Introduction
I de sidste 15 år har mikrofluidik som et felt gennemgået hurtig vækst, med en eksplosion af nye teknologier muliggør manipulation af væsker på mikrometer skala 1. Mikrofluide systemer er attraktive platforme for våd laboratorium funktionalitet fordi de små volumener har potentiale til at realisere øget hastighed og følsomhed, mens på samme tid dramatisk øger datahastigheden og reducere omkostningerne ved at udnytte stordriftsfordele 2, 3. Flerlags mikrofluide systemer har gjort særdeles betydelige påvirkninger i højt gennemløb biokemisk analyse applikationer såsom enkelt celleanalyse 4, 5, 6, enkelt molekyle analyse (fx, digital PCR 7), proteinkrystallografi 8, transskriptionsfaktorbindende assaysf "> 9, 10, og cellulær screening 11.
Et centralt mål for mikrofluidik har været udviklingen af "lab på en chip" enheder, der kan udføre komplekse fluide manipulationer i en enkelt enhed til total biokemisk analyse 12. Udviklingen af multi-lags blød litografi teknikker har hjulpet realisere dette mål ved at muliggøre etablering af on-chip ventiler, mixere og pumper til aktivt at kontrollere væsker i små mængder 13, 14, 15. Trods deres fordele og demonstreret applikationer, mange af disse mikrofluide teknologier stort set uhæmmede af ikke-specialiserede brugere. Udbredt vedtagelse har været udfordrende dels på grund af begrænset adgang til microfabrication faciliteter, men også på grund af utilstrækkelig kommunikation af fremstillingsteknik. Dette gælder især for flerlags mikrofluidenheder byder strukturer til ventiler eller komplekse geometrier: knapheden på detaljerede, praktiske oplysninger om vigtige designparametre og fremstillingsteknik ofte afskrækker nye forskere fra at påbegynde projekter, der involverer design og skabelse af disse enheder.
Denne artikel har til formål at løse dette manglende viden ved at præsentere en komplet protokol for at gøre flerlags mikrofluidenheder med ventiler og variabel højde funktioner, startende fra designparametre og bevæger sig gennem alle fabrikation trin. Ved at fokusere på de indledende fotolitografiske trin i fabrikation, denne protokol supplerer andre mikrofluidiksystemer protokoller 16, som beskriver downstream trin støbning enheder fra skimmelsvampe og kører specifikke eksperimenter.
Mikrofluidenheder med monolitisk on-chip ventiler er sammensat af to lag: et "flow" lag, hvor væsken af interesse manipuleres i mikrokanaler, og en "kontrol" lag, hvor mikrokanaler indeholdende luft eller vand selektivt kan modulere fluidstrømning i strømmen lag 14. Disse to lag er hver fremstillet på en separat silicium molding mester, som efterfølgende anvendes til polydimethylsiloxan (PDMS) replika støbning i en proces kaldet "blød litografi 17." Til dannelse af en flerlaget anordning, er hver af PDMS lag støbt på deres respektive molding mastere og derefter tilpasset til hinanden, hvorved der dannes en sammensat PDMS enhed med kanaler i hvert lag. Ventiler dannes på steder, hvor strømnings- og styrekanaler krydser hinanden og er adskilt af kun en tynd membran; tryk i styrekanalen afbøjer denne membran for at okkludere strømningskanalen og lokalt fortrænge fluidet (figur 1).
Aktive on-chip ventiler kan fremstilles på flere måder, afhængigt af den ønskede endelige anvendelse. Ventilerkan konfigureres i enten en "push down" eller "push up" geometri, afhængigt af om kontrollag er over eller under strømningen lag (figur 1) 15. "Push up" geometrier muliggør lavere lukketryk og højere enhed stabilitet mod delaminering, mens "push down" geometrier muliggør strømningskanalerne at være i direkte kontakt med det bundne substrat, giver den fordel, at selektiv funktionalisering eller mønsterdannelse af substratoverfladen til senere funktionalitet 18, 19.
Ventiler kan også være enten forsætligt lækkende "si" ventiler eller fuldt forseglelig, afhængigt af den tværsnitsprofil af strømningskanalen. Sieve ventiler er anvendelige til fangst perler, celler eller andre macroanalytes 1, og er fremstillet ved brug af typiske negative fotoresister (dvs. SU-8 serier), der have rektangulære profiler. Når en styrekanal sættes under tryk i løbet af disse ventil regioner, PDMS membranen mellem betjeningsorganet og flow lag afbøjer isotropisk i den rektangulære profil af ventilen uden at forsegle hjørnerne, tillader fluidstrømning men indfangning kalkpartikler makro (Figur 1). Omvendt er fuldt forsegles mikrofluide ventiler fremstillet ved at inkludere en lille plaster på afrundet fotoresist på ventil steder. Med denne geometri, tryk i styrekanalen afbøjer membranen mod den afrundede flow lag til fuldstændigt at forsegle kanalen, standse fluidstrømning. Afrundede profiler i flowet lag genereres via smelte- og omløb af positiv fotoresist (f.eks AZ50 XT eller SPR 220) efter typisk fotolitografiske trin. Vi har tidligere vist, at post-reflow højder af ventil regioner afhænger af udvalgte har dimensioner 21. Denne protokol viser fremstillingen af både ventil geometrier medi en vulst syntese enhed.
Figur 1: Multilayer Mikrofluid Valve geometrier. Typiske "skub op" enhed arkitekturer til si og fuldt forseglelige ventiler før (øverst) og efter (nederst) overtryk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Enheder kan også omfatte komplekse passive funktioner såsom kaotiske mixere 13 og on-chip modstande 20, der kræver funktioner i flere forskellige højder inden for en enkelt flow lag. For at opnå en variabel højde flow lag, har forskellige grupper beskæftigede mange metoder, herunder printplade ætsning 22, flerlaget PDMS relief alignment 23, eller flertrins photolithography 24. Vores gruppe har fundet flere trin fotolitografi på en enkelt støbning mester at være en effektiv og reproducerbar metode. For at gøre dette, er en simpel fotolitografisk teknik med at opbygge tykke kanaler af negativ fotoresist (f.eks SU-8 serien fotoresister) i lag uden udvikling mellem anvendelsen af hvert lag beskæftiget. Hvert lag er spundet i negativ fotoresist ifølge dets tykkelse efter fabrikantens anvisninger 25 på silicium master. Funktioner af denne højde derpå mønstret på laget ved anvendelse af en specifik gennemsigtighed maske (figur 2) er fastgjort til et glas maskepladen og tilpasset til den tidligere spundet lag før eksponering. I flertrins fotolitografi, præcis justering mellem lag er kritisk i at danne en komplet variabel højde strømningskanal. Efter justering er hvert lag underkastes en tykkelse-afhængig post-eksponering bage. Uden udvikling, det næste lag er similarly mønstrede. På denne måde kan høje funktioner opbygges på et enkelt flow wafer lag-på-lag ved brug af flere masker. Spring udvikling mellem hvert trin, kan tidligere fotoresist lag anvendes til at danne sammensatte højde funktioner (dvs. kan to 25 um lag lave en 50 um funktion) 24. Derudover kan gøres kanal gulv funktioner såsom kaotisk mixer sildeben riller 13 ved hjælp af lag med tidligere eksponerede funktioner. Et sidste udvikling trin fuldender processen, at skabe et enkelt flow wafer med funktioner i variabel højde (figur 3).
Her er en komplet protokol for multi-trins fotolitografi der indeholder eksempler på alle procedurer, der er nødvendige for at fabrikere on-chip ventiler og flow kanaler med flere højder forudsat. Denne fabrikation protokol præsenteres i forbindelse med en multi-lag mikrofluid perle synthesizer, der kræver ventiler og variable-højde funktioner for sin funktionalitet. Denne enhed omfatter T-kryds til at generere vanddråber i en olie kappe, on-chip modstande at modulere strømningshastigheder gennem styring Poiseuille modstand, en kaotisk mixer til homogenisering dråbe komponenter, og begge fuldt forsegling og si ventiler til at muliggøre automatiserede arbejdsgange, der involverer flere reagens indgange. Brug multi-trins fotolitografi, er disse funktioner hver fremstillet på en anden lag efter højde eller fotoresist; følgende lag er konstrueret i denne protokol: (1) Flow Round ventil lag (55 um, AZ50 XT) (2) Flow Lav lag (55 um, SU-8 2050) (3) Flow Høj lag (85 um, SU- 8 2025 30 um additiv højde), og (4) Herringbone Grooves (125 um, SU-8 2025 40 um additiv højde) (figur 3).
Hydrogelperler kan anvendes til en lang række applikationer, herunder selektiv overflade funktionalisering for downstream assays, lægemiddelindkapsling, radiotracing og billedbehandling assays og celle inkorporering; vi tidligere brugt en mere kompleks udgave af disse enheder til at producere spektralt kodede PEG hydrogel perler indeholdende lanthanid nanophosphors 20. De designs diskuteret her indgår i Yderligere ressourcer for enhver lab at bruge i deres forskning, hvis det ønskes. Vi forventer, at denne protokol vil give en åben ressource for specialister og ikke-specialister både interesseret i at gøre flere lag mikrofluidenheder med ventiler eller komplekse geometrier at sænke adgangsbarriere i mikrofluidik og øge chancerne for fabrikation succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Multi-layer Device Design
BEMÆRK: Funktioner af forskellige højder og / eller fotoresister skal tilføjes sekventielt til wafer under forskellige fabrikation trin for at oprette endelige sammensatte funktioner. Derfor, for at design for hver enkelt højde og fotoresist blive optaget på skal være trykt en wafer på deres egne maske (figur 4).
- Download en computer-assisteret design (CAD) udarbejdelse program (fx AutoCAD Educational Version).
- Definer 4 "wafer område ved at tegne en 4" cirkel. Wafer designs (figur 4, Yderligere ressourcer) stilles som et eksempel.
- Inde i 4 "wafer skitse, sted enhed grænser bruger 300 um polylinje rektangler. Brug disse enhedens grænser for tilpasning under fotolitografi.
- Skabe forskellige lag for hver forskellig højde eller fotoresist nødvendig for den endelige udformning (dvs. flow runde, flow lav, flow høj,og kontrol i design) ved hjælp af panelet Lag.
- Design funktioner i en bestemt ønsket højde på det tilsvarende lag. Eksemplet design viser 4 forskellige aktive lag, hver med sin egen farve (figur 4).
BEMÆRK: Device grænser, global tekst og wafer omrids bør foretages på deres eget lag (dvs. 1-Negativ i design), som senere vil blive vist på alle lag for global tilpasning. Funktioner af forskellig fotoresist (såsom fuldt forseglelige ventiler, der skal fremstillet med positiv modstå) skal stå på forskellige lag, uanset højde.
- Design funktioner i en bestemt ønsket højde på det tilsvarende lag. Eksemplet design viser 4 forskellige aktive lag, hver med sin egen farve (figur 4).
- Brug af lukkede nul-bredde polylinier, design enhedens funktioner inden for enhedens grænser.
- Overvej designparametre i tabel 1 for at øge chancerne for en vellykket opspind.
- For hver højde, skal du vælge det lag i panelet Lag, og tilføje alle funktioner i denne højde.
- Paratdesign for gennemsigtighed film udskrivning ved hjælp af Basic Mask File (Yderligere ressourcer), hvor "indsættes wafer cirkel, inden for en 5" hver 4 rektangulære grænse. Hvert lag vil blive trykt på en separat transparenter til sekventiel tilføjelse af hvert fotoresist lag.
BEMÆRK: Denne Grundlæggende Mask fil repræsenterer de endelige design, der anvendes til udskrivning.- For at fuldføre design, slå alle Lag off undtagen 1-Negative og AZ50 XT ventil lag. Kopier hele wafer med det aktive lag (dvs., ventiler) og globale funktioner (dvs.., Enhed grænser).
- Åbn Grundlæggende Mask File og indsæt dette design i rektangel titlen AZ50 XT ventiler. Brug den ydre wafer grænsen for tilpasning og efterfølgende slette den efter indsætning.
- Gentag for resten af lagene (f.eks, i eksemplet design: flyde ligge lavt, flow ligge højt, og kontrol). Eksempel gennemsigtighed filer leveres (Yderligere ressourcer).
- Send filer til en comkommerciel trykning selskab (f.eks Fineline Imaging) til udskrivning på transparenter. Brug 32.000 DPI til udskrivning> 10 um funktioner og op til 50.000 DPI til mindre funktioner. Hvis der er behov funktioner mindre end 7 um, bestille en Chrome Mask i stedet for en transparenter.
Tabel 1: Design Parametre og forslag. Design overvejelser at undgå almindelige faldgruber under CAD design processen med mikrofluidenheder. Klik her for at se denne tabel. (Højreklik for at downloade.)
2. Forberedelse en Wafer for Fotolitografi
BEMÆRK: Disse trin derudover synes i tabel-format i tabel 2.
- I renrum eller udpeget rent område, ren og dehydrere en 4 "test-grade silicium wafer (single-side polished).
- Skyl wafer godt med methanol.
BEMÆRK: Der er behov Ingen yderligere rengøring trin, hvis du bruger SU-8 vedhæftning lag beskrevet nedenfor. Andre vedhæftning lag, der afviger fra denne protokol (f.eks., HMDS) kræver ofte mere grundig rengøring, såsom Piranha ætsning. - Blow tørt med N2 eller trykluft.
- Bage på en aluminium varmeplade ved 95 ° C i 10 min til fuldstændig fordampe opløsningsmidlet.
- Skyl wafer godt med methanol.
- Fabrikere en ensartet 5 um tykt lag af SU-8 2005 forbedre vedhæftningen til efterfølgende fotoresist lag.
- Placer den rensede wafer på et spin coater, tænde for vakuum til at anbringe det til spin chuck, og blæse væk støv med N2 eller trykluft.
- Påfør 1-2 ml SU-8 2005 negativ fotoresist i centrum af wafer og centrifugering som følger: spread: 500 rpm, 10 sek, 133 rpm / s acceleration; cast: 3.000 rpm, 40 sek, 266 rpm / s acceleration.
- Fjern waferog blød bage ved at skifte wafer mellem to kogeplader indstillet på 65 ° C og 95 ° C ifølge den følgende program: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 3 min, 65 ° C: 2 min.
- Tillad wafer at afkøle til stuetemperatur.
- Placer wafer i borepatronen af en UV-maske aligner og eksponere uden en maske ( "oversvømmelse eksponering«) for en samlet energi aflejring af 124 mJ (her 20 sek ved ~ 6,2 mW / cm2 lampe intensitet). Hvis det er muligt, skal du vælge hårdt kontakt tilstand for at opnå en 300 um wafer: maske adskillelse.
- Fjern wafer og post-eksponering bage ved at skifte skiven mellem to kogeplader indstillet på 65 ° C og 95 ° C som følger: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 4 min, 65 ° C: 2 min.
Bearbejdning Afrundede Ventiler
- Brug online AZ50 XT ventil forudsigelse ressource 26 til at planlægge centrifugeringshastighed for ønskede ventil dimensioner og højder.
BEMÆRK: Følgende trin vil DEPOsidde en 55 um lag af positiv fotoresist for ventil definition og reflow afrunding. - Placer wafer på et spin coater, tænde vakuum til at anbringe det til spin chuck, og blæse væk støv med N2 eller trykluft.
- Påfør 2-3 ml AZ50 XT positiv fotoresist til midten af skiven. Spin som følger: spread: 200 rpm, 10 s, 133 rpm / s acceleration; cast: 1200 rpm, 40 sek, 266 rpm / s acceleration; Snap centrifugering for at fjerne kant bead: 3.400 rpm, 1 sek, 3.400 rpm / s acceleration.
- I en 5 "petriskål, fastsætter wafer omhyggeligt og lad slappe i 20 min.
- Soft bage skiven på en varmeplade: 65 ° C - 112 ° C, 22 min, 450 ° C / h ramping hastighed.
- Fjern skiven og lad hvile natten over ved stuetemperatur i en petriskål til omgivelsernes rehydrering.
- Tape Flow Round gennemsigtighed maske til 5 "glasplade udskriftssiden nedad (nærmest wafer) og indlæse i maske positioner af UV maske aligner. Expose wafer til 930 mJ UV i 6 serier (
- Udvikle wafer straks ved nedsænkning i en omrørt bad af 25 ml AZ500k 1: 3 Developer i 6 "glasskål i 3-5 min eller indtil bad fik lilla og funktioner emerge.
- Fjern skiven og skyl med deioniseret vand.
- Vurdere pre-reflow højde ved hjælp af en profilometer (stylus kraft på 10,5 mg).
BEMÆRK: Betjen profilometer overensstemmelse med producentens anvisninger, omhyggeligt at placere kraft pennen ud for en funktion kanal på det ønskede lag før profilering. Indstillinger, der anvendes i hele denne protokol var følgende: stylus force 10,5 mg, længde 1000 um, hastighed 200 um / s, regime ned-up.
- Reflow hårdt bage wafer at smelte og runde ventil funktioner som følger: 65 ° C - 190 ° C, 15 timer, 10 ° C / time ramping hastighed.
- Lad wafer afkøles til stuetemperatur. Vurdere post-reflow højde ved anvendelse af en profilometer (stylus kraft på 10,5 mg). bør forventes højder på 55 um ± 2 um for denne enhed geometri.
3. Bearbejdning variabel højde Funktioner i Tandem
- Fortsæt til variabel højde fabrikation med den udviklede wafer med Flow Lav, Flow Høj og Sildeben Mixer transparenter af Bead Synthesizer design.
- For at justere protokol for design, brug fremstilling datablade 25 for at bestemme eksponeringen energi, centrifugeringshastighed og bage tidsparametre, der giver mulighed for ± 5% tolerance.
BEMÆRK: Denne protokol fabrikerer en 55 um høj Flow Lav lag ved hjælp SU-8 2050 negativ fotoresist spundet over ventilen funktioner. - Placer den rensede wafer i spin coater, tænde for vakuum til at anbringe det til spin chuck, og blæse væk støv med N2 eller trykluft.
- Påfør 1-2 ml SU-8 2050 negativ fotoresist til midten af skiven og centrifugering som følger: spread: 500 rpm, 10 sek, 133 rpm / sek acceleration; cast: 3.000 rpm, 40 sek, 266 rpm / sek acceleration. Spin fotoresist over udviklet ventil funktioner.
- Læg forsigtigt spundet wafer i 5 "petriskål og lad slappe i 20 min på flad overflade, eller indtil nogen striber mønstre falme.
- Fjern skiven og blød bage ved at placere på to kogeplader indstillet på 65 ° C og 95 ° C som følger: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 8 min, 65 ° C: 2 min.
- Tillad waferen at afkøle til stuetemperatur.
- Tape Flow lav gennemsigtighed maske til en kvarts 5 "glasplade udskriftssiden nedad (tættest på wafer) og indlæse i masken positioner af UV maske aligner.
- Placer wafer i UV maske aligner chuck og ved hjælp af mikroskop okular eller kamera, omhyggeligt tilpasse nye Flow Lav lag funktioner til Flow Runde ventil lag funktioner. Begynd ved at justere vandrette, lodrette og tilt akser af enhedens grænser for enhedens grænserne features på maske. Dernæst justeres på tværs af hår funktioner between lag. Endelig bekræfter, at ventil funktioner skærer Flow Low har i givet fald.
- Expose til 170 mJ UV deposition (28 sek ved ~ 6,2 mW / cm2).
- Fjern skiven og post-eksponering bage ved at skifte mellem to kogeplader indstillet på 65 ° C og 95 ° C som følger: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 9 min, 65 ° C: 2 min.
- Uden at udvikle, tillader skiven at afkøle til stuetemperatur og fortsæt til fremstilling af Flow High lag. Dette Flow High lag vil tilføje 30 um af fotoresist til uudviklede 55 um fotoresistlag hvilket gav 85 um funktioner hos tidligere eksponerede steder.
- Gentag trin 3,3-3,10 hjælp SU-8 2025 og Flow High lag maske med disse ændringer for spin-coat indstillinger: spread: 500 rpm, 10 sek, 133 rpm / s acceleration; cast: 3.500 rpm, 40 sek, 266 rpm / sek acceleration.
- Expose til 198 mJ UV deposition (32 s ved ~ 6,2 mW / cm2).
- Uden udvikping, tillader wafer afkøle til RT og fortsæt til fremstilling af Kaotisk Mixer Herringbone lag. Afsluttende funktioner i dette lag vil have en totalhøjde på 125 um: 55 pm fra Flow Low lag, 30 um fra Flow Square lag, og 40 pm fra denne kaotiske Mixer Herringbone lag (se figur 3) og omfatter 35 um herringbone riller .
- Gentag trin 3,3-3,10 hjælp SU-8 2025 og Herringbone lagmaske med følgende ændringer, sikre, at sildeben riller er helt inden for Flow Høj kanal skitserer.
- Brug følgende soft bake program: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 7 min, 65 ° C: 2 min.
- Expose til 148 mJ UV deposition (24 s ved ~ 6,2 mW / cm2).
- Efter alle lag er afsluttet, udvikle ved at nedsænke wafer i en omrørt bad af 25 ml SU-8 udvikler i en 6 "glasfad til 3,5 min, eller indtil funktioner tydeligt frem. Kontroller at features har klare, definerede funktion grænser ved hjælp af en Stereoskopet.
- Hard bage wafer at stabilisere alle fotoresist funktioner på en varmeplade som følger: 65 ° C - 165 ° C, 2 timer 30 min, 120 ° C / h ramping hastighed.
- Vurdere funktionen højde i alle lag ved hjælp af en profilometer (stylus kraft på 10,5 mg).
4. Kontrol Wafer Fabrication
- Ren, dehydrere, og fabrikere et 5 um vedhæftning lag på en ny 4 "silicium wafer som i afsnit 4.
- Fabrikere en 25 um Kontrol Layer hjælp SU-8 2025 negativ fotoresist.
- Placer wafer på et spin coater, tænde vakuum til at anbringe det til spin chuck, og blæse væk støv med N2 eller trykluft.
- Påfør 1-2 ml SU-8 2025 negativ fotoresist i centrum af skiven og centrifugering som følger: spread: 500 rpm, 10 sek, 133 rpm / s acceleration; cast: 3.500 rpm, 40 sek, 266 rpm / sek acceleration.
- Fjern skiven og blød bage ved at skifte mellemto kogeplader indstillet på 65 ° C og 95 ° C som følger: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 5 min, 65 ° C: 2 min.
- Tillad waferen at afkøle til stuetemperatur.
- Ret kontrol gennemsigtighed maske til et 5 "glasplade og indlæse i UV maske aligner.
- Placer wafer i chuck UV maske aligner og udsættes for 155 mJ UV deposition (25 sek ved ~ 6,2 mW / cm2 lampe intensitet).
- Fjern skiven og post-eksponering bage ved at skifte mellem to kogeplader indstillet på 65 ° C og 95 ° C som følger: 65 ° C: 2 min, 95 ° C: 6 min, 65 ° C: 2 min.
- Develop ved neddypning af skiven i en omrørt bad af 25 ml SU-8 Developer i 6 "glasskål i 1 minut eller indtil funktioner emerge. Check funktioner under anvendelse af en stereoskop.
- Hard bage wafer at stabilisere fotoresist funktioner som følger: 65 ° C - 165 ° C, 2 timer 30 min, 120 ° C / time ramping hastighed.
5. Silan Wafer behandling for Easy PDMS Lift-off
- Placer de færdige vafler i wafer rack i en glasklokke vakuumdesikkator inde i en stinkskab fri for vand eller vandopløselige reagenser.
- Under kølerhjelmen, bruge en pipette til at anvende en dråbe trichlor (1H, 1H, 2H, 2H -perfluorooctyl) silan (PFOTS) til et objektglas og sted inde i ekssikkator.
- Luk ekssikkator låget og anvende vakuum i 1 min.
- Efter 1 min, slukke vakuum uden re-tryk eller evakuere glasklokke.
- Lad blandingen sidde i 10 minutter, mens aerosoliserede PFOTS frakker wafer overfladen.
- Åbn glasklokke låget og fjerne wafer med en pincet. Placer i en petriskål for PDMS replika støbning. Bortskaf silan-coatede dias i ordentlig farligt affald.
BEMÆRK: Wafers overtrukket med fluorerede silaner kan anvendes flere hundrede til tusinder af gange uden fornyet behandling. Et offerlag af 1:10 PDMS kan støbes på vafler, helbredt, og kasseres efter første silan behandling for at fjerne eXcess silangrupper fra wafer overfladen.
6. PDMS Replica Molding
- Fabrikere flerlags mikrofluidenheder i en "push up" geometri på glas i henhold til eksisterende open-access-protokoller 16.
BEMÆRK: En detaljeret protokol kan desuden findes på hjemmesiden 27. - Ved visuel inspektion, sikre, at alle ventiler er justeret korrekt at styre linjer og alle indgange (på både flow og kontrol lag) er stanset helt, før du fortsætter.
7. Produktion af Hydrogel Beads fra Dråber
- Tilslut slangen (f.eks Tygon) fyldt med vand til en Strømningsstyresystem (f.eks sprøjtepumper, fluide controllere, eller en open-source magnetventil array med reservoirerne 28).
- Slut metalstifter til slanger og oprette forbindelse til enhedens porte på kontrol linje indløb. Presse enhed styreledninger ved at indstille strømmen control foretrukne system til 25 psi i hver linje. Sørg for, at ventilerne lukke og genåbne ved inspektion under mikroskop.
BEMÆRK: Følg anvisningerne for flow kontrol foretrukne system producenten. I dette arbejde, en brugerdefineret software-kontrolleret pneumatisk system gælder pres på hver linje ved hjælp af magnetventiler, der skifte mellem 25 psi trykluft (tryk) og atmosfærisk tryk (trykket). Nærmere oplysninger om dette system findes i Discussion. - Forbered brugerdefinerede mikrofluide trykbeholdere for reagens og olie belastning.
- Ved hjælp af en push-pin, punch to huller i toppen af en kryogen hætteglas rør, indsætte kapillær PEEK slangen i et hul, og indsætte en metalstang forbundet til slangen i det andet hul.
- Seal slanger på plads med epoxy. Lad tørre i 1 time.
- Mens venter, i et mikrocentrifugerør, suspendere 3,9 mg LAP fotoinitiator i 100 pi DI vand ([LAP] = 39 mg / ml) til fremstilling fotoinitiatoropløsning, der anvendes til polymerisation dråberne til hydrogelperler. Beskyttes mod lys.
- I et andet mikrocentrifugerør, tilsæt 132 ul deioniseret vand, 172 pi PEG-diacrylat, 12 pi LAP opløsning, og 85 pi HEPES buffer at gøre hydrogel dråbe opløsning.
- Overfør hydrogel dråbe løsning på det færdige kryogene rør fartøj.
BEMÆRK: Additiver til andre applikationer såsom nanokrystaller, magnetiske partikler eller biologiske molekyler kan være indbefattet inden for HEPES komponent. - Tilslut slangen af kryogene rør fartøjet til en kontrollerbar trykkilde og tilslut PEEK slangen til apparatet reagens indløb.
- Forbered 10 ml let mineralolie med 2% vol / vol ionisk overfladeaktivt middel (f.eks Span 80) og 0,05% EM90 for oliedråbeemulsion. Filter ved anvendelse af en 0,22 um sprøjtefilter og lasten 1 ml i en anden kryogen rør fartøj.
- Indsæt PEEK slangen ved udløbet indretning til opsamling af dråber.
- Fjern luft bubbles fra enheden ved at lægge pres olie, vand eller PEG-blandingen indløb (4 psi driftstryk). Tænd alle ventiler. Sekventielt slukke hver ventil i en fluidvej efter 1 min eller indtil luftbobler har trængte gennem PDMS-enheden. For eksempel, at de-boble sildeben blandere, tænde ventiler Inlet 1, Mix 1 ud, og Mix affald. Så trykket Inlet 1, Bland 1 ud, og Mix Affald indtil alle bobler er væk.
- Når enheden er repressurized efter afgasning, trykløst Ro1 olie ventil og indstillet olietryk til 10 psi.
- Set PEG-blandingen tryk til 9 psi, depressure opstrøms ventiler (Inlet 1, Drops 1), og juster efter behov for at fremstille dråber af den ønskede størrelse. Dråbestørrelsen kan bestemmes via mikroskopi ved hjælp af et kamera med 50 fps eller højere.
- Når dråberne har stabiliseret, placere en 5 mm plet fra en lyskilde UV (fx en UV-plet hærdningssystem med flydende lysleder (LLG) eller en fokuseret UV LED) over polymerisation region af device og anvende 100 mW / cm2 UV (365 nm) fra UV-kilden.
- Presse perle si ventil til at se polymeriserede perler indsamle og sikre, at dråber har hærdet i perler. Juster LLG som nødvendigt for at opnå fuld polymerisation.
- Tag trykket perle sigte ventil og indsamle perler ind rør gennem udløbet PEEK slangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her udviser vi fremstillingen af ventilsækken, variabel højde flerlags mikrofluide forme ved at gøre apparater, som kan generere poly ethylenglycol (PEG) hydrogelperler fra dråberne (Figur 2). En oversigt over det komplette fremstillingsprocessen indgår i figur 3. Brug designelementer fra tidligere arbejde, perlen synthesizer beskæftiger 4 højder i sin flow lag, herunder (1) afrundet AZ50 XT ventiler til laminar flow modulation (55 um) (2) flow lave kanaler til indføring af reagenser ved højere modstand (55 um) (3) flow høje kanaler til at lede strømning ved lavere modstand til udløbene og blandemaskiner (85 um), og (4) en sildeben advektion blander (125 um) til blanding af PEG og tværbinder til en homogen opløsning (figur 4A og 4B). En tabel over designparametre og foreslog design begrænsninger anvendes i konstruere dettedesign er medtaget i tabel 1. Design filer og maske overføre filer er inkluderet i Materials tabel.
Denne protokol demonstrerer afrunding flow ventiler og konstruere flere højder på samme flow wafer via tandem fotolitografiske trin uden udvikling mellem hvert trin (tabel 2). En typisk post-reflow ventil afrunding profil fra et profilometer og stereoskop billeder af vore ventiler post-reflow er vist i figurerne 5A og 5B. Resulterende målte fabrikation højder fra vores multi-højde fotolitografi er anført i tabel 3. Heights blev målt ved 10 steder pr hvert lag på tværs af alle enheder i en enkelt flow wafer, vurderer både enhed-til-enhed og på tværs af wafer variation. Alle funktioner observeret <2% CV på tværs af skiven. Producent fotoresistbelagte datablade tyder typiske højdevariationer af ± 5% ved beregningen af flere lag funktioner, så bør tages denne tolerance i betragtning, hvis denne protokol er justeret for et andet design.
Som med enhver produktionsprocessen, kan fejl resultere i hvert trin, hvis fabrikation parametre såsom centrifugeringshastighed eller eksponering ikke er optimeret til det ønskede mønster højde og geometri. Mange ressourcer er tilgængelige til fejlfinding korrekt eksponering og udvikling gange, herunder en hjemmeside vores anlæg fastholder 27. Afvigelser fra foreslåede bløde og hårde bage tider, temperaturer og rampe priserne kan generere revner, bobler eller ufuldstændige funktioner. Derudover rehydrering af AZ50 XT positiv fotoresist før eksponering er kritisk. Vafler uden ordentlig rehydrering kan forekomme revnet eller indeholder bobler inden ventilen områder. Hvis dette sker, ved hjælp af en 'våd boks "(en lukket kasse med en skål indeholdende deioniseret vand) til at huse wafers for overnight rehydrering kan hjælpe. Kortere rehydrering gange (~ 5-6 timer) kan anvendes til AZ50 XT funktioner under 50 um med lignende resultater, men højere funktioner kræver indlæggelse rehydrering at reducere risikoen for funktionen tab under eksponering og udvikling. Nyere positiv modstå alternativer (f.eks AZ40XT) kan eliminere behovet for overnight rehydrering; Vi har dog ikke testet disse formuleringer.
Som en proof-of-concept, blev PEG-diacrylat hydrogel dråber produceret fra perle synthesizer enhed (figur 6A). Figur 5C og 5D viser repræsentative billeder af ventil drift og lukning på enheden, når tryk og trykket ventiler. Fælles fejl modes for ventil tryksætning nævnes: anvendelse af utilstrækkeligt tryk (ventiler vil ikke fuldt lukke, hvilket kan kontrolleres ved strømmende mad farvestof), indløb slange indsættelse (flow vil blive hæmmet, hvisslanger eller metalstifter skubbes ned for langt og enheden delaminering kan resultere), og inkorporering af støv eller fibre under fremstillingsprocessen (kanaler kan okkluderet eller indretningen kan delaminere). For at fejlfinding af disse fejl tilstande, skal brugerne opretholde renrumsforhold under fabrikation og systematisk teste hver ventil før man går videre til en enhed køre. Hvis enheden delaminering præsenterer som et fælles problem i forsøg, kan dette afhjælpes ved enten kørende enheder på lavere tryk (<15 psi) eller reducere silanisering gange.
Figur 6A viser perlen synthesizer enheden i drift producerer hydrogel dråber i en olieemulsion ved T-krydset dråbe generator og figur 6B viser perler fanget af on-chip sigte ventil. Hvis polymerisering er ikke lykkes, vil perler passere gennem en sigte ventil. Hvis dette sker, kan UV-kilde intensitet og højde fra enheden blive Mod ceret for at forbedre polymerisationen. Hydrogelperler blev produceret ved strømningshastigheder på 10 psi (olie) og 9 psi (reagensblanding) under anvendelse ~ 100 mW / cm2 magt over en polymerisation område 5 mm i diameter (figur 6C og 6D). Resulterende perler målt 52,6 ± 1,6 um (gennemsnit ± std). Størrelser blev analyseret for 2.992 perler ved hjælp af en Hough transformation (Matlab) i lyse felt billeder (figur 6C og 6D) med en pålagt størrelse filter på ± 3 std (28 outliers, 0,94% af perler). Hele vores hardware setup for dråbe produktion er vist i figur 7.
Tabel 2: Multi-Step Fotolitografi parametre. En tabel format alle fotolitografi trin med gældende parametre, herunder centrifugeringshastighed, bløde bage gange, eksponering energier og hårde bage tider. 2.xlsx "target =" _ blank "> Klik her for at se denne tabel. (Højreklik for at downloade.)
| Flow Layer Feature | Feature Højde |
| Afrundede Ventiler (Flow runden) | 54,43 um (1,05 um std., 1,9% CV) |
| Flow Kanaler (Flow Lav) | 84.22 um (0,91 um std., 1,1% CV) |
| Flow Kanaler (Flow Høj) | 54,10 um (1,24 um std., 2,3% CV) | Sildeben Grooves (Mixer) | 124,19 um (1,89 um std., 1,5% CV) |
Tabel 3: profilometerresultaterne Heights Post-Fabrication. Samlede funktion højde efter fremstilling for hver af de fremstillede lag via flere trin fotolitografi.
Figur 2: Oversigt over produktionsprocessen. En skematisk angivelse trin involveret i flerlags indretningsfremstilling fra design til testindretningen. Klik her for at se en større version af dette tal.
5276 / 55276fig3.jpg "/>
Figur 3: Skematisk af multi-trins fotolitografi. Oversigt over ventil afrunding og variabel højde funktionen fabrikation i fotolitografi til oprettelse af en flerlaget mikrofluidapparatet. Inkluderet her er trin for fremstilling af perlen synthesizer enhed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Bead Synthesizer Device Design og billeder. (A) CAD design af vulsten Synthesizer enhed med lag angivet med forskellige farver. (B) Billede af PDMS flerlagede Bead Synthesizer enhed. Kontrol linjer i orange, flow kanaler vises i blå og grøn.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Valve profiler og billeder. (A) Repræsentant ventil højde profil som vurderet af en profilometer. (B) Repræsentative billeder af ventiler og omgivende kanaler i silicium molding mester flow wafer. (C, D) Billeder af endelige ventil operation på flerlagede PDMS-enheden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Produktion af PEG-diacrylat hydrogel dråber. (A) Billede af hydrogel dråbe production ved T-krydset dråbe generator. (B) Billede af perler post-polymerisation fanget på sigten ventilen, når ventilen er under tryk. (C) Lysfelt billede af hydrogelperler produceret i vulsten synthesizer (4X). (D) størrelsesfordelingen af hydrogelperler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Enhed operation setup. Billede med anmærkning af al hardware, der kræves for enhedens funktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde demonstrerer en komplet multi-trins fotolitografi protokol for en flerlaget mikrofluidanordning med ventiler og variabel højde geometri, der kan indstilles til enhver applikation med enkle ændringer fabrikation parametre baseret på vores online-værktøj 26 og producentens anvisninger 25. Denne protokol er beregnet til at afmystificere flerlagede fotolitografi for forskere, der ønsker at konstruere mikrofluidenheder ud over enkle, passive én-lags forme.
Flerlags mikrofluidenheder muliggøre udøvelse af avanceret funktionalitet i en enkelt blød polymer anordning til »lab på chip 'applikationer fra enkelt celle analyse med højt gennemløb biokemiske assays 1. Perlen synthesizer enhed konstrueret her demonstrerer flere højder med et enkelt flow lag og begge fuldt forsegles og si ventil geometrier til at producere hydrogel dråber at Cen polymeriseres til polymerperler. Tilstedeværelsen af ventiler giver mulighed for automatiseret, programmerbar kontrol over chip-funktion, der let kan implementeres med et hvilket som helst sprog scripting (dvs. MATLAB, LABVIEW, eller Python), grænseflader med en lab flow kontrol moduler (dvs. sprøjtepumper og / eller trykregulatorer ). I denne demonstration, custom MATLAB software (kode, med reference 28) kommunikerer med Modbus-kontrollerede magnetventil arrays i en brugerdefineret pneumatisk opsætning 28 og en MFCS flow kontrolsystem at presse væske på enheden, men mange andre muligheder for flow kontrol er kommercielt ledig. Design og yderligere forslag er medtaget for at hjælpe med at maksimere succes for første gang mikrofluide ingeniører.
De fremstillingstrin vist her skulle vise sig generelt tilpasses til en bred vifte af fotolitografisk mønster for mikrofluidenheder. I et af de skridt (Flow High), 30um funktioner er blevet tilføjet til den nedre fotoresistlaget (Flow Low, 55 um) for at skabe en sammensat højde på 85 um. Dette trin kan anvendes til at fremstille tykke funktioner uden behov for mere viskose fotoresister (som er mere vanskeligt at arbejde med). I et andet trin (Sildeben), har funktioner blevet fremstillet oven på en tidligere tværbundet kanal, skaber mønstrede riller på bunden af en mikrokanal når replika støbt ind PDMS. Dette trin kan tilpasses af brugerne til at skabe komplekse geometrier, herunder godt inden brønde arkitekturer, hvis det ønskes.
Succesen af denne fremstillingsproces påvises ved hjælp perlen synthesizer enhed til at producere polymerkugler fra PEG-diacrylat dråber. Exploring forskellige strømningshastigheder tryk kan modulere droplet regime at fremstille perler af forskellig størrelse. Endvidere kan additiver inkluderes let inden polymerblandingen. Disse hydrogel perler kan bruges til mange forskellige formål, herunderspektral kodning gennem indarbejdelse af fluorescerende eller selvlysende fosfor, drug delivery, eller cellulære assays via overfladefunktionalisering.
Hvis denne protokol vedtages at konstruere en anden mikrofluidanordning end perlen synthesizer præsenteres her, skal det bemærkes, visse trin er afgørende for at opnå en høj chance for succes på den første fabrikation forsøg. Vi og andre har iagttaget, at en optimering blød bage temperatur, varighed, og rampe sats er kritisk for at forhindre tilbageholdelse af resterende opløsningsmiddel i resistfilmen via skorpedannelse (hvilket kan føre til bobling af fanget nitrogengas under eksponeringen) 29. Desuden en overnatning rehydrering trin forbedrer reproducerbarheden af eksponeringstider kræves for tykke AZ50 XT lag og reducerer rumlig variation i satserne for udvikling i hele wafer. Endelig en lang (14-15 timer) bogføre eksponering bage med en langsom rampe runder rektangulære fotoresist funktioner til at danne valves uden at deformere ventil geometrier til en bred vifte af testede fotoresist tykkelser.
Flere af de procedurer, der præsenteres her for opdigte lag fra negativ fotoresist omfatter små forskelle fra producentens anvisninger. Vi foreslår en tre-trins blød bage proces, der bevæger wafers mellem varmeplader indstillet på 65 ° C, 95 ° C, og 65 ° C. Vi har fundet, at en gradvis opvarmning af vafler reducerer forekomsten af fejl under eksponering som følge af brud på gasbobler fanget i fotoresist via dannelsen af en "crust" under blød bagning. Omvendt kan gradvis afkøling af wafers efter blød bagning reducere fotoresist revnedannelse. Endelig har vi fundet, at forøgelse fotoresist relaksationstider til ~ 20 min reducerer små variationer i modstå højden over waferen.
På grund af fleksibiliteten i dette fabrikation protokol, forventer vi, at det vil have bred anvendelighed til forskellige enheder på tværs af disciplines. Mens alternativer såsom 3D-print, glas ætsning og prægning også kan opnå mikrofluid fabrikation, kan litografisk mønster opnå mere komplekse funktionalitet, såsom ventiler, at andre metoder endnu ikke har opnået på skalaen. Den største begrænsning af denne protokol er design-til-test tid, som tager ~ 3 dage (primært på grund af nødvendige skridt for at fabrikere afrundede ventiler).
Vi håber, at åbne formidling af protokoller i mikrofluidik, især vedrørende komplicerede fotolitografiske trin, vil tilskynde fortsatte innovation på området, og at dette proof-of-concept demonstration vil støtte i at hjælpe brugere fejlfinding fabrikation problemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Mylar Transparency Masks, 5" | FineLine Plotting | ||
| 5" Quartz Plates | United Silica | Custom | |
| 4" Silicon Wafers, Test Grade | University Wafer | 452 | |
| SU8 2005, 2025, 2050 photoresist | Microchem | Y111045, Y111069, Y111072 | |
| Az50XT | Integrated Micromaterials | AZ50XT-Q | |
| SU8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| AZ400K 1:3 Developer | Integrated Micromaterials | AZ400K1:3-CS | |
| Pyrex 150 mm glass dish | Sigma-Aldrich | CLS3140150-1EA | |
| Wafer Petri Dishes, 150 mm | VWR | 25384-326 | |
| Wafer Tweezers | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 78410-2W | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| 2" x 3" glass slides | Thomas Scientific | 6686K20 | |
| RTV 615 elastomeric base and curing agent PDMS set | Momentive | RTV615-1P | |
| Tygon Tubing, 0.02" O.D. | Fischer Scientific | 14-171-284 | |
| Capillary PEEK tubing, 510 μm OD, 125 μm ID | Zeus | Custom | 360 μm PEEK is readily available by Idex (catalog number: 1571) |
| Cyro 4 ml tube | Greiner Bio-One | 127279 | |
| Epoxy, 30 min | Permatex | 84107 | |
| Metal Pins, 0.025" OD, .013" ID | New England Small Tube | NE-1310-02 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate, Mn 700 | Sigma-Aldrich | 455008-100ML | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate photoinitator | Tokyo Chemical Industry Co. | L0290 | We typically synthesize LAP in-house. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| Light mineral oil | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Span-80 | Sigma-Aldrich | 85548 | |
| ABIL EM 90 | UPI Chem | 420095 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Equivalent equiptment or homebuilt setups will work equally as well | ||
| Mask Aligner | Karl Suss | MA6 | |
| Profilometer | KLA-Tencor | Alpha-Step D500 | |
| Spin Coater | Laurell Technologies | WS-650-23 | Any spincoater can be used that accepts 100 mm wafers |
| Vacuum Dessicator, Bell-Jar Style | Bel-Art | 420100000 | |
| Oven | Cole-Palmer | WU-52120-02 | |
| UV Spot Curing System with 3 mm LLG option | Dymax | 41015 | UV LEDs, Xenon Arc Lamps, or other UV sources of the same intensity work equally as well |
| MFCS Microfluidic Fluid Control System | Fluidgent | MFCS-EZ | Syringe pumps, custom pneumatics or other control systems can also be used |
| Automated control scripting | MATLAB | ||
| Hotplate | Tory Pines Scientific | HP30 | Any hotplate with uniform heating (i.e., aluminum or ceramic plates) will suffice. |
References
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E.
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale. Rev.Mod. Phys. 77 (3), (2005).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), (2006).
- Kalisky, T., Blainey, P., Quake, S. R. Genomic Analysis at the Single-Cell Level. Ann. Rev. of Genetics. 45 (1), (2011).
- Finkel, N. H., Lou, X., Wang, C., He, L. Peer Reviewed: Barcoding the Microworld. Anal. Chem. 76 (19), (2004).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. in Chem. Bio. 16 (3-4), (2012).
- White, A. K., Heyries, K. A., Doolin, C., VanInsberghe, M., Hansen, C. L. High-Throughput Microfluidic Single-Cell Digital Polymerase Chain Reaction. Anal. Chem. 85 (15), (2013).
- Hansen, C. L., Classen, S., Berger, J. M., Quake, S. R. A Microfluidic Device for Kinetic Optimization of Protein Crystallization and In Situ Structure Determination. J. Am. Chem. Soc. 128 (10), (2006).
- Maerkl, S. J., Quake, S. R. A Systems Approach to Measuring the Binding Energy Landscapes of Transcription Factors. Science. 315 (5809), (2007).
- Fordyce, P. M., Gerber, D., et al. De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis. Nat. Biotech. 28 (9), (2010).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat. Biotech. 26 (12), (2008).
- Kovarik, M. L., Gach, P. C., Ornoff, D. M., Wang, Y. Micro total analysis systems for cell biology and biochemical assays. Anal. Chem. , (2011).
- Stroock, A. D., Dertinger, S. K. W., Ajdari, A., Mezić, I., Stone, H. A., Whitesides, G. M.
- Unger, M. A., Chou, H. -P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic Large-Scale Integration. Science. 298 (5593), (2002).
- Li, N., Sip, C., Folch, A. Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays. JoVE. (8), e296 (2007).
- Kim, P., et al. Soft lithography for microfluidics: a review. Biochip. J. 2 (1), 1-11 (2008).
- Studer, V., Hang, G., Pandolfi, A., Ortiz, M., Anderson, W. F., Quake, S. R. Scaling properties of a low-actuation pressure microfluidic valve. J. Appl. Phys. 95 (1), 393-398 (2004).
- Kartalov, E. P., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Anderson, W. F. Experimentally validated quantitative linear model for the device physics of elastomeric microfluidic valves. J. Appl. Phys. 101 (6), 064505 (2007).
- Gerver, R. E., Gómez-Sjöberg, R., et al. Programmable microfluidic synthesis of spectrally encoded microspheres. Lab. Chip. 12 (22), 4716-4723 (2012).
- Fordyce, P. M., Diaz-Botia, C. A., DeRisi, J. L., Gómez-Sjöberg, R. Systematic characterization of feature dimensions and closing pressures for microfluidic valves produced via photoresist reflow. Lab. Chip. 12 (21), 4287-4295 (2012).
- Li, C. -W., Cheung, C. N., Yang, J., Tzang, C. H., Yang, M. PDMS-based microfluidic device with multi-height structures fabricated by single-step photolithography using printed circuit board as masters. The Analyst. 128 (9), 1137-1142 (2003).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab. Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. JMM. 16 (2), 276 (2006).
- Microchem. SU-8 2000 Series Data Sheet. , Microchem. Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2025thru2075Ver4.pdf (2016).
- Fordyce, P. M., DeRisi, J. L., Gómez-Sjöberg, R. AZ50 XT Feature Height Calculator. , Available from: http://derisilab.ucsf.edu/software/AZ50XT/AZ50XTToolInput.html (2016).
- Foundry, S. M. Stanford Microfluidics Foundry Website. , Available from: > http://web.stanford.edu/group/foundry/Microfluidic%20valve%20technology.html (2016).
- Sjöberg, R. Rafael's Microfluidics Site. , Available from: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers (2016).
- Wanat, S., Plass, R., Sison, E., Zhuang, H., Lu, P. -H. Optimized Thick Film Processing for Bumping Layers. Proc. SPIE. , 1281-1288 (2003).
