Summary
En metod för torkning-inducerade själv integration av megamolecular biopolymerer på den kristallina gränssnittet luft-vätske tillhandahålls här. Denna metod kommer att vara användbara inte bara för att förstå de makroskopiska potentialer biopolymerer, men också som en utvärderingsmetod för mjuka material i biomedicinska och miljöområdet.
Abstract
Levande organismer som använder vatten är alltid benägna att torkning i miljön. Deras verksamhet drivs av biopolymeren baserade mikro- och makrostrukturer, såsom ses i fallen med rörligt vatten i vaskulära buntar och återfuktande vatten i hudlagren. I denna studie har vi utvecklat en metod för att bedöma effekten av vattenhaltig vätska kristallina (LC) lösningar som består av biopolymerer på torkning. Som LC biopolymerer har megamolecular vikt, valde vi att studera polysackarider, cytoskelettproteiner, och DNA. Observationen av biopolymer lösningar under torkning under polariserat ljus avslöjar milliscale själv integration med början från den instabila luft LC gränssnitt. Dynamiken i de vattenhaltiga LC biopolymera lösningar kan övervakas genom att avdunsta vatten från en en-sida-öppna celler. Genom att analysera de bilder som tagits med korspolariserat ljus, är det möjligt att känna igen de spatio-temporala förändringar i orienteringsordning parametern. Dettametod kan vara användbar för karaktärisering av icke endast artificiella material inom olika områden, men också naturliga levande vävnader. Vi tror att det kommer att ge en utvärderingsmetod för mjuka material i biomedicinska och miljöområdet.
Introduction
Genom att fokusera på de styva, stavformade strukturer av biopolymerer, har dynamiska mjuka material använts för olika tillämpningar, inklusive polysackarid biofilm matriser 1, "aktiva geler" sammansatta av cytoskelettproteiner 2 och "DNA origami" av önskade former 3. Att klargöra de strukturella egenskaper, har många strategier utforskats, såsom transmissionselektronmikroskopi, svepelektronmikroskopi, atomkraftsmikroskopi, och konfokal fluorescensmikroskopi. Emellertid, eftersom dessa metoder är mestadels gjorts i en torkad eller statiskt tillstånd, är det svårt att förklara de dynamiska beteenden i makroskopiska skalor, som sett i verkliga levande system. Nyligen, framgångsrikt observerade vi det dynamiska beteendet av biopolymerer på vattenhaltigt luft-LC-gränssnitt genom polariserat ljus 4. Under visualisering av den orienterade strukturen medan torkning biopolymerenlösning, de tidsmässiga förändringar indikerade själv integration av biopolymerer på den instabila luft LC gränssnitt.
Här beskriver vi ett protokoll för torkning av LC biopolymera lösningar vid luft-LC-gränssnittet med användning av polariserade instrument. I motsats till andra analyser av LC fas som inte anser att torka 5, 6, var LC dynamiken under torkningsprocessen undersöks här genom att utvärdera orienteringsordning parametern i sidovy av den flytande fasen i en en-sida-öppna celler . Kombinationen av cell indunstning och användning av polariserade instrument som tillåts för makroskopisk övervakning med en kontrollerad avdunstning riktning. Dessutom var det möjligt att validera tork register genom att fokusera på de kristallina strukturerna för de adsorberade mikrodomäner, vilka påverkades av molekylvikt, koncentration, etc. För att visa effektiviteten av förfarandet, tork proprocesser av basiska biopolymerer med stela stav former, såsom polysackarider, mikrotubuli (MTS), och DNA, undersöktes. Vi valde dessa biopolymerer eftersom de är typiska exempel på hierarkiska makromolekyler med megamolecular vikter och deras intermolekylära interaktioner kunna bilda LC stater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. instrument
- polariseringsanordning
- För att konstruera en polariseringsanordning, åstadkomma en ljuskälla med en halogenlampa, en ljusledare, polarisatorer, en provbordet, en optisk skena, stång står, och en digital spegelreflexkamera (se figur 1C och Materiallista för polarisationen enhetens delar).
2. Framställning av biopolymer Lösning
- polysackaridlösningar
- Upplösa sacran 7 (0,5 g) i rent vatten (100 ml) genom omröring vid ~ 80 ° C under mer än 12 timmar. Under upplösningen täcka behållaren med plastfolie för att förhindra avdunstning. Framställa en vattenhaltig lösning av xantangummi på samma sätt.
- Kyla lösningarna vid ~ 25 ° C för att erhålla 0,5 vikt-% vattenlösningar.
- Centrifugera sacran lösningen för att avlägsna föroreningar (48,400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 times).
- MT-lösning
- Bered en 0,5 vikt-% tubulin-lösning (1 ml) i en Britton-Robinson-buffert (80 mM piperazin- N, N'-bis (2-etansulfonsyra) (PIPES), 1 mM etylenglykol-bis (β-aminoetyleter) - N, N, N 'N' -tetraättiksyra (EGTA); och 5 mM MgCl2, pH 6,8) på is 8.
- Använda 0,5 vikt-% tubulin-lösning (50 | il) och guanosin-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfat (GpCpp) (5 | il) för att framställa en GpCpp-innehållande tubulin-lösning (50 | il). Inkubera vid 37 ° C under 3 h för att erhålla en stabil MT kärna.
OBS: roll GpCpp är att stödja MT bildning och att helt undertrycka depolymerisationen av MT till tubulin. - Blanda tubulin lösningen 0,5 vikt-% (950 | il) och den GpCpp innehållande tubulin-lösning (50 | il) vid ~ 25 ° C under en dag för att erhålla en stabil 0,5 vikt-% MT lösning.
- DNA-lösning
- Bered en 0,5 vikt-% DNA-lösning (1 ml) i Tris-EDTA-buffertlösning (10 mM Tris, pH 8,0, med 1 mM EDTA).
- Hålla biopolymeren provlösningarna 0,5 vikt-% vid 25 ° C för torkning experimentet.
3. Torkning experiment och observation under Cross-polariserat ljus
- Lösningar i en en-sida-öppna celler (figur 1 A)
- Skära en kiselarket (se Material List) i en lämplig form med en tjocklek av 1 mm (innermått av 5-15 mm, en mm, och ~ 20 mm, figur 1 A).
- Montera en en-sida-öppna celler består av en kisel spacer med inre dimension av 5-15 mm, en mm, och ~ 20 mm och två icke-modifierade glasskivor (76 mm x 1 mm x 26 mm). Fäst båda sidor av cellen med dubbla klipp i förväg för att hålla provlösningen från att läcka ut.
- Långsamt lägga till varje av biopolymeren lösningen 0,5 vikt-% (100-300 | il) med användning av en ~ 1-mm porstorlek pipettte tips till varje cell vid ~ 25 ° C. Ta bort luftbubblor från cellerna med användning av en sprutnål.
- Placera cellerna i en ugn med en luft cirkulator vid 60 ° C under atmosfärstryck för avdunstning; avdunstningen riktningen är motsatt den av tyngdkraften.
- Skära en kiselarket (se Material List) i en lämplig form med en tjocklek av 1 mm (innermått av 5-15 mm, en mm, och ~ 20 mm, figur 1 A).
- Observationer enligt tvärpolariserat ljus (Figur 1B-1C)
- Tillhandahålla rak synligt ljus via en 100 W halogenlampa med en platt-yta ljuskälla över ett stort område (80 mm x 80 mm). Justera polarisatorer till 45 ° och 135 ° med hjälp av hållarna (Figur 1C).
- Fixera positionerna för ljuskällan, polarisatorer, provbordet, och kamera som använder en optisk skena och stångstativ (Figur 1C). Placera provbordet mellan de två polarisatorer (avståndet mellan polarisatorerna bör vara ~ 5 cm). Placera kameran ~ 20 cm från provsteget för att medge fokusering.
- Vid givna tidpunkter, placera proverna från steg 3.1.3 mellan polarizers på scenen parallellt med XZ-planet och täcka enheten med en svart gardin; själva anordningen visas i figur 1C.
- Fotografera proverna genom linjära korsade polarisatorer med hjälp av en digital spegelreflexkamera med en standardzoomobjektiv (se Material List). Styr kamerainställningarna, t.ex. brännvidd, med hjälp av datorprogram (se Material List).
- Spatio-temporal analys av den överförda ljusintensiteten (figur 1C)
- Att utvärdera förändringen av orienteringsordning parametern i torkningsprocessen, samla fotografier varje timme i 24 timmar.
- Mäta den utsända ljusintensiteten längs centrumlinjen i Z-riktningen som ett grått värde med användning av ett bildbehandlingsprogram (t.ex. ImageJ).
- Rita en kurva över den grå värde som en funktion av avståndet från den övre öppna sidan.
- Mikroskopiska observationer enligt korspolariserad light (figur 1D)
- Att kontrollera de metoder, se till mikroskopiska observationer med ett polarisationsmikroskop utrustat med en CCD-kamera 9. Hålla en första ordningens retardationsplattan i ljusbanan. Styr villkoren för foton med en PC-mjukvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av anordningen som visas i figur 1, till den själv integrationen från mikrodomän macrodomain på en torkluft-LC gränssnitt utvärderades (Figur 2A). Som den första demonstrationen av tork experimentet, två typer av megamolecular polysackarider, sacran (M w = 1,9 x 10 7 g mol -1) och xantangummi (4,7 x 10 6 g mol -1), jämfördes. Figur 2B visar fotografier av lösningarna i cellen enligt tvärpolariserat ljus. Före torkning, var det möjligt att observera flera ljusa regioner med transmitterat ljus i ett spritt tillstånd i båda lösningarna. Efter torkning vid 60 ° C under 6 h, regionen under luft-LC gränssnittet i sacran lösningen blev signifikant hög. Detta innebär att domänerna bildas en makroskopiskt orienterad struktur vid gränsytan, liknande huden skiktbildningen i en gel-krympningsprocess"xref"> 10. Å andra sidan, intensiteten av den xantanlösningen minskade drastiskt när temperaturen var bara ökade från 25 ° C till 60 ° C, och vissa små macrodomains observerades under gränsytan. Detta beror på att rörligheten hos xantanmikrodomän är mycket mer känsliga för temperatur än den för den sacran mikrodomän. De kritiska skillnader i orienteringen på gränssnittet har således detekteras med hjälp av polariseringsanordningen.
Figur 2C och Movie S1 visar resultaten av rum-tidsanalys för torkningsprocessen i sacran lösningen. Den överförda ljusintensiteten indikerar orienteringsordning parameter i mikrodomän. Toppintensiteten runt luft-vätskegränssnittet ökat betydligt, och tjockleken växte till ~ 2 mm. Dessa resultat visar tydligt att mikroområdena börjar orientera från luft-LC-gränssnitt end växa till en milliscale domän parallellt med gränsytan. Från denna observation under polariserat ljus, är det således möjligt att visualisera de fluidrörelser i torkningsprocessen.
Skillnaderna mellan sacran och xantangummi i form av macrodomain storlek och orienteringsriktning bekräftades också genom ett polarisationsmikroskop med en första ordningens retardationsplatta (figur 2D). Den sacran fluidfas visade en blå området, vilket innebär att en enda macrodomain bildas vid gränsytan. I kontrast, xantangummifluidfasen visade blå, gul, och rosa regioner, vilket innebär att de multipla macrodomains utformat med godtyckliga orienteringar.
Denna metod undersöktes också för jämförelse tre typer av grundläggande styva biopolymerer med megamolecular vikter - polysackarider (sacran: Mw = 1,9 x 10 7 g mol -1, mikrodomänlängd> 20 ^ m), MT (Mw = 10 9 -10 10 g mol -1, mikrodomän längd> 10 | im), och DNA (M ^ = 1,3 x 10 6 g mol -1, mikrodomän längd <1 ^ m) - i en fysiologisk miljö vid 37 ° C. Före torkning, såsom visas i figur 3B, den sacran lösningen och MT lösningen visade liknande LC tillstånd, med spridda domäner i hela området. Under torkningsprocessen, domänerna i MT lösningen genomgick också själv integrering från luft-LC-gränssnitt, och de spridda domänerna var integrerade i en enda macrodomain. Å andra sidan, DNA-lösningen visade ingen specifik orientering i den flytande fasen. I fallet med MT-lösning och DNA-lösningen som framställts med buffertar, är det viktigt att notera att integration påverkas av förändringar i saltkoncentration, pH och jonstyrka under torkningen.
(figur 3C). Den sacran torkning rekord uppvisade signifikanta dubbelbrytnings intensiteter på grund av den milliscale enda macrodomain bildning. För MT tork rekord, observerade vi vågiga buntar där den långa axeln var parallell med X-axeln. I kontrast, tork dokumentation av DNA-lösningen visade kornformade macrodomains <5 | im i diameter och i godtyckliga riktningar. Från dessa observationer är det klart att macrodomain storlek påverkas av längden på stavliknande mikro. Det var således möjligt att utvärdera riktningsorienteringen av biopolymeren mikrodomäner genom att observera tork register med användning av ett polarisationsmikroskop.
Sammanfattningsvis har metoder med användning av polariserat ljus som användsför själv integration av megamolecular biopolymerer på torkluften-LC-gränssnitt. Dynamiken i de vattenhaltiga LC lösningarna övervakades genom att avdunsta vatten från en en-sida-öppna celler. Genom att analysera de bilder som tagits med korspolariserat ljus, var det möjligt att känna igen de spatio-temporala förändringar och orienteringsordningsparametern. Med tanke på att den demonstrerade torkningsprocessen liknar naturliga processer, skulle denna metod vara användbar för karaktärisering av inte bara artificiella material inom olika områden, men också av naturliga levande vävnader. Vi tror att detta skulle kunna ge en utvärderingsmetod för mjuka material i biomedicinska och miljöområdet.
Figur 1: Torkning experiment. (A) Schematisk illustration av lösningarna i en en-sida-öppna celler. (B)Schematisk illustration av den experimentella anordning som används för observationer under korspolariserat ljus. Polarisatorerna var normalt justeras till 45 ° och 135 °. (C) Själva enheten. Denna figur har modifierats referens 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Torkning processen för vattenlösningar av polysackarider sacran och xantangummi. (A) Schematisk illustration av den själv integrationen på den torkande luften-LC-gränssnitt. (B) Sidovyer av två typer av polysackarid lösningar till sina ursprungliga tillstånd och efter6 h av torkning vid 60 ° C under korspolariserat ljus. De initiala polymerkoncentrationer var 0,5 vikt-%. (C) Transmitterad ljusintensitet genom en korsade Nicols på en linje i Z-riktningen för varje bild tagen vid en given tidpunkt. (D) Polariserings mikroskopiska bilder av polymerlösningarna i cellen efter 6 h av torkning vid 60 ° C. Röda pilar: macrodomains på gränssnittet. Denna figur har modifierats referens 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Torkning processen för biopolymer vattenhaltiga lösningar och tork poster. (A) Källor för de polysaccharides (cyanobakterier), MT (porcin hjärna) och DNA (lax testiklar). (B) Sidovyer av sacran, MT, och DNA-lösningar under torkning vid 37 ° C under korspolariserat ljus. De initiala polymerkoncentrationer var 0,5 vikt-%. (C) Mikroskopiska bilder av de torkade polymerfilmer på glassubstrat genom de givna riktningarna för de korsade Nicols. Alla skal barer är 50 um. Denna figur har modifierats referens 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film S1: Torkning förfarandet enligt sacran lösningen under torkning vid 60 ° C, observerades med användningkorsade Nicols. Klicka här för att ladda ner filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det var ibland svårt för kameran att fokusera på provet på grund av den överförda ljusintensiteten är för låg. I sådana fall, placera en förlängd transparent plastfilm på scenen hjälpte till att ordna fokus. Begränsningen av det observerbara upplösningen var beroende av kameralinsen, ~ 10 ^ m i detta fall. Den observerbara begränsning av provtjockleken, Ay, var beroende av den maximala ljusintensiteten hos lampan, ~ 10 mm i detta fall.
Fördelen med den som visas i figur 1B anordning är att det tillåter sido visa bilder av provet som skall tas under torkningsprocessen. Observationen kan utföras utan att förlita sig på det horisontella planet, som används i typiska mikroskop. Genom att stå en-sida-öppna celler under torkningsexperiment, är avdunstningen riktningen regleras och i motsatt riktning av tyngdkraften. Övervaka sidovy möjliggör också beräkningen av tork råttae 4.
I framtiden, genom att placera temperatur- och fuktighetsregulatorer på provstadiet av anordningen, kommer det att vara möjligt att automatiskt övervaka tidsmässiga förändringar i den orienteringsordning parametern. Dessutom skulle en balans i setup för att övervaka viktförändring hjälpa uppskattningen av koncentrationen. Denna metod kan också användas för att klargöra den anisotropa svällningsprocessen av polysackarid hydrogeler 11, 12. Det skulle därför vara möjligt att övervaka de strukturella förändringar av mjuka ställdon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Grant-i-Stöd för unga forskare (16K17956) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan, Kyoto Teknovetenskapliga Center och Mitani Stiftelsen för forskning och utveckling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sacran | Green Science Materials Inc., Japan | From Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1 |
|
| xanthan gum | Taiyo Kagaku Co., Japan | Neosoft XC | From Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1 |
| tubulin | Cytoskeleton, Inc., USA | T240 | From porcine brain. |
| GpCpp | Jena Bioscience, Germany | NU405L | |
| piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrichi, Co. LLC. | P6757-500G | PIPES |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 342-01314 | EGTA |
| MgCl2-6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-15055 | |
| KOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 162-21813 | pellet |
| DNA | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | D1626 | From salmon testes. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp) |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | T9285-100ML | 10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA |
| slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan | S1111 | |
| silicon rubber sheet | Asone Co. | 6-611-32 | Thickness: 1 mm |
| centrifuge | Beckman-Coulter, Inc., USA | Avanti J-25 | equipped with a JA-20 rotor |
| light source | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | LS-LHA | |
| light guide | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M) | 80 mm × 80 mm |
| halogen lamp | Ushio Inc., Japan | JCR 15V150WBN | |
| holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | KMH-80 | |
| sample stage | Sigmakoki, Co.,Ltd. | TARW-25503L | |
| sample holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | SHA-25RO | |
| rod | Sigmakoki, Co.,Ltd. | ROU-12-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-6-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-60 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-80 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-130 | |
| carrier | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CAA-25LS | |
| camera holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CMH-2 | |
| medium optical rail | Sigmakoki, Co.,Ltd. | OBA-500SH | |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L25 mm |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L50 mm |
| multiband | Tomytech, BORG | 80φ | |
| V plate | Tomytech, BORG | V plate 60S | |
| plate holder | Viexen, Co.,Ltd. | plate holder SX | |
| EOS Kiss X7i | Canon Inc., Japan | 8594B001 | with a standard zoom lens, EFP 18-55 mm |
| photographic software | Canon Inc., Japan | EOS Utility | |
| PC | Microsoft | Surface | |
| polarization microscope | Olympus | BX51 | |
| first order retardation plate | Olympus | U-TP530 | λ = 530 nm |
| CCD camera | Olympus | DP80 | |
| photographic software | Olympus | cellSens Standard | |
| Java-based image processing program | the National Institutes of Health | ImageJ |
References
- Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
- De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
- De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
- Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
- Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
- Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
- Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
- Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
- Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).
