Summary
Um método para a secagem induzida por auto-integração de biopolímeros megamolecular na interface ar-líquido cristalino é fornecida aqui. Esta metodologia será útil não só para a compreensão dos potenciais macroscópicas de biopolímeros, mas também como um método de avaliação para materiais macios em campos biomédicos e ambientais.
Abstract
Os organismos vivos que usam a água está sempre propenso a secar no meio ambiente. As suas actividades são accionados por micro-com base de biopolímero e macro-estruturas, como pode ser visto nos casos de água em movimento em feixes vasculares e hidratação de água nas camadas da pele. Neste estudo, foi desenvolvido um método para avaliar o efeito das soluções aquosas líquidas cristalinas (LC) compostas de biopolímeros sobre secagem. Como biopolímeros de LC peso megamolecular, escolhemos estudar polissacarídeos, proteínas do citoesqueleto, e ADN. A observação de soluções de biopolímeros durante a secagem sob luz polarizada revela auto-integração milliscale começando a partir da interface ar-LC instável. A dinâmica das soluções aquosas de biopolímero LC pode ser monitorizada por evaporação de água a partir de uma célula de um lado aberto. Ao analisar as imagens tiradas usando a luz cross-polarizado, é possível reconhecer as mudanças espaço-temporais no parâmetro ordem de orientação. estemétodo pode ser útil para a caracterização de materiais artificiais, não só em vários campos, mas também tecidos vivos naturais. Nós acreditamos que ele irá fornecer um método de avaliação para materiais macios nas áreas biomédicas e ambientais.
Introduction
Ao concentrar-se nas estruturas rígidas, em forma de bastonete de biopolímeros, materiais macios dinâmicas têm sido usados para várias aplicações, incluindo matrizes de polissacárido biofilme 1, "geles" activas compostas de proteínas do citoesqueleto 2, e "origami de DNA" de 3 formas desejadas. Para esclarecer as propriedades estruturais, muitas estratégias têm sido exploradas, como a microscopia eletrônica de transmissão, microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica e microscopia de fluorescência confocal. No entanto, porque esses métodos são em sua maioria realizados em um estado seco ou estática, é difícil de explicar os comportamentos dinâmicos em escalas macroscópicas, como visto em sistemas vivos reais. Recentemente, observou-se com êxito o comportamento dinâmico de biopolímeros na interface ar-aquoso LC através da luz polarizada 4. Durante a visualização da estrutura orientada durante a secagem do biopolimerosolução, as alterações temporais indicados auto-integração de biopolímeros na interface ar-LC instável.
Aqui, descrevemos um protocolo para a secagem de soluções LC biopolímeros na interface ar-LC utilizando instrumentos polarizadas. Ao contrário de outras análises da fase LC que não consideram secagem 5, 6, a dinâmica de LC durante o processo de secagem foram investigados aqui, avaliando o parâmetro de orientação ordem na vista lateral da fase de fluido de uma célula de um lado aberto . A combinação da evaporação de células e o uso de instrumentos polarizados permitidos para monitorização macroscópico com uma direcção de evaporação controlada. Além disso, foi possível para validar os registos de secagem, concentrando-se nas estruturas cristalinas de microdomínios adsorvidas, que foram afectados pelo peso molecular, concentração, etc. Para demonstrar a eficácia do método, a pró secagemcessos de biopolímeros básicos com formas em vareta rígida tais como, polissacáridos, os microtúbulos (MTS), e ADN, foram investigados. Escolhemos estes biopolímeros porque eles são exemplos típicos de macromoléculas hierárquicos com pesos megamolecular, e as suas interacções intermoleculares lhes permitir formar estados de LC.
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Protocol
1. Instrumentos
- dispositivo de polarização
- Para construir um dispositivo de polarização, proporcionar uma fonte de luz com uma lâmpada de halogéneo, um guia de luz, polarizadores, um estágio da amostra, um trilho óptico, haste está, e uma câmara digital de lente única reflexo (ver Figura 1C e Materiais Lista para a polarização peças do dispositivo).
2. Preparação da Solução Biopolymer
- soluções de polissacarídeos
- Dissolver sacran 7 (0,5 g) em água pura (100 ml) por agitação a ~ 80 ° C durante mais de 12 h. Durante a dissolução, cobrir o recipiente com película de plástico para evitar a evaporação. Prepara-se uma solução aquosa de goma de xantano da mesma maneira.
- Arrefecer as soluções a ~ 25 ° C para se obter soluções aquosas a 0,5% em peso.
- Centrifugar a solução para remover impurezas sacran (48400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 times).
- solução MT
- Prepara-se uma solução de tubulina de 0,5% em peso (1 ml) em um tampão de Britton-Robinson (80 mM de piperazina-N, N'-bis (ácido 2-etanossulfónico) (PIPES), etileno glicol-bis (éter 1 mM β-aminoetil) - N, N, N 'N' tetraacico (EGTA); e 5 mM de MgCl2, pH 6,8) em gelo 8.
- Use solução tubulina 0,5% em peso (50 mL) e a guanosina-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfato (GpCpp) (5 mL) para preparar uma solução de tubulina GpCpp contendo (50 mL). Incubar a 37 ° C durante 3 h para se obter um núcleo estável MT.
NOTA: O papel do GpCpp é apoiar a formação de MT e para suprimir completamente a despolimerização de MT para tubulina. - Misturar a solução de 0,5% em peso de tubulina (950 mL) e a solução tubulina GpCpp contendo (50 mL) a ~ 25 ° C durante um dia para se obter uma solução estável MT de 0,5% em peso.
- solução de ADN
- Prepara-se uma solução de ADN de 0,5% em peso (1 ml) em solução tampão de Tris-EDTA (Tris 10 mM, pH 8,0, com EDTA 1 mM).
- Manter as soluções de amostra biopolímero 0,5% em peso a 25 ° C durante a experiência de secagem.
3. Experiências de secagem e Observação sob luz Cross-polarizada
- Soluções em uma célula de um lado aberto (Figura 1A)
- Cortar uma folha de silício (ver Lista de Materiais) em uma forma apropriada com uma espessura de 1 mm (dimensão interna de 5-15 mm, de 1 mm, e ~ 20 mm; Figura 1A).
- Montar uma célula de um lado aberto composto por um espaçador de silício com dimensão interna de 5-15 mm, de 1 mm, e ~ 20 mm e duas lâminas de vidro não-modificada (76 mm × 1 mm × 26 mm). Fixar ambos os lados da célula com os grampos duplos com antecedência para manter a solução de amostra de vazar para fora.
- Lentamente adicionar cada da solução do biopolímero 0,5% em peso (100-300 uL) utilizando uma pipeta de 1 mm de tamanho de poro de ~te ponta para cada célula a ~ 25 ° C. Retirar as bolhas de ar a partir das culas utilizando uma agulha de seringa.
- Colocar as células em um forno com um circulador de ar a 60 ° C sob pressão atmosférica durante a evaporação; a direcção evaporação é oposto ao da gravidade.
- Cortar uma folha de silício (ver Lista de Materiais) em uma forma apropriada com uma espessura de 1 mm (dimensão interna de 5-15 mm, de 1 mm, e ~ 20 mm; Figura 1A).
- Observações sob luz polarizada cruzada (Figura 1B-1C)
- Fornecer luz linear visível através de uma lâmpada de halogéneo de 100 W com uma fonte de luz de superfície plana sobre uma vasta área (80 mm x 80 mm). Ajustar os polarizadores para 45 ° e 135 °, utilizando os detentores (Figura 1C).
- Fixar as posições da fonte de luz, polarizadores, estágio da amostra, e a câmara utilizando um trilho óptico e bancadas haste (Figura 1C). Coloque a fase de amostra entre os dois polarizadores (a distância entre os polarizadores deve ser ~ 5 centímetros). Coloque a câmara ~ 20 cm de altura a partir da fase da amostra para permitir focar.
- Em determinados momentos, colocar as amostras a partir do passo 3.1.3 entre a polarizers na fase paralela ao plano xz e cobrir o dispositivo com uma cortina preta; o próprio dispositivo é mostrado na Figura 1C.
- Fotografar as amostras através de polarizadores lineares cruzou usando uma câmera digital reflex de lente única com uma lente de zoom standard (ver Lista de Materiais). Controlar as configurações da câmera, como a distância focal, utilizando software de computador (ver Lista de Materiais).
- Análise espácio-temporal da intensidade da luz transmitida (Figura 1C)
- Para avaliar a mudança do parâmetro de orientação ordem no processo de secagem, recolha fotografias de hora em hora, durante 24 h.
- Medir a intensidade da luz transmitida ao longo do eixo na direcção Z como um valor de cinzento, utilizando um programa de processamento de imagem (por exemplo, ImageJ).
- Traçar um gráfico do valor de cinza como uma função da distância a partir do lado superior aberto.
- Observações microscópicas sob ligh polarizado-cruzt (Figura 1D)
- Para verificar os métodos, fazer observações microscópicas com um microscópio de polarização equipado com uma câmara CCD 9. Mantenha uma placa retardo de primeira ordem no caminho da luz. Controlar as condições para as fotos usando um software de PC.
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Representative Results
Utilizando o dispositivo, como mostrado na Figura 1, o auto-integração de microdomínio para macrodomain sobre uma secagem interface ar-LC foi avaliada (Figura 2A). Como a primeira demonstração da experiência de secagem, dois tipos de polissacáridos, megamolecular sacran (M w = 1,9 x 10 7 g mol-1) e goma de xantano (4,7 x 10 6 g mol-1), foram comparados. A Figura 2B mostra fotografias das soluções na célula sob luz polarizada cruzada. Antes da secagem, foi possível observar várias regiões brilhantes e com a luz transmitida num estado dispersado em ambas as soluções. Após secagem a 60 ° C durante 6 h, a região abaixo da interface ar-LC na solução sacran tornou-se significativamente elevada. Isto significa que os domínios formada uma estrutura orientada macroscopicamente na interface, semelhante à formação de camada de revestimento num processo de encolhimento gel"xref"> 10. Por outro lado, a intensidade da solução de xantano diminuiu drasticamente quando a temperatura foi apenas aumentou de 25 ° C a 60 ° C, e algumas pequenas macrodomains foram observadas por baixo da interface. Isto porque a mobilidade do microdomínio xantana é muito mais sensível à temperatura do que a do microdomínio sacran. As diferenças críticos da orientação na interface foram, portanto, detectados usando o dispositivo de polarização.
Figura 2C e Filme S1 mostram os resultados da análise espaço-temporal para o processo de secagem na solução sacran. A intensidade da luz transmitida indica o parâmetro de orientação fim do microdomínio. A intensidade do pico em torno da interface ar-líquido aumentou significativamente, e a espessura aumentou para ~ 2 mm. Estes resultados indicam claramente que os microdomínios começar a orientar a partir da interface ar-LCd crescer em um domínio milliscale paralelo à interface. A partir desta observação sob luz polarizada, é assim possível visualizar os movimentos fluidos no processo de secagem.
As diferenças entre goma xantana sacran e em termos de tamanho e macrodomain direcção de orientação, também foram confirmadas por um microscópio de polarização com uma placa de retardamento de primeira ordem (Figura 2D). A fase fluida sacran mostrou uma região azul, o que significa que uma única macrodomain formada na interface. Em contraste, a fase de fluido de goma xantana mostraram regiões azul, amarelo, cor de rosa e, o que significa que os vários macrodomains formado com orientações arbitrárias.
Este método também foi explorada para a comparação de três tipos de biopolímeros rígidas básicos com pesos megamolecular - polissacáridos (sacran: H W = 1.9 x 10 7 g mol-1, microdomíniocomprimento> 20 um), MT (M w = 10 9 -10 10 g mol-1, microdomínio comprimento> 10 um), e ADN (M w = 1,3 x 10 6 g mol-1, comprimento microdomínio <1 mm) - em um ambiente fisiológico a 37 ° C. Antes da secagem, como mostrado na Figura 3B, a solução sacran e a solução MT mostrou estados LC semelhantes, com domios dispersos em toda a área. Durante o processo de secagem, os domínios na solução MT também foram submetidos a auto-integração a partir da interface ar-CL, e os domínios dispersos foram integrados num único macrodomain. Por outro lado, a solução de ADN não mostrou qualquer orientação específica na fase líquida. No caso da solução MT e a solução de DNA preparada com tampões, é importante notar que a integração é afectado pelas alterações na concentração de sal, pH e força iónica durante a secagem.
(Figura 3C). A ficha de secagem sacran exibiram intensidades de birrefringência significativas devido à formação macrodomain único milliscale. Para o registo de secagem TA, observou-se feixes onduladas onde o eixo maior era paralelo ao eixo-X. Em contraste, a ficha de secagem da solução de ADN mostrou grãos em forma de macrodomains <5 ^ m em diâmetro e em direcções arbitrárias. A partir destas observações, é claro que o tamanho macrodomain é afectada pelo comprimento de microdomínios semelhantes a haste. Assim, foi possível avaliar a orientação direccional dos microdomínios biopolímeros observando os registos de secagem usando um microscópio de polarização.
Em conclusão, foram utilizados os métodos que utilizam a luz polarizadapara o auto-integração de biopolímeros megamolecular sobre a interface de ar de secagem-LC. A dinâmica das soluções aquosas de LC foram monitorizados por evaporação de água a partir de uma célula de um lado aberto. Ao analisar as imagens tiradas usando a luz cross-polarizado, foi possível reconhecer as mudanças espaço-temporais e o parâmetro de ordem de orientação. Considerando-se que o processo de secagem demonstrado é semelhante a processos naturais, este método seria útil para a caracterização de materiais artificiais, não só em vários campos, mas também de tecidos vivos naturais. Acreditamos que este poderia fornecer um método de avaliação para materiais macios nas áreas biomédicas e ambientais.
Figura 1: Secagem experimento. (A) Representação esquemática das soluções em uma célula de um lado aberto. (B)Ilustração esquemática do dispositivo experimental utilizado para a observação sob luz polarizada cruzada. Os polarizadores foram normalmente ajustadas para 45 ° e 135 °. (C) O dispositivo real. Esta figura foi modificado a partir de referência 6. Direitos de autor: A American Chemical Society, 2016. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Processo de secagem de soluções aquosas de polissacarídeos de goma de xantano e sacran. (A) Ilustração esquemática do auto-integração na interface ar-LC secagem. (B) Vistas laterais de dois tipos de soluções de polissacarídeo em seus estados iniciais e depois6 h de secagem a 60 ° C sob luz polarizada cruzada. As concentrações de polímero iniciais foram de 0,5% em peso. (C) Transmitido a intensidade da luz por meio de um Nichols cruzadas sobre uma linha na direcção Z para cada fotografia tirada num dado momento. (D) Polarização imagens microscópicas das soluções de polímero na célula após 6 h de secagem a 60 ° C. setas vermelhas: macrodomains na interface. Esta figura foi modificado a partir de referência 6. Direitos de autor: A American Chemical Society, 2016. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Processo de secagem de soluções aquosas de biopolímero e os registos de secagem. (A) As fontes dos polígonosaccharides (cianobactérias), MT (cérebro porcino) e de ADN (de testículos de salmão). (B) vistas laterais de sacran, MT, e soluções de ADN durante a secagem a 37 ° C sob luz polarizada cruzada. As concentrações de polímero iniciais foram de 0,5% em peso. (C) As imagens microscópicas das películas de polímero secas sobre o substrato de vidro através das instruções dadas dos Nichols cruzados. Todas as barras de escala são de 50? M. Esta figura foi modificado a partir de referência 6. Direitos de autor: A American Chemical Society, 2016. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme S1: processo da solução sacran secagem durante a secagem à temperatura de 60 ° C, observado usandoNicols cruzados. Por favor clique aqui para baixar este filme.
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Discussion
Às vezes era difícil para a câmara focar a amostra devido à intensidade de luz transmitida ser demasiado baixo. Nesses casos, colocar um filme plástico transparente estendida no palco ajudou a organizar o foco. A limitação da resolução observável era dependente da lente da câmara, ~ 10 um, neste caso. A limitação observável da espessura da amostra, Ay, era dependente da intensidade de luz máxima da lâmpada, ~ 10 mm neste caso.
A vantagem do dispositivo mostrado na Figura 1B é que ele permite de visão lateral fotos da amostra a ser feita durante o processo de secagem. A observação pode ser levada a cabo sem depender do plano horizontal, o qual é utilizado em microscópios típicas. Estando a célula de um lado aberto durante os ensaios de secagem, a evaporação é regulada direcção e na direcção oposta da gravidade. Controlo da vista lateral também permite o cálculo do rato secageme 4.
No futuro, pela colocação de temperatura e humidade reguladores na fase de amostra do dispositivo, será possível controlar automaticamente as alterações temporais no parâmetro de ordem de orientação. Além disso, um equilíbrio na configuração para monitorar a mudança de peso ajudaria a estimativa da concentração. Este método também poderia ser usado para esclarecer o processo anisotrópica inchaço de polissacárido hidrogéis 11, 12. Por isso, seria possível monitorar as mudanças estruturais de atuadores macios.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por grant-in-aid para Jovens Cientistas (16K17956) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão, The Kyoto tecnociência Center, ea Fundação Mitani para a Investigação e Desenvolvimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sacran | Green Science Materials Inc., Japan | From Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1 |
|
| xanthan gum | Taiyo Kagaku Co., Japan | Neosoft XC | From Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1 |
| tubulin | Cytoskeleton, Inc., USA | T240 | From porcine brain. |
| GpCpp | Jena Bioscience, Germany | NU405L | |
| piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrichi, Co. LLC. | P6757-500G | PIPES |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 342-01314 | EGTA |
| MgCl2-6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-15055 | |
| KOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 162-21813 | pellet |
| DNA | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | D1626 | From salmon testes. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp) |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | T9285-100ML | 10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA |
| slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan | S1111 | |
| silicon rubber sheet | Asone Co. | 6-611-32 | Thickness: 1 mm |
| centrifuge | Beckman-Coulter, Inc., USA | Avanti J-25 | equipped with a JA-20 rotor |
| light source | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | LS-LHA | |
| light guide | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M) | 80 mm × 80 mm |
| halogen lamp | Ushio Inc., Japan | JCR 15V150WBN | |
| holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | KMH-80 | |
| sample stage | Sigmakoki, Co.,Ltd. | TARW-25503L | |
| sample holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | SHA-25RO | |
| rod | Sigmakoki, Co.,Ltd. | ROU-12-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-6-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-60 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-80 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-130 | |
| carrier | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CAA-25LS | |
| camera holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CMH-2 | |
| medium optical rail | Sigmakoki, Co.,Ltd. | OBA-500SH | |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L25 mm |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L50 mm |
| multiband | Tomytech, BORG | 80φ | |
| V plate | Tomytech, BORG | V plate 60S | |
| plate holder | Viexen, Co.,Ltd. | plate holder SX | |
| EOS Kiss X7i | Canon Inc., Japan | 8594B001 | with a standard zoom lens, EFP 18-55 mm |
| photographic software | Canon Inc., Japan | EOS Utility | |
| PC | Microsoft | Surface | |
| polarization microscope | Olympus | BX51 | |
| first order retardation plate | Olympus | U-TP530 | λ = 530 nm |
| CCD camera | Olympus | DP80 | |
| photographic software | Olympus | cellSens Standard | |
| Java-based image processing program | the National Institutes of Health | ImageJ |
References
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