Summary
En fremgangsmåte for tørking-indusert selv integrering av megamolecular biopolymerer på luft-væske krystallinsk grensesnitt er tilveiebrakt her. Denne metodikken vil være nyttig ikke bare for å forstå de makroskopiske potensialene av biopolymerer, men også som et evalueringsmetode for myke materialer i biomedisinsk og miljømessige felt.
Abstract
Levende organismer som bruker vann er alltid utsatt for tørking i miljøet. Deres virksomhet er drevet av biopolymer-baserte mikro- og makrostrukturer, som sett i tilfeller av bevegelige vann i vaskulære bunter og fuktighetsgivende vann i hudlagene. I denne studien er det utviklet en metode for å vurdere effekten av vandige flytende krystallinske (LC) løsninger bestående av biopolymerer ved tørking. Som LC biopolymerer har megamolecular vekt, valgte vi å studere polysakkarider, cytoskeletal proteiner og DNA. Observasjonen av biopolymeroppløsninger under tørking under polarisert lys viser milliscale selv integrasjon ved å starte fra den ustabile luft LC grensesnitt. Dynamikken til de vandige LC biopolymeroppløsninger kan overvåkes ved fordampning av vann fra en ett-sideåpne celler. Ved å analysere bildene tatt ved bruk av krysspolariserte lys, er det mulig å gjenkjenne spatio-temporale endringer i orienteringsmessig orden parameter. DetteFremgangsmåten kan være nyttig for å karakterisere ikke bare kunststoffer på forskjellige områder, men også naturlig levende vev. Vi tror at det vil gi en evaluering metode for myke materialer i biomedisinsk og miljømessige felt.
Introduction
Ved å fokusere på de stive, stavformede strukturer av biopolymerer, har dynamiske myke materialer blitt benyttet for ulike bruksområder, inkludert polysakkarid biofilm matriser 1, "aktive" geler består av cytoskjelettproteiner 2, og "DNA origami" av ønskede former 3. For å klargjøre de strukturelle egenskapene, har mange strategier blitt undersøkt, slik som transmisjonselektronmikroskopi, scanning elektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi, og konfokal fluorescens mikroskopi. Men fordi disse metodene er stort sett gjennomført i tørket eller statisk tilstand, er det vanskelig å forklare dynamiske atferd i makroskopiske skalaer, som sett i selve levende systemer. Nylig har vi lykkes observerte den dynamiske oppførsel av biopolymerer i den vandige luft-LC-grensesnittet via polarisert lys 4. Under visualiseringen av den orienterte struktur under tørking biopolymerenløsning, tidsmessige endringer indikerte selv integrering av biopolymerer på ustabile luft LC-grensesnitt.
Her beskriver vi en protokoll for tørking av LC-biopolymer-oppløsninger ved luft-LC grensesnittet ved hjelp av polariserte instrumenter. I motsetning til andre analyser av LC fase som ikke anser tørking 5, 6, ble LC dynamikken i løpet av tørkeprosessen undersøkt her ved evaluering av orienteringsmessig orden parameteren i sideriss av væskefasen i en ett-side-åpencellet . Kombinasjonen av cellen fordampning og bruk av polarisert instrumenter som er tillatt for makroskopiske overvåking med en kontrollert fordampning retning. I tillegg, var det mulig å validere tørke postene ved å fokusere på de krystallinske strukturer av de adsorberte mikroområder, som ble påvirket av molekylvekt, konsentrasjon, etc. For å vise effektiviteten av fremgangsmåten, tørke proprosesser av basiske biopolymerer med stiv stang former, slik som polysakkarider, mikrotubuli (MTS), og DNA, ble undersøkt. Vi valgte disse biopolymerer fordi de er typiske eksempler på hierarkiske makromolekyler med megamolecular vekter, og deres inter interaksjoner gjøre dem i stand til å danne LC stater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. instrumenter
- polarisering enhet
- For å konstruere en polariseringsinnretning, tilveiebringe en lyskilde med en halogenlampe, en lysleder, polarisatorer, et prøvetrinn, en optisk skinne, stang står, og en digital speilreflekskamera (se figur 1C og Materialliste for polarisasjonen enhets deler).
2. Fremstilling av biopolymerløsning
- polysakkarid løsninger
- Oppløs sacran 7 (0,5 g) i rent vann (100 ml) ved omrøring ved ~ 80 ° C i mer enn 12 timer. Under oppløsningen, dekke beholderen med plastfolie for å hindre fordampning. Fremstill en vandig oppløsning av xantangummi på samme måte.
- Avkjøl oppløsningene ved ~ 25 ° C for å oppnå 0,5 vekt% vandige oppløsninger.
- Sentrifuger sacran løsningen for å fjerne urenheter (48.400 x g, 4 ° C, 1 time, 3 times).
- MT-løsning
- Tilbered en 0,5 vekt% tubulin-løsning (1 ml) i en Britton-Robinson-buffer (80 mM piperazin-N, N'-bis (2-etansulfonsyre) (PIPES), 1 mM etylenglykol-bis (β-aminoetyleter) - N, N, N ', N'-tetraeddiksyre (EGTA), og 5 mM MgCl2, pH 6,8) på is 8..
- Bruk 0,5 vekt% tubulin-oppløsning (50 mL) og guanosin-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfat (GpCpp) (5 ul) for å fremstille en GpCpp holdig tubulin-løsning (50 uL). Inkuber ved 37 ° C i 3 timer for å oppnå en stabil MT kjerne.
MERK: rolle GpCpp er å støtte MT dannelse og for å fullstendig undertrykke den depolymeriseringen av MT til tubulin. - Bland 0,5 vekt% tubulin-løsning (950 ul), og GpCpp holdige tubulin-oppløsning (50 mL) ved -25 ° C i en dag for å oppnå en stabil 0,5 vekt% MT løsning.
- DNA-løsning
- Tilbered en 0,5 vekt% DNA-oppløsningen (1 ml) i Tris-EDTA-buffer-løsning (10 mM Tris, pH 8,0, med 1 mM EDTA).
- Hold 0,5 vekt% biopolymer prøveoppløsninger ved 25 ° C i tørke eksperimentet.
3. Tørking Eksperimenter og observasjon under Cross-polarisert lys
- Løsninger i en ett-sideåpne celler (figur 1A)
- Skjær en silikonplate (se Materialer List) inn i en passende form med en tykkelse på 1 mm (indre dimensjon på 5-15 mm, 1 mm, og ~ 20 mm, figur 1A).
- Montere en ett-side åpne celler som består av en silikonavstandsstykke med indre dimensjon av 5-15 mm, 1 mm, og ~ 20 mm og to ikke-modifiserte glassplater (76 mm x 1 mm x 26 mm). Fix begge sider av cellen med doble klips på forhånd for å holde prøveløsningen fra å lekke ut.
- Tilsett langsomt hver av de 0,5 vekt% biopolymer-løsning (100-300 ul) ved hjelp av en ~ 1 mm pore-størrelse pipettete spissen til hver celle ved ~ 25 ° C. Fjerne luftbobler fra cellene ved hjelp av en sprøytenål.
- Plassere cellene i en ovn med en luftsirkulasjonspumpe ved 60 ° C under atmosfærisk trykk for fordampning; fordampningen retning er motsatt av tyngdekraften.
- Skjær en silikonplate (se Materialer List) inn i en passende form med en tykkelse på 1 mm (indre dimensjon på 5-15 mm, 1 mm, og ~ 20 mm, figur 1A).
- Observasjoner i henhold til kryss-polarisert lys (figur 1 B-1 C)
- Gi rett synlig lys ved hjelp av en 100 W halogenlampe med en flat-overflate lyskilden over et stort område (80 mm x 80 mm). Juster polarisatorer til 45 ° og 135 ° ved hjelp av holderne (figur 1C).
- Feste posisjonene til lyskilden, polarisatorer, prøvetrinn, og kamera ved hjelp av en optisk bane og stang stender (figur 1C). Plasser prøven trinnet mellom de to polarisatorer (avstanden mellom polarisatorene bør være ~ 5 cm). Plasser kameraet ~ 20 cm fra prøven scenen for å tillate fokusering.
- Ved gitte tider, plasserer prøvene fra trinn 3.1.3 mellom polarizers på scenen parallelt med XZ-plan og slik at enhets med en svart gardin; selve apparatet er vist i figur 1C.
- Fotografere prøvene gjennom lineære krysset polarisatorer med et digitalt speilreflekskamera med en standard zoomobjektiv (se Materialer List). Kontrollere kamerainnstillingene, for eksempel brennvidde, ved hjelp av dataprogram (se Materialer List).
- Spatio-temporal analyse av den transmitterte lysintensiteten (figur 1C)
- For å bedømme endringen av orienteringsmessig orden parameter i tørkeprosessen, ta fotografier hver time i 24 timer.
- Måle den transmitterte lysintensiteten langs senterlinjen i Z-retningen som et grå verdi ved hjelp av et bildebehandlingsprogram (for eksempel ImageJ).
- Plotte en kurve over den grå verdi som en funksjon av avstanden fra den øvre åpne side.
- Mikroskopiske observasjoner i henhold til krysspolarisert light (figur 1D)
- For å kontrollere metoder, gjør mikroskopiske observasjoner med et polariseringsmikroskop utstyrt med et CCD-kamera 9. Hold en første-ordens forsinkelsesplate i lysbanen. Kontrollere betingelsene for bildene ved hjelp av en PC-programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av anordningen som vist i figur 1, til den selv integrasjonen fra microdomain macrodomain på et tørkeluft-LC grensesnitt ble evaluert (figur 2A). Som den første demonstrasjonen av tørke forsøket, to typer megamolecular polysakkarider, sacran (M w = 1,9 x 10 7 g mol -1) og xantangummi (4,7 x 10 6 g mol-1), ble sammenlignet. Figur 2B viser fotografier av løsningene i den celle i henhold til krysspolarisert lys. Før tørking, var det mulig å observere flere lyse områder med overført lys i en spredt tilstand i begge løsninger. Etter tørking ved 60 ° C i 6 timer, i området under den luft-LC-grensesnitt i den sacran oppløsningen ble betydelig høy. Dette betyr at domenene dannes en makroskopisk orientert struktur ved grenseflaten, som ligner på hud beleggdannelse i et gel-krympeprosess"xref"> 10. På den annen side, intensiteten av den xantan-løsning ble redusert drastisk når temperaturen ble bare øket fra 25 ° C til 60 ° C, og noen små macrodomains ble observert under grenseflaten. Dette er fordi mobilitet av xanthan microdomain er mye mer følsomme for temperatur enn den sacran microdomain. De kritiske forskjeller i retningen på grenseflaten ble således påvist ved hjelp av polariseringsanordning.
Figur 2C og film S1 viser resultatene av rom-tid-analyse med hensyn til tørkeprosessen i den sacran løsning. Lysintensiteten angir orienteringsmessig orden parameteren til microdomain. Toppintensiteten rundt luft-væske-grenseflaten økt betydelig, og tykkelsen vokste til ~ 2 mm. Disse resultatene indikerer klart at mikrodomenene begynner å orientere fra luft-LC grensesnitt end vokse inn i en milliscale domene parallelt med grenseflaten. Fra denne observasjon under polarisert lys, er det således mulig å visualisere fluidbevegelser i tørkeprosessen.
Forskjellene mellom sacran og xantangummi i form av macrodomain størrelse og orientering retning ble også bekreftet av et polarisasjonsmikroskop med en første-ordens forsinkelsesplate (figur 2D). Den sacran væskefasen viste en blå området, noe som betyr at en enkelt macrodomain dannet på grenseflaten. I motsetning til dette, viste det xantangummi væskefase blå, gul, og rosa områder, noe som betyr at flere macrodomains utformet med vilkårlige orienteringer.
Denne metoden ble også undersøkt for å sammenligne tre forskjellige typer av basiske stive biopolymerer med megamolecular vekter - polysakkarider (sacran: Mw = 1,9 x 10 7 g mol -1, microdomainlengde> 20 pm) ble MTS (Mw = 10 9 -10 10 g mol -1, microdomain lengde> 10 um), og DNA (Mw = 1,3 x 10 6 g mol -1, microdomain lengde <1 um) - i et fysiologisk miljø ved 37 ° C. Før tørking, som vist i figur 3B, den sacran oppløsningen og MT løsning viste lignende LC tilstander, med spredte domener i hele området. Under tørkeprosessen, domenene i MT oppløsning også undergikk selv-integrasjon fra luft-LC-grensesnittet, og de spredte domenene ble integrert i en enkelt macrodomain. På den annen side, den DNA-løsningen viste ingen spesifikk orientering i den flytende fase. I tilfelle av MT-løsning og den DNA-oppløsning fremstilt med buffere, er det viktig å merke seg at integrasjonen påvirkes av endringene i saltkonsentrasjon, pH og ionestyrke i løpet av tørkingen.
(figur 3C). Den sacran tørk posten oppviste betydelige dobbeltbrytnings intensiteter på grunn av den milliscale enkelt macrodomain dannelse. For MT tørke posten, observerte vi bølgeformede bunter hvor den lange akse var parallell med X-aksen. I motsetning til dette tørke registrering av DNA-løsningen viste korn-form macrodomains <5 um i diameter og i vilkårlige retninger. Fra disse observasjoner, er det klart at macrodomain størrelse påvirkes av lengden av de stavliknende mikrodomener. Det var således mulig å vurdere retningsorientering av biopolymer mikrodomener ved å observere tørke poster med et polarisasjonsmikroskop.
Som konklusjon, ble metoder under anvendelse av polarisert lys benyttesfor den selv integrering av megamolecular biopolymerer på tørkeluften LC-grensesnitt. Dynamikken til de vandige oppløsninger LC ble overvåket ved fordampning av vann fra en ett-sideåpne celler. Ved å analysere bildene tatt ved bruk av krysspolariserte lys, var det mulig å gjenkjenne spatio-temporale endringer og orienteringsmessig orden parameter. Tatt i betraktning at den viste tørkeprosessen er lik den naturlige prosesser, vil denne metoden være nyttig for karakterisering av ikke bare kunstige materialer i ulike felt, men også av naturlige levende vev. Vi tror at dette kan gi en evalueringsmetode for myke materialer i biomedisinsk og miljømessige felt.
Figur 1: Tørking eksperiment. (A) Skjematisk illustrasjon av oppløsningene i en ett-sideåpne celler. (B)Skjematisk illustrasjon av den eksperimentelle anordning som brukes for observasjoner i henhold til kryss-polarisert lys. Polarisatorene vanligvis ble justert til 45 ° og 135 °. (C) Selve apparatet. Dette tallet er blitt modifisert fra referanse 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tørkeprosessen av vandige oppløsninger av polysakkarider sacran og xantangummi. (A) Skjematisk illustrasjon av den selv integrasjon på tørkeluften LC-grensesnitt. (B) Side utsikt over to typer polysakkarid løsninger på sine første statene og etter6 timer med tørking ved 60 ° C under krysspolarisert lys. De første polymerkonsentrasjoner var 0,5 vekt%. (C) Lysintensiteten gjennom en kryssende Nicols på en linje i Z-retningen for hvert bilde tatt på et gitt tidspunkt. (D) Polariserings mikroskopiske bilder av polymeroppløsningene i cellen etter 6 timer med tørking ved 60 ° C. Røde piler: macrodomains på grensesnittet. Dette tallet er blitt modifisert fra referanse 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Tørkeprosessen av biopolymer vandige oppløsninger og tørking poster. (A) Kilder av polysaccharides (cyanobakterier), MT'er (porcine hjerne), og DNA (laksesperm). (B) Sideriss av sacran, MT, og DNA-oppløsninger under tørking ved 37 ° C under krysspolarisert lys. De første polymerkonsentrasjoner var 0,5 vekt%. (C) Mikroskopiske bilder av de tørkede polymer-filmer på glass-substratet gjennom det gitte retninger av de kryssede Nicols. Alle skala barer er 50 um. Dette tallet er blitt modifisert fra referanse 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film S1: Tørkeprosessen ifølge sacran løsningen i løpet av tørking ved 60 ° C, ble observert ved å brukekrysset Nicols. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det var noen ganger vanskelig for kameraet å fokusere på prøven på grunn av den overførte lysintensitet blir for lav. I slike tilfeller, å plassere en utvidet gjennomsiktig plastfilm på scenen hjalp til med å arrangere fokus. Begrensningen av den observerbare oppløsning var avhengig av kameralinsen, ~ 10 mikrometer i dette tilfellet. Den observerbare begrensning av prøvens tykkelse, Ay, var avhengig av den maksimale lysintensitet fra pæren, ~ 10 mm i dette tilfelle.
Fordelen med anordningen som er vist i figur 1B er at den tillater side se bilder av prøven som skal tas i løpet av tørkeprosessen. Observasjonen kan utføres uten å stole på horisontalplanet, som brukes i typiske mikroskoper. Ved å stå den ene-side-åpen celle i løpet av tørkeforsøk, er det fordampning retning regulert og i motsatt retning av tyngdekraften. Overvåking sideriss muliggjør også beregning av tørke rottee 4.
I fremtiden, ved å plassere temperatur og fuktighet regulatorer på prøven stadium av innretningen, vil det være mulig å automatisk overvåke tidsmessige endringer i orienteringsmessig orden parameter. Videre vil en balanse i oppsettet for å overvåke vektendring hjelpe estimering av konsentrasjonen. Denne metoden kan også bli anvendt for å klargjøre den anisotrope svellingsmetode ifølge polysakkarid hydrogeler 11, 12. Det vil derfor være mulig å overvåke strukturendringene myke aktuatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av stipend-i-aid for Unge Forskere (16K17956) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan, Kyoto Technoscience Center og The Mitani Stiftelsen for forskning og utvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sacran | Green Science Materials Inc., Japan | From Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1 |
|
| xanthan gum | Taiyo Kagaku Co., Japan | Neosoft XC | From Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1 |
| tubulin | Cytoskeleton, Inc., USA | T240 | From porcine brain. |
| GpCpp | Jena Bioscience, Germany | NU405L | |
| piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrichi, Co. LLC. | P6757-500G | PIPES |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 342-01314 | EGTA |
| MgCl2-6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-15055 | |
| KOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 162-21813 | pellet |
| DNA | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | D1626 | From salmon testes. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp) |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | T9285-100ML | 10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA |
| slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan | S1111 | |
| silicon rubber sheet | Asone Co. | 6-611-32 | Thickness: 1 mm |
| centrifuge | Beckman-Coulter, Inc., USA | Avanti J-25 | equipped with a JA-20 rotor |
| light source | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | LS-LHA | |
| light guide | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M) | 80 mm × 80 mm |
| halogen lamp | Ushio Inc., Japan | JCR 15V150WBN | |
| holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | KMH-80 | |
| sample stage | Sigmakoki, Co.,Ltd. | TARW-25503L | |
| sample holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | SHA-25RO | |
| rod | Sigmakoki, Co.,Ltd. | ROU-12-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-6-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-60 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-80 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-130 | |
| carrier | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CAA-25LS | |
| camera holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CMH-2 | |
| medium optical rail | Sigmakoki, Co.,Ltd. | OBA-500SH | |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L25 mm |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L50 mm |
| multiband | Tomytech, BORG | 80φ | |
| V plate | Tomytech, BORG | V plate 60S | |
| plate holder | Viexen, Co.,Ltd. | plate holder SX | |
| EOS Kiss X7i | Canon Inc., Japan | 8594B001 | with a standard zoom lens, EFP 18-55 mm |
| photographic software | Canon Inc., Japan | EOS Utility | |
| PC | Microsoft | Surface | |
| polarization microscope | Olympus | BX51 | |
| first order retardation plate | Olympus | U-TP530 | λ = 530 nm |
| CCD camera | Olympus | DP80 | |
| photographic software | Olympus | cellSens Standard | |
| Java-based image processing program | the National Institutes of Health | ImageJ |
References
- Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
- De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
- De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
- Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
- Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
- Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
- Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
- Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
- Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).
