Summary
Procedimento per l'essiccazione indotta autointegrazione di biopolimeri megamolecular sull'interfaccia cristallina aria-liquido viene fornito qui. Questa metodologia sarà utile non solo per comprendere i potenziali macroscopiche di biopolimeri, ma anche come un metodo di valutazione per materiali morbidi in campo biomedico e ambientale.
Abstract
Gli organismi viventi che utilizzano l'acqua sono sempre inclini a essiccazione nell'ambiente. Le loro attività sono guidati da micro biopolimero a base di e macro-strutture, come si è visto nei casi di acqua in movimento in fasci vascolari e idratante di acqua negli strati cutanei. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo per valutare l'effetto delle soluzioni (LC) liquido acquoso cristallini costituiti da biopolimeri all'essiccamento. Come biopolimeri LC hanno peso megamolecular, abbiamo scelto di studiare polisaccaridi, proteine del citoscheletro, e DNA. L'osservazione delle soluzioni biopolimeri durante essiccamento sotto luce polarizzata rivela milliscale autointegrazione partendo dall'interfaccia aria LC instabile. La dinamica delle soluzioni acquose biopolimeri LC possono essere monitorati facendo evaporare l'acqua da una cellula di un lato aperto. Analizzando le immagini scattate utilizzando luce polarizzata trasversale, è possibile riconoscere le variazioni spazio-temporali nel parametro ordine orientativo. Questometodo può essere utile per la caratterizzazione non solo materiali artificiali in vari campi, ma anche tessuti viventi naturale. Noi crediamo che fornirà un metodo di valutazione per materiali morbidi in campo biomedico e ambientale.
Introduction
Concentrandosi sui rigidi, strutture a forma di asta dei biopolimeri, materiali morbidi dinamiche sono stati utilizzati per varie applicazioni, comprese le matrici polisaccaride biofilm 1, "gel attivi" composta da proteine del citoscheletro 2, e "DNA origami" di forme desiderate 3. Per chiarire le proprietà strutturali, molte strategie sono state esplorate, come la microscopia elettronica a trasmissione, microscopia elettronica a scansione, microscopia a forza atomica e microscopia confocale. Tuttavia, poiché questi metodi sono per lo più svolte in uno stato secco o statico, è difficile da spiegare i comportamenti dinamici in scala macroscopica, come si è visto nei sistemi viventi attuali. Recentemente, abbiamo osservato con successo il comportamento dinamico del biopolimeri sull'interfaccia aria LC acquosa attraverso la luce polarizzata 4. Durante la visualizzazione della struttura orientata durante l'asciugatura biopolimerosoluzione, le variazioni temporali indicati autointegrazione di biopolimeri sull'interfaccia aria LC instabile.
Qui, descriviamo un protocollo per l'asciugatura di soluzioni LC biopolimeri all'interfaccia aria-LC con strumenti polarizzati. Al contrario di altre analisi della fase LC che prescindono essiccazione 5, 6, le dinamiche LC durante il processo di essiccazione sono stati esaminati qui valutando il parametro ordine orientazionale nella vista laterale della fase fluida in una cella un lato aperto . La combinazione di evaporazione cellulare e l'utilizzo di strumenti polarizzati abilitate al monitoraggio macroscopico con direzione evaporazione controllata. Inoltre, è stato possibile per convalidare i record asciugatura concentrandosi sulle strutture cristalline dei microdomini adsorbite, che hanno risentito peso molecolare, concentrazione, ecc Per dimostrare l'efficacia del metodo, l'essiccazione processi di biopolimeri base con forme un'asta rigida, quali polisaccaridi, microtubuli (MT), e il DNA, sono stati studiati. Abbiamo scelto questi biopolimeri perché sono tipici esempi di macromolecole gerarchici con pesi megamolecular, e le loro interazioni intermolecolari permettono loro di formare LC stati.
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Protocol
1. Strumenti
- dispositivo polarizzazione
- Per costruire un dispositivo di polarizzazione, fornire una sorgente di luce con una lampada alogena, una guida di luce, polarizzatori, una fase di esempio, una guida ottica, canna, si e una fotocamera digitale reflex (vedere Figura 1C e Materiali Elenco per la polarizzazione parti del dispositivo).
2. Preparazione della Soluzione Biopolymer
- soluzioni polisaccaridi
- Sciogliere sacran 7 (0,5 g) in acqua pura (100 mL) mediante agitazione a ~ 80 ° C per più di 12 ore. Durante lo scioglimento, coprire il contenitore con pellicola trasparente per evitare l'evaporazione. Preparare una soluzione acquosa di xanthan gum nello stesso modo.
- Raffreddare le soluzioni a ~ 25 ° C per ottenere soluzioni acquose 0,5% in peso.
- Centrifugare la soluzione sacran per rimuovere le impurità (48.400 xg, a 4 ° C, 1 h, 3 Times).
- soluzione MT
- Preparare una soluzione tubulina 0,5% (1 ml) in tampone Britton-Robinson (80 mM piperazine- N, N '-bis (acido 2-etansolfonico) (tubi), 1 mM etilenglicol-bis (β-amminoetil etere) - N, N, N 'N' acido -tetraacetic (EGTA), e 5 mM MgCl 2, pH 6,8) su ghiaccio 8.
- Usare la soluzione tubulina 0,5% (50 mL) e guanosina-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfato (GpCpp) (5 mL) per preparare una soluzione tubulina GpCpp contenente (50 mL). Incubare a 37 ° C per 3 ore per ottenere un nucleo MT stabile.
NOTA: Il ruolo della GpCpp è quello di sostenere la formazione di MT e di sopprimere completamente la depolimerizzazione di MT a tubulina. - Miscelare la soluzione allo 0,5% in peso tubulina (950 mL) e la soluzione tubulina GpCpp contenente (50 mL) a ~ 25 ° C per 1 giorno per ottenere una soluzione stabile MT 0,5% in peso.
- soluzione di DNA
- Preparare una soluzione di DNA 0,5% (1 ml) in soluzione tampone Tris-EDTA (10 mM Tris, pH 8,0, con 1 mM EDTA).
- Mantenere le soluzioni campione biopolimero 0,5% in peso a 25 ° C per l'esperimento di essiccazione.
3. Esperimenti di essiccazione e di osservazione sotto la luce Cross-polarizzata
- Soluzioni in una cella di un lato aperto (Figura 1A)
- Tagliare un foglio di silicio (vedi Elenco materiali) in una forma appropriata con uno spessore di 1 mm (dimensione interna di 5-15 mm, 1 mm, e ~ 20 mm; Figura 1A).
- Montare una cella di un lato aperto composto da un distanziatore di silicio con dimensione interna di 5-15 mm, 1 mm, e ~ 20 mm e due vetrini non modificati (76 mm x 1 mm × 26 mm). Fissare entrambi i lati della cella con doppia clip in anticipo per mantenere la soluzione del campione di fuoriuscire.
- Aggiungere lentamente ciascuna della soluzione di biopolimero 0,5% in peso (100-300 mL) utilizzando un ~ 1 mm dimensione dei pori pipettaTE punta a ciascuna cella a ~ 25 ° C. Rimuovere le bolle d'aria dalle cellule utilizzando un ago da siringa.
- Collocare le cellule in un forno con un circolatore aria a 60 ° C sotto pressione atmosferica per evaporazione; direzione evaporazione è opposta a quella di gravità.
- Tagliare un foglio di silicio (vedi Elenco materiali) in una forma appropriata con uno spessore di 1 mm (dimensione interna di 5-15 mm, 1 mm, e ~ 20 mm; Figura 1A).
- Osservazioni sotto luce polarizzata trasversale (Figura 1B-1C)
- Fornire luce visibile dritto con una lampada alogena da 100 W con una sorgente di luce a superficie piana su una vasta area (80 mm x 80 mm). Regolare i polarizzatori a 45 ° e 135 ° con i supporti (Figura 1C).
- Fissare le posizioni della sorgente luminosa, polarizzatori, fase del campione, e la telecamera utilizzando una guida ottica e stand asta (Figura 1C). Posizionare la fase del campione tra i due polarizzatori (la distanza tra i polarizzatori dovrebbe essere ~ 5 cm). Collocare la fotocamera ~ 20 cm dalla fase di campionamento per consentire di messa a fuoco.
- A orari stabiliti, collocare i campioni dal punto 3.1.3 tra la polarizers sul palco parallelo al piano XZ e coprire il dispositivo con una tenda nera; dispositivo reale è mostrato nella Figura 1C.
- Fotografare i campioni attraverso polarizzatori lineari attraversato utilizzando una fotocamera digitale reflex con un obiettivo zoom standard (vedi Lista dei materiali). Controllare le impostazioni della fotocamera, come la distanza focale, utilizzando il software del computer (vedi Materiali List).
- Analisi spazio-temporale del dell'intensità della luce trasmessa (Figura 1C)
- Per valutare la variazione del parametro d'ordine orientativo nel processo di essiccazione, raccogliere fotografie oraria per 24 h.
- Misurare l'intensità della luce trasmessa lungo la linea centrale nella direzione Z come un valore di grigio con un programma di elaborazione di immagini (ad esempio, ImageJ).
- Tracciare un grafico del valore di grigio in funzione della distanza dal lato superiore aperta.
- Osservazioni al microscopio sotto ligh cross-polarizzatat (Figura 1D)
- Per controllare i metodi, fare osservazioni al microscopio con un microscopio di polarizzazione dotato di una fotocamera CCD 9. Mantenere una piastra ritardo del primo ordine nel percorso ottico. Controllare le condizioni per le foto utilizzando un software per PC.
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Representative Results
Utilizzo del dispositivo come mostrato in figura 1, l'auto-integrazione da microdomini a macrodomain su un essiccamento all'interfaccia aria-LC è stata valutata (Figura 2A). Come la prima dimostrazione dell'esperimento essiccazione, due tipi di polisaccaridi megamolecular, sacran (M w = 1,9 x 10 7 g mol -1) e gomma xantano (4,7 x 10 6 g mol -1), sono stati confrontati. La Figura 2B mostra le fotografie delle soluzioni nella cella sotto luce polarizzata trasversale. Prima dell'essiccazione, è stato possibile osservare diverse regioni luminose con luce trasmessa in uno stato disperso in entrambe le soluzioni. Dopo essiccamento a 60 ° C per 6 h, la regione sotto all'interfaccia aria-LC nella soluzione sacran divenne notevolmente elevato. Ciò significa che i domini formavano una struttura macroscopicamente orientata all'interfaccia, simile alla formazione di strato di pelle in un processo gel restringimento"xref"> 10. D'altra parte, l'intensità della soluzione xantano diminuisce drasticamente quando la temperatura è stata appena aumentata da 25 ° C a 60 ° C, e sono stati osservati alcuni piccoli macrodomains sotto l'interfaccia. Questo perché la mobilità del microdomini xantano è molto più sensibile alla temperatura di quella del microdomini sacran. Le differenze critiche dell'orientamento sull'interfaccia furono così rilevati utilizzando il dispositivo di polarizzazione.
Figura 2C e film S1 mostrano i risultati delle analisi spazio-temporale per il processo di essiccazione nella soluzione sacran. L'intensità della luce trasmessa indica il parametro ordine orientazionale del microdomini. L'intensità di picco intorno all'interfaccia aria-liquido aumentato significativamente, e lo spessore è cresciuto a ~ 2 mm. Questi risultati indicano chiaramente che i microdomini iniziano a orientare dall'interfaccia aria-LCd crescere in un dominio milliscale parallelamente all'interfaccia. Da questa osservazione in luce polarizzata, è quindi possibile visualizzare i movimenti fluidi nel processo di essiccazione.
Le differenze tra gomma xantano sacran e in termini di dimensioni e macrodomain direzione di orientamento sono stati confermati anche da un microscopio di polarizzazione con una piastra ritardo del primo ordine (Figura 2D). Fase fluida sacran mostrava una regione blu, il che significa che un singolo macrodomain forma all'interfaccia. Al contrario, la fase fluida gomma xantano mostrato regioni blu, giallo, e rosa, che significa che le molteplici macrodomains formate con orientamenti arbitrari.
Questo metodo è stato esplorato per confrontare tre tipi di biopolimeri rigidi di base con pesi megamolecular - polisaccaridi (sacran: M w = 1,9 x 10 7 g mol -1, microdominilunghezza> 20 um), MT (M w = 10 9 -10 10 g mol -1, lunghezza microdomini> 10 um), e DNA (M w = 1,3 x 10 6 g mol -1, lunghezza microdomini <1 um) - in un ambiente fisiologico a 37 ° C. Prima di asciugare come mostrato nella Figura 3B, la soluzione sacran e la soluzione MT mostrato stati LC simili, con i domini sparsi in tutta l'area. Durante il processo di essiccazione, i domini nella soluzione MT anche sottoposti auto-integrazione dal all'interfaccia aria-LC, ed i domini dispersi sono stati integrati in un unico macrodomain. D'altra parte, la soluzione di DNA ha mostrato alcun orientamento specifico nella fase liquida. Nel caso della soluzione MT e la soluzione di DNA preparata con tamponi, è importante notare che l'integrazione è influenzato dai cambiamenti nella concentrazione di sale, il pH e forza ionica durante l'essiccazione.
(Figura 3C). Il record di essiccazione sacran esposto significativi intensità birifrangenza causa della milliscale singola formazione macrodomain. Per la cronaca l'essiccazione MT, abbiamo osservato fasci ondulati in cui l'asse lungo era parallelo alla X-asse. Al contrario, il record essiccamento della soluzione di DNA mostrato macrodomains grano-figura <5 micron di diametro e in direzioni arbitrarie. Da queste osservazioni, è chiaro che la dimensione macrodomain è influenzata dalla lunghezza dei microdomini astiformi. È stato così possibile valutare l'orientamento direzionale dei microdomini biopolimeri osservando i record asciugatura utilizzando un microscopio di polarizzazione.
In conclusione, sono stati usati i metodi che utilizzano la luce polarizzataper l'auto-integrazione dei biopolimeri megamolecular sull'interfaccia asciugatura ad aria-LC. La dinamica delle soluzioni acquose LC sono stati monitorati facendo evaporare l'acqua da una cellula di un lato aperto. Analizzando le immagini scattate utilizzando luce polarizzata trasversale, è stato possibile riconoscere i cambiamenti spazio-temporali e il parametro ordine orientazionale. Considerando che il processo di essiccazione dimostrato è simile ai processi naturali, questo metodo sarebbe utile per la caratterizzazione non solo materiali artificiali in vari campi, ma anche dei tessuti viventi naturali. Noi crediamo che questo potrebbe fornire un metodo di valutazione per materiali morbidi in campo biomedico e ambientale.
Figura 1: Drying esperimento. (A) Rappresentazione schematica delle soluzioni in una cella di un lato aperto. (B)illustrazione schematica del dispositivo sperimentale utilizzato per osservazioni sotto luce polarizzata trasversale. I polarizzatori erano normalmente regolati a 45 ° e 135 °. (C) Il dispositivo reale. Questo dato è stato modificato dal riferimento 6. Copyright: L'American Chemical Society, 2016. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Essiccazione di soluzioni acquose del polisaccaridi gomma xantano e sacran. (A) illustrazione schematica del autointegrazione sull'interfaccia essiccazione all'aria-LC. (B) vista laterale di due tipi di soluzioni di polisaccaridi a loro stato iniziale e dopo6 h di essiccamento a 60 ° C sotto luce polarizzata trasversale. Le concentrazioni di polimero iniziali erano 0,5% in peso. (C) Trasmessa intensità della luce attraverso un Nicols incrociate su una linea nella direzione Z per ogni immagine scattata in un determinato momento. (D) Polarizzazione immagini microscopiche delle soluzioni polimeriche in cella dopo 6 h di essiccazione a 60 ° C. Frecce rosse: macrodomains sull'interfaccia. Questo dato è stato modificato dal riferimento 6. Copyright: L'American Chemical Society, 2016. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Processo di essiccazione di soluzioni acquose biopolimeri ei record di essiccazione. (A) Fonti dei poligoniaccharides (cianobatteri), MT (cervello suina), e il DNA (testicoli di salmone). (B) viste laterali di sacran, MT, e soluzioni di DNA durante l'essiccazione a 37 ° C sotto luce polarizzata trasversale. Le concentrazioni di polimero iniziali erano 0,5% in peso. (C) immagini microscopiche dei film polimerici secchi sul substrato di vetro attraverso le date direzioni dei Nicols incrociati. Tutte le barre di scala sono 50 micron. Questo dato è stato modificato dal riferimento 6. Copyright: L'American Chemical Society, 2016. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film S1: processo della soluzione sacran asciugatura durante l'essiccazione a 60 ° C, utilizzando osservatoNicols incrociati. Cliccate qui per scaricare questo film.
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Discussion
Talvolta era difficile per la messa a fuoco sul campione per l'intensità della luce trasmessa troppo bassa. In tali casi, ponendo una pellicola di plastica trasparente esteso sul palco aiutato a organizzare la messa a fuoco. La limitazione della risoluzione osservabile dipendeva dalla lente della fotocamera, ~ 10 micron in questo caso. La limitazione osservabile lo spessore del campione, Ay, dipendeva dalla massima intensità luminosa della lampada, ~ 10 mm in questo caso.
Il vantaggio del dispositivo di figura 1B è che permette vista laterale foto del campione da osservare durante il processo di essiccazione. L'osservazione può essere effettuata senza fare affidamento sul piano orizzontale, che viene utilizzato nei microscopi tipici. Stando alla cella un lato aperto durante gli esperimenti di essiccazione, la direzione evaporazione viene regolata e nella direzione opposta di gravità. Monitorare la vista laterale consente anche il calcolo del ratto essiccazionee 4.
In futuro, ponendo regolatori di temperatura e umidità sulla fase del campione del dispositivo, sarà possibile monitorare automaticamente cambiamenti temporali del parametro d'ordine orientativo. Inoltre, un equilibrio nel setup per monitorare la variazione di peso aiuterebbe la stima della concentrazione. Questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per chiarire il processo anisotropo gonfiore del polisaccaride idrogeli 11, 12. Sarebbe quindi possibile monitorare i cambiamenti strutturali degli attuatori molli.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione-in-aiuto per giovani scienziati (16K17956) dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia del Giappone, Kyoto Tecnoscienza Centro, e la Fondazione Mitani di ricerca e sviluppo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sacran | Green Science Materials Inc., Japan | From Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1 |
|
| xanthan gum | Taiyo Kagaku Co., Japan | Neosoft XC | From Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1 |
| tubulin | Cytoskeleton, Inc., USA | T240 | From porcine brain. |
| GpCpp | Jena Bioscience, Germany | NU405L | |
| piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrichi, Co. LLC. | P6757-500G | PIPES |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 342-01314 | EGTA |
| MgCl2-6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-15055 | |
| KOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 162-21813 | pellet |
| DNA | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | D1626 | From salmon testes. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp) |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | T9285-100ML | 10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA |
| slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan | S1111 | |
| silicon rubber sheet | Asone Co. | 6-611-32 | Thickness: 1 mm |
| centrifuge | Beckman-Coulter, Inc., USA | Avanti J-25 | equipped with a JA-20 rotor |
| light source | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | LS-LHA | |
| light guide | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M) | 80 mm × 80 mm |
| halogen lamp | Ushio Inc., Japan | JCR 15V150WBN | |
| holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | KMH-80 | |
| sample stage | Sigmakoki, Co.,Ltd. | TARW-25503L | |
| sample holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | SHA-25RO | |
| rod | Sigmakoki, Co.,Ltd. | ROU-12-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-6-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-60 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-80 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-130 | |
| carrier | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CAA-25LS | |
| camera holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CMH-2 | |
| medium optical rail | Sigmakoki, Co.,Ltd. | OBA-500SH | |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L25 mm |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L50 mm |
| multiband | Tomytech, BORG | 80φ | |
| V plate | Tomytech, BORG | V plate 60S | |
| plate holder | Viexen, Co.,Ltd. | plate holder SX | |
| EOS Kiss X7i | Canon Inc., Japan | 8594B001 | with a standard zoom lens, EFP 18-55 mm |
| photographic software | Canon Inc., Japan | EOS Utility | |
| PC | Microsoft | Surface | |
| polarization microscope | Olympus | BX51 | |
| first order retardation plate | Olympus | U-TP530 | λ = 530 nm |
| CCD camera | Olympus | DP80 | |
| photographic software | Olympus | cellSens Standard | |
| Java-based image processing program | the National Institutes of Health | ImageJ |
References
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