰교차 니콜. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 때문에 투과광 강도가 너무 낮있는 카메라 샘플에 초점을 때로는 어려웠다. 이러한 경우, 무대에서 확장 된 투명 플라스틱 필름을 배치하는 것은 초점을 준비하는 데 도움이. 관측 가능한 해상도의 한계는 ~,이 경우에는 10 μm의 카메라 렌즈에 의존했다. 샘플의 두께, ΔY, 상기 관찰 ~ 제한이 경우 10mm 램프의 최대 광 강도에 의존했다.
도 1b에 도시 된 장치의 장점은 샘플의 사이드 뷰 사진 건조 공정 중에 수행 할 수 있다는 것이다. 관찰은 일반적인 현미경에 사용되는 수평면에 의존하지 않고 행할 수있다. 건조 실험 중 한쪽 개방 셀 서서, 증착 방향 조절 및 중력의 반대 방향이다. 측면도 모니터링 또한 건조 쥐의 계산을 가능하게전자 4.
미래에, 상기 장치의 시료 대에 온도 및 습도 조절기를 배치함으로써, 자동으로 배 양성 위해 파라미터 시간적 변화를 모니터하는 것이 가능할 것이다. 또한, 체중 변화를 모니터링하기 위해 설치의 균형 농도의 추정을 도움이 될 것이다. 이 방법은 폴리 사카 라이드 (11)로 하이드로 겔 (12)은 이방성 팽윤 처리를 명확히하기 위해 사용될 수있다. 따라서, 소프트 액추에이터의 구조적 변화를 모니터하는 것이 가능하다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 보조금의 원조 교육부, 문화, 스포츠, 일본의 과학 기술, 교토 Technoscience 센터 및 연구 개발에 대한 미타니 재단 젊은 과학자 (16K17956)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sacran | Green Science Materials Inc., Japan | From Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1 |
|
| xanthan gum | Taiyo Kagaku Co., Japan | Neosoft XC | From Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1 |
| tubulin | Cytoskeleton, Inc., USA | T240 | From porcine brain. |
| GpCpp | Jena Bioscience, Germany | NU405L | |
| piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrichi, Co. LLC. | P6757-500G | PIPES |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 342-01314 | EGTA |
| MgCl2-6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-15055 | |
| KOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 162-21813 | pellet |
| DNA | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | D1626 | From salmon testes. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp) |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | T9285-100ML | 10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA |
| slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan | S1111 | |
| silicon rubber sheet | Asone Co. | 6-611-32 | Thickness: 1 mm |
| centrifuge | Beckman-Coulter, Inc., USA | Avanti J-25 | equipped with a JA-20 rotor |
| light source | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | LS-LHA | |
| light guide | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M) | 80 mm × 80 mm |
| halogen lamp | Ushio Inc., Japan | JCR 15V150WBN | |
| holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | KMH-80 | |
| sample stage | Sigmakoki, Co.,Ltd. | TARW-25503L | |
| sample holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | SHA-25RO | |
| rod | Sigmakoki, Co.,Ltd. | ROU-12-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-6-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-60 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-80 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-130 | |
| carrier | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CAA-25LS | |
| camera holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CMH-2 | |
| medium optical rail | Sigmakoki, Co.,Ltd. | OBA-500SH | |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L25 mm |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L50 mm |
| multiband | Tomytech, BORG | 80φ | |
| V plate | Tomytech, BORG | V plate 60S | |
| plate holder | Viexen, Co.,Ltd. | plate holder SX | |
| EOS Kiss X7i | Canon Inc., Japan | 8594B001 | with a standard zoom lens, EFP 18-55 mm |
| photographic software | Canon Inc., Japan | EOS Utility | |
| PC | Microsoft | Surface | |
| polarization microscope | Olympus | BX51 | |
| first order retardation plate | Olympus | U-TP530 | λ = 530 nm |
| CCD camera | Olympus | DP80 | |
| photographic software | Olympus | cellSens Standard | |
| Java-based image processing program | the National Institutes of Health | ImageJ |
References
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- Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
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- De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
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