Summary
Способ сушки-индуцированной самостоятельной интеграции megamolecular биополимеров на кристаллической поверхности раздела воздух-жидкость здесь предусмотрено. Эта методика будет полезна не только для понимания макроскопических потенциалов биополимеров, но и в качестве метода оценки для мягких материалов в биомедицинских и экологических областях.
Abstract
Живые организмы, которые используют воду всегда склонны к сушке в окружающей среде. Их деятельность движет биополимеров на основе микро- и макро-структур, как видно в случае движущейся воды в сосудистых пучков и увлажнение воды в слои кожи. В этом исследовании мы разработали метод оценки влияния растворов жидкости на водной основе кристаллического (LC), состоящих из биополимеров на сушке. Как LC биополимеры имеют megamolecular вес, мы решили изучить полисахариды, белки цитоскелета и ДНК. Наблюдение биополимерных растворов в процессе сушки в поляризованном свете обнаруживает milliscale уверенность в интеграции, начиная с неустойчивой поверхности раздела воздух-LC. Динамика водных растворов биополимеров LC может контролироваться путем выпаривания воды из одной боковой открытой ячейки. Путем анализа изображений , снятых с помощью кросс-поляризованного света, можно признать пространственно-временные изменения в параметре ориентационного порядка. Этаметод может быть полезен для характеристики не только искусственных материалов в различных областях, но и естественная жизнь тканей. Мы считаем, что это обеспечит метод оценки для мягких материалов в биомедицинских и экологических областях.
Introduction
Сосредоточив внимание на жестких, стержнеобразных структур биополимеров, динамические мягкие материалы были использованы для различных применений, в том числе полисахарида биопленки матриц 1, «активные» гелей , состоящих из белков цитоскелета 2, и «ДНК - оригами» желаемых форм 3. Для уточнения структурных свойств, многие стратегии были изучены, например, просвечивающей электронной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии и конфокальной флуоресцентной микроскопии. Однако, поскольку эти методы в основном осуществляется в высушенном или статическом состоянии, то трудно объяснить динамические модели поведения в макроскопических масштабах, как это видно в реальных живых системах. Недавно мы успешно наблюдали динамическое поведение биополимеров на водной поверхности раздела воздух-LC через поляризованный свет 4. Во время визуализации ориентированной структуры во время сушки биополимераРешение, временные изменения показали уверенность в интеграции биополимеров на неустойчивой границе раздела воздух-LC.
Здесь мы опишем протокол для сушки LC биополимерных растворов на границе раздела воздух-LC с использованием поляризованных инструментов. В отличие от других анализов ЖК - фазы , которые не считают сушки 5, 6, были исследованы здесь динамика LC в процессе сушки путем оценки параметра ориентационного порядка в боковой проекции жидкой фазы в одну сторону, открытую клетку , Сочетание клеточного испарения и использование поляризованных разрешенный к макроскопическому мониторингу с контролируемым направлением испарения. Кроме того, можно было проверить записи сушки, сосредоточив внимание на кристаллических структуры адсорбированных микродоменов, которые пострадали от молекулярной массы, концентрации и т.д. Для того, чтобы продемонстрировать эффективность метода, сушка процессы основных биополимеров с жесткими формами стержней, такие как полисахариды, микротрубочки (МЦ), и ДНК, были исследованы. Мы выбрали эти биополимеры, потому что они являются типичными примерами иерархических макромолекул с megamolecular весов, и их межмолекулярные взаимодействия позволяют им сформировать LC состояние.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. инструменты
- Поляризация устройство
- Для построения поляризационного устройства, обеспечивает источник света с галогенной лампой, световод, поляризаторы, стадия образца, оптический рельс, стержень стоит, и камеры цифровых однообъективных зеркальной (рисунок 1C и материалы Списка для поляризации части устройства).
2. Приготовление раствора биополимера
- Полисахариды решения
- Растворите sacran 7 (0,5 г) в чистой воде (100 мл) при перемешивании при ~ 80 ° С в течение более 12 часов. Во время растворения, накройте контейнер с пластиковой пленкой, чтобы предотвратить испарение. Готовят водный раствор ксантановой смолы таким же образом.
- Охлаждают растворы при ~ 25 ° С, чтобы получить 0,5 мас% водных растворов.
- Центрифуга sacran раствора для удаления примесей (48400 Xg, 4 ° С, 1 ч, 3 тимэс).
- решение MT
- Готовят 0,5 вес% раствора тубулина (1 мл) в буфере Бриттона-Робинсона (80 мМ пиперазина , N, N '-бис (2-этансульфоновой кислоты) (ТРУБЫ); 1 мМ этиленгликоль-бис (β-аминоэтил эфир) - N, N, N 'N' -tetraacetic кислота (ЭДТА); и 5 мМ MgCl 2, рН 6,8) на льду 8.
- Используйте 0,5 вес% раствора тубулина (50 мкл) и гуанозин-5' - [(α, β) -methyleno] трифосфат (GpCpp) (5 мкл) с получением GpCpp-раствора, содержащего тубулина (50 мкл). Инкубирую при 37 ° С в течение 3 ч, чтобы получить стабильное ядро МТА.
Примечание: Роль GpCpp заключается в поддержке формирования МТА и полностью подавить деполимеризации MT до тубулина. - Смешайте 0,5 вес% раствора тубулина (950 мкл) и GpCpp-раствора, содержащего тубулина (50 мкл) при ~ 25 ° С в течение 1 дня для получения стабильного 0,5 вес% раствора МТ.
- раствор ДНК
- Готовят 0,5 вес% раствора ДНК (1 мл) в буферном растворе Трис-ЭДТА (10 мМ Трис, рН 8,0, с 1 мМ ЭДТА).
- Хранить 0,5 мас% растворов биополимера образца при 25 ° С в течение эксперимента сушки.
3. Сушка Эксперименты и наблюдения под кросс-поляризованном свете
- Решения в одной боковой открытой клетке (Фигура 1А)
- Вырезать лист кремния (см список материалов) в соответствующую форму с толщиной 1 мм (внутренний аспект 5-15 мм, 1 мм, а ~ 20 мм; Фигура 1А).
- Собрать один бок открытой клетки, состоящую из кремния распорки с внутренней размерностью 5-15 мм, 1 мм, а ~ 20 мм и два немодифицированных стеклянных слайдов (76 мм × 1 мм × 26 мм). Закрепите обе стороны ячейки с двойными зажимами заранее, чтобы раствор образца от утечки.
- Медленно добавляют каждый из 0,5% -ного раствора биополимера (100-300 мкл) с использованием ~ 1 мм пипетку пор по размерамт.е наконечник к каждой ячейке при ~ 25 ° C. Удалить пузырьки воздуха из клеток с использованием иглы шприца.
- Поместите клетки в печи с воздушной циркул при 60 ° С при атмосферном давлении в течение испарения; направление испарения противоположно направлению силы тяжести.
- Вырезать лист кремния (см список материалов) в соответствующую форму с толщиной 1 мм (внутренний аспект 5-15 мм, 1 мм, а ~ 20 мм; Фигура 1А).
- Наблюдения под кросс-поляризованного света (рис 1B-1C)
- Обеспечить прямой видимый свет с помощью 100 Вт галогенной лампы с источником света плоской поверхности на обширной территории (80 мм х 80 мм). Регулировка поляризаторов до 45 ° и 135 ° , используя держатели (рис 1C).
- Закрепить позиции источника света, поляризаторы, стадию образца и камеры , используя оптический рельс и стержень стойку (рис 1C). Поместите образец стадию между двумя поляризаторами (расстояние между поляризаторами должно быть ~ 5 см). Установите камеру ~ 20 см от стадии образца, чтобы фокусировка.
- В заданные моменты времени, поместите образцы с шага 3.1.3 между Polarizers на сцене, параллельной плоскости XZ-и покрывают устройство с черным занавесом; реальное устройство показано на фиг.1C.
- Сфотографировать образцы через линейные поляризаторы скрещены с помощью цифровой однообъективного зеркалку со стандартным зум-объективом (см список материалов). Контроль параметров камеры, такие как фокусное расстояние, с помощью компьютерного программного обеспечения (см списка материалов).
- Пространственно-временной анализ интенсивности прошедшего света (рис 1C)
- Для того, чтобы оценить изменение параметра ориентационного порядка в процессе сушки, собирают фотографии каждый час в течение 24 часов.
- Измерение интенсивности прошедшего света вдоль оси в Z-направлении в виде серого значения , используя программу обработки изображений (например, ImageJ).
- Участок графика серого значения в зависимости от расстояния от верхней открытой стороны.
- Микроскопические наблюдения под перекрестно поляризованы светодиоднымт (рис 1D)
- Для проверки методов, сделать микроскопические наблюдения с поляризационного микроскопа , оснащенного ПЗС - камерой 9. Хранить замедляющей пластины первого порядка в пути прохождения света. Контролировать условия для фотографий с помощью программного обеспечения для ПК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование устройства , как показано на рисунке 1, сама-интеграция от микродомена к макродоменной на сушке радиоинтерфейс-LC оценивали (фигура 2А). В качестве первой демонстрации эксперимента сушки, два вида megamolecular полисахаридов, sacran (M W = 1,9 × 10 7 г моль -1) и ксантановая камедь (4,7 × 10 6 г моль -1), сравнивали. На фиг.2В показаны фотографии решений в клетке при кросс-поляризации света. Перед сушкой, можно было наблюдать несколько ярких областей с прошедшим светом, рассеянным в состоянии, в обеих растворах. После сушки при 60 ° С в течение 6 ч, область под границы раздела воздух-LC в sacran растворе стала значительно выше. Это означает, что домены сформировали макроскопический ориентированную структуру на границе раздела, аналогично формирование слоя кожи в процессе геля-усадке"Xref"> 10. С другой стороны, интенсивность ксантановая раствора резко снизилась, когда температура была просто увеличена от 25 ° C до 60 ° C, а некоторые небольшие макродоменные наблюдали под интерфейсом. Это потому, что подвижность ксантановая микродомена гораздо более чувствительны к температуре, чем в sacran микродомена. Критические различия ориентации на интерфейсе, таким образом, были обнаружены с помощью поляризационного устройства.
Рисунок 2C и фильм S1 , показывают результаты пространственно-временного анализа для процесса сушки в sacran растворе. Интенсивности прошедшего света указывает параметр ориентационного порядка микродоменных. Интенсивность пика вокруг границы раздела воздух-жидкость значительно увеличилась, а толщина увеличилась до ~ 2 мм. Эти результаты ясно показывают, что микродомены начинают ориентироваться из интерфейса воздушно-LCd расти в области milliscale параллельно к интерфейсу. Из этого наблюдения в поляризованном свете, таким образом, можно визуализировать движения текучей среды в процессе сушки.
Различия между sacran и ксантановой камедью с точкой зрения макродоменного размера и направления ориентации также были подтверждены с помощью поляризационного микроскопа с первым порядком замедляющей пластиной (рис 2D). Sacran жидкая фаза показала один голубую область, а это означает, что один макродомен образуется на границе раздела. В противоположность этому, ксантановая камедь жидкая фаза показала голубые, желтые и розовые регионы, а это означает, что множество макродоменные формируется с произвольными ориентациями.
Этот метод был также исследовались для сравнения трех типов основных жестких биополимеров с весами megamolecular - полисахариды (sacran: М ш = 1,9 × 10 7 г моль -1, микродоменныйдлина> 20 мкм), МЦ (М ш = 10 9 -10 10 г моль -1, длина микродоменной> 10 мкм), и ДНК (М ш = 1,3 × 10 6 г моль -1, длина микродоменной <1 мкм) - в физиологической среде при температуре 37 ° с. Перед сушкой , как показано на фигуре 3В, то sacran раствор и раствор МТ показали аналогичные LC состояний, с разбросанными доменами во всей области. В процессе сушки, домены в растворе МТА также прошли самостоятельную интеграцию от границы раздела воздуха-LC и рассеянные домены были объединены в единый макродомен. С другой стороны, ДНК-раствор не показал никакой конкретной ориентации в жидкой фазе. В случае раствора MT и раствора ДНК, полученный с буферами, важно отметить, что интеграция зависят от изменений концентрации соли, рН и ионной силы во время сушки.
(рис 3C). Sacran запись сушки показывает значительные интенсивности двулучепреломления из-за milliscale одной формации макродоменной. Для сушки записи MT, мы наблюдали волнистых пучков, где длинная ось была параллельна оси Х. В противоположность этому, сушильная запись раствора ДНК показал зерна формы макродоменов <5 мкм в диаметре и в произвольных направлениях. Исходя из этих наблюдений, то ясно, что макродомен размера зависит от длины палочковидных микродоменов. Это было, таким образом, можно оценить направленную ориентацию биополимерных микродоменов путем наблюдения записи сушки с помощью поляризационного микроскопа.
В заключении, были использованы методы с использованием поляризованного светадля самостоятельной интеграции megamolecular биополимеров на границе раздела воздух-сушки LC. Динамика водных растворов LC контролировали путем выпаривания воды из одной боковой открытой ячейки. Путем анализа изображений, снятых с помощью кросс-поляризованного света, можно было распознать пространственно-временные изменения и параметр ориентационного порядка. Учитывая, что продемонстрировали сушки процесс похож на естественные процессы, этот метод будет полезен для характеристики не только искусственных материалов в различных областях, но также из натуральных живых тканей. Мы считаем, что это может дать метод оценки для мягких материалов в биомедицинских и экологических областях.
Рисунок 1: Сушка эксперимента. (А) Схематическое изображение из растворов в одну сторону, открытую клетку. (В)Схематическое изображение экспериментального устройства, используемого для наблюдений при кросс-поляризации света. Поляризаторы были обычно доводят до 45 ° и 135 °. (С) Фактическое устройство. Эта цифра была изменена с 6 ссылки. Авторское право: American Chemical Society, 2016. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Процесс сушки водных растворов полисахаридов sacran и ксантановая камедь. (А) Схематическое изображение собственной интеграции на границе раздела воздух-сушки LC. (В) Боковые виды двух видов полисахаридных растворов при их начальных состояниях и после6 ч сушки при температуре 60 ° С при кросс-поляризации света. Начальные концентрации полимера 0,5% мас. (С) Переданная интенсивность света через скрещенные призмы Николя на линии в Z-направлении для каждого снимка в данный момент времени. (D) Поляризационные микроскопические изображения полимерных растворов в камере после 6 часов сушки при 60 ° C. Красные стрелки: макродоменные на интерфейсе. Эта цифра была изменена с 6 ссылки. Авторское право: American Chemical Society, 2016. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Процесс сушки биополимерных водных растворов и записей сушки. (А) Источники полигоновaccharides (цианобактерий), МЦ (свиной мозг) и ДНК (лосось семенники). (В) Боковые виды sacran, MT, а также растворов ДНК во время сушки при температуре 37 ° С при кросс-поляризации света. Начальные концентрации полимера 0,5% мас. (С) Микроскопические изображения высушенных полимерных пленок на стеклянной подложке посредством заданных направлений. Скрещенных призм Николя Все шкалы баров 50 мкм. Эта цифра была изменена с 6 ссылки. Авторское право: American Chemical Society, 2016. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм S1: процесс сушки раствора sacran во время сушки при температуре 60 ° С, наблюдали с использованиемскрещенный Николс. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это было иногда трудно фотокамере сфокусироваться на образце из-за интенсивности прошедшего света слишком низко. В таких случаях, помещая расширенную прозрачную пластиковую пленку на сцене помогли организовать фокус. Ограничение наблюдаемого разрешения зависит от объектива камеры, ~ 10 мкм, в этом случае. Наблюдаемое ограничение по толщине образца, Δy, зависит от максимальной интенсивности света лампы, ~ 10 мм в этом случае.
Преимуществом устройства , показанного на фигуре 1В является то , что она позволяет боковой просмотреть фотографии образца , которые необходимо принять во время процесса сушки. Наблюдение может быть осуществлено без опоры на горизонтальной плоскости, которая используется в типичных микроскопах. По стоя на одной боковых открытую ячейку во время экспериментов сушки, направление испарения регулируются и в направлении, противоположном направлению силы тяжести. Мониторинг вида сбоку также позволяет рассчитать сушильный крысе 4.
В будущем, путем размещения регуляторов температуры и влажности на стадии образца устройства, можно будет автоматически контролировать временные изменения в параметре ориентационного порядка. Кроме того, баланс в установке для контроля за изменением веса помогло бы оценку концентрации. Этот метод также может быть использован для уточнения процесса анизотропного набухания полисахарида гидрогелей 11, 12. Поэтому можно было бы контролировать структурные изменения мягких приводов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом-в-помощь для молодых ученых (16K17956) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии, Киото технонауки центр, и MITANI Фонд исследований и развития.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sacran | Green Science Materials Inc., Japan | From Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1 |
|
| xanthan gum | Taiyo Kagaku Co., Japan | Neosoft XC | From Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1 |
| tubulin | Cytoskeleton, Inc., USA | T240 | From porcine brain. |
| GpCpp | Jena Bioscience, Germany | NU405L | |
| piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrichi, Co. LLC. | P6757-500G | PIPES |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 342-01314 | EGTA |
| MgCl2-6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-15055 | |
| KOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 162-21813 | pellet |
| DNA | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | D1626 | From salmon testes. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp) |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | T9285-100ML | 10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA |
| slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan | S1111 | |
| silicon rubber sheet | Asone Co. | 6-611-32 | Thickness: 1 mm |
| centrifuge | Beckman-Coulter, Inc., USA | Avanti J-25 | equipped with a JA-20 rotor |
| light source | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | LS-LHA | |
| light guide | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M) | 80 mm × 80 mm |
| halogen lamp | Ushio Inc., Japan | JCR 15V150WBN | |
| holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | KMH-80 | |
| sample stage | Sigmakoki, Co.,Ltd. | TARW-25503L | |
| sample holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | SHA-25RO | |
| rod | Sigmakoki, Co.,Ltd. | ROU-12-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-6-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-60 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-80 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-130 | |
| carrier | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CAA-25LS | |
| camera holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CMH-2 | |
| medium optical rail | Sigmakoki, Co.,Ltd. | OBA-500SH | |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L25 mm |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L50 mm |
| multiband | Tomytech, BORG | 80φ | |
| V plate | Tomytech, BORG | V plate 60S | |
| plate holder | Viexen, Co.,Ltd. | plate holder SX | |
| EOS Kiss X7i | Canon Inc., Japan | 8594B001 | with a standard zoom lens, EFP 18-55 mm |
| photographic software | Canon Inc., Japan | EOS Utility | |
| PC | Microsoft | Surface | |
| polarization microscope | Olympus | BX51 | |
| first order retardation plate | Olympus | U-TP530 | λ = 530 nm |
| CCD camera | Olympus | DP80 | |
| photographic software | Olympus | cellSens Standard | |
| Java-based image processing program | the National Institutes of Health | ImageJ |
References
- Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
- De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
- De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
- Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
- Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
- Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
- Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
- Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
- Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).
