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Neuroscience

मापने और माले में फेरबदल संभोग ड्राइव Published: February 15, 2017 doi: 10.3791/55291
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 3
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख एक व्यवहार परख पुरुष संभोग ड्राइव ड्रोसोफिला में melanogaste प्रेरणा का अध्ययन करने के लिए अनुसंधान का उपयोग करता है वर्णन करता है। इस विधि का प्रयोग, शोधकर्ताओं, आनुवंशिक आणविक और सेलुलर तंत्र है कि इस प्रेरणा आबाद उजागर करने के लिए उन्नत मक्खी neurogenetic तकनीकों का उपयोग कर सकते हैं।

Abstract

जांच के दशकों के बावजूद, प्रेरक राज्यों के neuronal और आणविक ठिकानों रहस्यमय बना हुआ है। हमने हाल ही में पुरुष ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (ड्रोसोफिला) के संभोग ड्राइव का उपयोग प्रेरणा का गहराई से जांच की, जिसके लिए तरीकों यहाँ विस्तार हम के लिए एक उपन्यास, न्यूनीकारक, और स्केलेबल प्रणाली विकसित की है। व्यवहार प्रतिमान लग रहा है कि पुरुष संभोग ड्राइव दोहराया copulations के पाठ्यक्रम पर प्रजनन क्षमता के साथ कम हो जाती है और अधिक से अधिक ठीक हो जाए ~ 3 डी पर केंद्रित है। इस प्रणाली में, शक्तिशाली उपकरण neurogenetic मक्खी में उपलब्ध आनुवंशिक पहुंच और ख्यात तारों यौन व्यवहार के लिए उपलब्ध आरेख के साथ एकाग्र। इस अभिसरण तेजी से अलगाव और विशिष्ट प्रेरक कार्यों के साथ छोटे neuronal आबादी से पूछताछ की अनुमति देता है। यहाँ विस्तार डिजाइन और तृप्ति परख है कि मापने और पुरुष मक्खी में प्रेमालाप प्रेरणा को बदलने के लिए प्रयोग किया जाता है के निष्पादन हम। इस का प्रयोगपरख, हम भी दिखाना है कि कम पुरुष संभोग ड्राइव डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स उत्तेजक द्वारा दूर किया जा सकता है। तृप्ति परख, सरल, सस्ती, और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव को मजबूत है। हम तृप्ति परख प्रेरक राज्यों के तंत्रिका जीव विज्ञान में कई नए अंतर्दृष्टि उत्पन्न करने की उम्मीद है।

Introduction

, भ्रूण के विकास के 2, circadian लय 3, और विकास और तंत्रिका तंत्र 4, 5, 6 की तारों के सिद्धांतों ड्रोसोफिला में काम जीन 1 की प्रकृति सहित कई जैविक घटना में गहरी अंतर्दृष्टि और अग्रणी प्रदान की गई है। प्रेरणा शायद प्रणाली है कि इस प्रकार अब तक अध्ययन किया गया है पर सीमाओं की वजह से अब तक कम अच्छी तरह से इन घटनाओं से समझ में आ बनी हुई है। मक्खी में प्रेरणा मुख्य रूप से खिला मुक्केबाज़ी और बहिःकंकाल जो वसा के जमाव के प्रकट संकेत precludes प्रति उनकी गायब छोटे भोजन का सेवन करने के कारण भूख है, जो कई चुनौतियां प्रस्तुत करने के संदर्भ में अध्ययन किया है। नतीजतन, वहाँ उड़ान भरने में प्रेरणा का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रणालियों का विस्तार करने की जरूरत है।

हम में संभोग ड्राइव के अध्ययन के लिए एक व्यवहार ढांचे का वर्णनड्रोसोफिला। इस प्रणाली मक्खी के रूप में अच्छी तरह से पहुंच 7, 8, 9, 10, 11, 12 और उसके यौन dimorphic circuitry 8, 13 के ख्यात connectome में neurogenetic उपकरणों का लाभ लेता है। इसके अलावा, के ज्यादा सहज 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 और सीखा 22, 23, 24 संवेदी मोटर circuitry को नियंत्रित करने के प्रेम प्रसंग से बाहर विस्तार से काम किया गया है, एक दुर्लभ अवसर प्रदानसटीक सर्किट नोड जिस पर प्रेरणा impinges पता लगाने के लिए। हमने हाल ही में खबर दी है कि, मक्खी में, मनुष्य के रूप में, डोपामाइन का स्तर संभोग ड्राइव 25, 26, 27 के लिए केंद्रीय हैं। हम assays का उपयोग हम यहाँ वर्णन 25 इस संरक्षित घटना का विश्लेषण करती है प्रासंगिक डोपामाइन उत्पादक और मक्खी में न्यूरॉन्स प्राप्त करने, को सुविधाजनक बनाने के विस्तृत molecular- और सर्किट स्तर के लिए आनुवंशिक पहुँच प्राप्त की है।

हम झांग एट अल में व्यवहार assays में जोड़ें। 25 एक नए फ्लैट व्यवहार अखाड़ा कि वीडियो स्कोरिंग है, जो हम एक 2-आयामी (2 डी) तृप्ति परख, पिछले तरीकों पर एक महत्वपूर्ण सुधार कॉल की अनुमति देता है। नतीजतन, नई परख अधिक स्केलेबल और मात्रात्मक, और जीन और न्यूरॉन्स प्रेरणा में शामिल की आनुवंशिक स्क्रीन के लिए इसलिए अधिक उपयुक्त है। हम प्रेम प्रसंग assays और neuroge के साथ मिलकर इस नए परख का उपयोग करें,netic जोड़तोड़, प्रदर्शित करने के लिए उपाय और मक्खी में संभोग ड्राइव को बदलने के लिए कैसे।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल की तैयारी (धारा 1 - 3) का वर्णन है, निष्पादन (धारा 4), और विश्लेषण 2-डी तृप्ति assays के (धारा 4)। फिर, एक उदाहरण के रूप में डोपामिनर्जिक उत्तेजना का उपयोग कर, धारा 5 कैसे अतिकामुकता प्रेरित करने के लिए 2-डी तृप्ति assays के साथ thermogenetic उत्तेजना गठबंधन को दर्शाता है। धारा 6 2-डी तृप्ति assays के परिणामों की पुष्टि करने के लिए 3 तरीके का वर्णन है। अंत में, धारा 7 से पता चलता है कि कैसे पुरुष मक्खियों में संभोग ड्राइव की वसूली को मापने के लिए।

1. 8 और 32-कक्ष व्यवहार एरेनास Fabricating

नोट: प्रत्येक व्यवहार के मैदान लेजर कट प्लास्टिक चार कोनों (चित्रा 1 ए) में से प्रत्येक में हेक्स शिकंजा और अंगूठे नट द्वारा एक साथ आयोजित की चादरों की कई परतें होती हैं।

  1. अखाड़ा की परतों बनाना। प्रत्येक परत एक लेजर कटर का उपयोग उचित आकार के लिए एक्रिलिक प्लास्टिक की चादरों में कटौती करने के लिए बनाना (देखें चित्रा 1 बी, उत्पादों के लिए 1 सी)।
    नोट: कई शोध institutioएनएस उनकी मशीन की दुकानों या निर्माता रिक्त स्थान में लेजर कटर की है। संस्था के एक लेजर कटर लिए उपयोग किया है, तो निम्न चरणों के साथ जारी है। यदि नहीं, तो 1.2 चरण बजाय निर्देश का पालन करें।
    1. प्रत्येक परत के लिए, लेजर कटर के सॉफ्टवेयर में डिजाइन पैटर्न खुला।
      नोट: डिजाइन उचित नाम पीडीएफ फाइलों में पाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 8-चैंबर अखाड़ा - परत 2 - Doors.pdf) पूरक सामग्री 1. इस फ़ाइल में भी प्लास्टिक के प्रकार के लिए एनोटेशन शामिल है में इस्तेमाल किया जा करने के लिए (जैसे, 1 / 8 इंच (यानी 3.175 मिमी) स्पष्ट एक्रिलिक)। प्रत्येक परत की सटीक मोटाई महत्वपूर्ण नहीं है। मुख्य आवश्यकता 0.12 इंच (3 मिमी) या मुफ्त ऊर्ध्वाधर अंतरिक्ष के अधिक कक्षों में की अनुमति है।
    2. प्रकार और प्लास्टिक की मोटाई के लिए लेजर सेटिंग्स (बिजली, ध्यान, आदि) को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा। लेजर कटर बिस्तर में प्लास्टिक की जगह और लेजर कटर चलाते हैं।
      नोट: ये सेटिंग्स व्यापक रूप से लेजर Cutte के आधार पर अलग अलग होंगेआर मॉडल और उसके लेजर की ताकत। अतीत के अनुभव पर या स्क्रैप प्लास्टिक पर परीक्षण कटौती बनाकर आधार पर उपयुक्त सेटिंग्स का पता लगाएं। गहरी हेक्सागोनल नक्काशी डिजाइन हेक्स पेंच सिर अवकाश में शामिल किए गए हैं। यह सुविधा अंगूठे पागल का एक हाथ कस के लिए अनुमति देता है और एरेनास (पेंच सिर फैला हुआ बिना) बेंच पर फ्लैट आराम करने के लिए अनुमति देता है। फिर भी, गहरे नक्काशी बनाने अक्सर प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, और समय लेने वाली है, एक लेजर कटर का उपयोग कर रहा है। यह कदम वैकल्पिक है और व्यवहार के परिणाम को प्रभावित किए बिना छोड़ दिया जा सकता है।
    3. जब दरवाजा फ्रेम (परत 2, चित्रा 1 ए) काटने, भी चैम्बर संख्या डिजाइन में शामिल उत्कीर्णन (चित्रा 1 बी, 1 सी के रूप में) के लिए उचित लेजर सेटिंग्स का उपयोग करें।
  2. एक ऑनलाइन लेजर काटने fabricator साथ एक आदेश जगह। (जैसे, 1/8 इंच (यानी 3.175 मिमी) clea 8 और / या 32-कक्ष के मैदान के लिए सभी पीडीएफ डिजाइन फ़ाइलों को अपलोड करें और सामग्री के प्रकार को निर्दिष्टआर एक्रिलिक) फ़ाइलों में एनोटेशन पर आधारित है। परिणाम आंकड़े 1 बी (8-कक्ष के मैदान) और 1 सी (32-कक्ष के मैदान) के रूप में दिखाई देगा।
  3. चार हेक्स शिकंजा और चार अंगूठे पागल का उपयोग संरेखित और एक साथ प्लास्टिक परतों (चित्रा 1 ए) धारण करने के लिए एरेनास इकट्ठा करो। एरेनास चित्रा -1, 1E (8-कक्ष) और चित्रा 1F, 1G (32-कक्ष) में के रूप में दिखाई देगा।
    नोट: खाद्य दीवार (चित्रा 1 ए में परत 4) केवल 2-डी तृप्ति assays के लिए प्रयोग किया जाता है और 32-कक्ष एरेनास, जो प्रेमालाप assays में उपयोग किया जाता है में छोड़ा जाता है।

2. 2-डी तृप्ति परख के लिए भोजन तैयार

नोट: 2-डी तृप्ति परख तक फैला है क्योंकि 4.5 ज, उड़ान भरने के लिए खाद्य पोषण और पानी उपलब्ध कराने के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, लेकिन पारंपरिक cornmeal-अगर भोजन उड़ान भरने के लिए ही सीमित नहीं है।

  1. आंशिक रूप से परतों के साथ 2-डी तृप्ति के मैदान (8-कक्ष) इकट्ठा 3 - 6(परत कार्य के लिए चित्रा 1 ए देखें) और अंगूठे नट और हेक्स शिकंजा के साथ यह कस लें।
  2. ताजा मक्खी भोजन एक साफ, माइक्रोवेव सुरक्षित बोतल में रखें। अभी पर्याप्त पानी की बोतल (2A चित्रा) के नीचे की सतह को कवर करने के लिए जोड़ें।
  3. 45 S - 30 के लिए उच्च पर माइक्रोवेव खाना। प्रगति की जाँच करें और पिघल जब तक (चित्रा 2 बी) हर 15 एस हलचल। सावधान! भोजन उड़ना आसानी से फोड़े।
  4. एक पा 1,000 μL विंदुक टिप (चित्रा -2) का उपयोग धीरे-धीरे हस्तांतरण करने के लिए ~ 1 एमएल प्रत्येक कक्ष (चित्रा 2 डी) में भोजन पिघल गए।
  5. भोजन पूरी तरह से क्षेत्र (चित्रा 2 एफ) कोडांतरण से पहले ~ 10 मिनट (चित्रा 2 ई) 4 डिग्री सेल्सियस पर resolidify करने की अनुमति दें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगों के लिए पूरा मैदान (धारा 4 देखें) या दुकान का प्रयोग करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस और पुन: उपयोग में बचे हुए भोजन की दुकान।

3. व्यवहार assays के लिए कुंवारी महिलाओं तैयारी

नोट: (- 160 एक पूर्ण व्यवहार के मैदान के लिए ~ 120) है कि मानक तरीकों का उपयोग कर एकत्र करने के लिए मुश्किल हो जाता है 2-डी तृप्ति assays कुंवारी महिला मक्खियों की बड़ी संख्या का उपयोग करें। यह खंड एक वैकल्पिक दृष्टिकोण वाई गुणसूत्र 28 है, जो प्रेम प्रसंग assays 25, 29 में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है पर एच एस छिपाई transgene का उपयोग कर का वर्णन है। सफेद आंखों कुंवारी महिलाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल शेयर जीनोटाइप w1118 (एक्स) / एच एस छुपाया (वाई) है + / + + / + (ब्लूमिंगटन शेयर नंबर 24638)।

  1. फ्लिप एक नई बोतल में एक बार 20 में मक्खियों - pupae का 50% eclosed है (उदाहरण के लिए चित्रा 3A देखें) और वहाँ पर्याप्त पुरुषों (5 - 10) कर रहे हैं शेयर प्रचार करने के लिए।
  2. हीट 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पानी से स्नान में मूल बोतल झटका पर्याप्त पुरुषों को मारने के लिए (चित्रा 3 बी) एच एस छिपाई को सक्रिय करें। गर्मी झटका के बाद, केवल महिलाओं इन बोतलों से eclose जाएगा और इसलिए जब तक कुंवारी ही रहेगीassays।
    नोट: सुनिश्चित करें कि बोतल के सभी पक्षों को समान रूप से गर्म किया जाता है (पानी की लाइन के लिए चित्रा 3A देखें) बनाओ। अप करने के लिए 2 घंटे के लिए इस समय का विस्तार करता है, तो 1 घंटे सभी पुरुषों euthanize करने के लिए पर्याप्त नहीं है।
  3. प्रयोगों से पहले के लिए कम से कम 3 डी एकत्र महिलाओं को अलग सुनिश्चित करना है कि वे काफी पुराने यौन ग्रहणशील 25, 29 हो रहे हैं।
    नोट: वाई गुणसूत्र-कम पुरुषों को कभी-कभी इस शेयर से उत्पन्न होती हैं। इन पुरुषों सफेद आँखें है और क्योंकि वे एच एस छिपाई ट्रांस्जीन शामिल नहीं है गर्मी सदमे से अप्रभावित रहे हैं। वे महिलाओं के 30 में ग्रहणशीलता को कम नहीं कर सकते, 31 शुक्राणु उत्पादन और इसलिए नहीं कर सकते।

4. प्रदर्शन और स्कोरिंग 2-डी तृप्ति Assays

नोट: यह पुरुष की उम्र उम्र के साथ संभोग ड्राइव परिवर्तन के रूप में मक्खियों को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल पुरुषों है कि 3 का उपयोग करता है - 4 घ वर्ष 25

  1. वांछित तापमान (जैसे, 23 डिग्री मानक के लिए सी, आर टी प्रयोगों) और आर्द्रता (> 30%) को इनक्यूबेटर सेट करें। आर्द्रता नियंत्रण के बिना इन्क्यूबेटरों, इनक्यूबेटर में पानी की एक कप छोड़ने के लिए पर्याप्त है।
  2. के लिए इनक्यूबेटर में 2-डी तृप्ति परख के मैदान की जगह ~ 30 मिनट के तापमान को संतुलित करने के लिए और प्रयोग के दौरान कक्षों में संक्षेपण को रोकने के लिए। घूर्णन दरवाजे खुले स्थान में होना चाहिए।
  3. अखाड़ा (चित्रा 4) के प्रत्येक कक्ष में 20 कुंवारी महिलाओं - 15 निकालना एक मक्खी Aspirator 32 का प्रयोग करें।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि महिलाओं और पुरुषों परख के रूप में एक ही दिन में anesthetized नहीं कर रहे हैं। हमारे अनुभव में, ऐसा करने से महिला ग्रहणशीलता और पुरुष संभोग के व्यवहार को प्रभावित कर सकता है।
  4. महाप्राण 1 प्रत्येक कक्ष में पुरुष।
  5. इनक्यूबेटर में भरी हुई अखाड़ा एक मानक उपभोक्ता camcorder (चित्रा 5) और 4.5 घंटे के लिए फिल्म के नीचे रखें।
  6. जब प्रत्येक पुरुष शुरू होने से उड़ान भरने और प्रत्येक संभोग (यानी संभोग) समाप्त हो जाती है टिप्पण द्वारा वीडियो स्कोर। यह कदम समय लेने वाली पहली बार में हो सकता है। अभ्यास के साथ, एक 5x गति या अधिक पर वीडियो स्कोर कर सकते हैं।
    नोट: चूंकि मक्खियों ~ 23 डिग्री सेल्सियस (उच्च तापमान पर छोटी अवधि) 29 ~ 20 मिनट के लिए दोस्त, एक-एक संभोग के पहले 15 मिनट के माध्यम से हवा में घूमना कर सकते हैं।
  7. सभी संभोग बार प्रवेश करने के बाद, प्रत्येक मक्खी के लिए matings की संख्या राशि (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  8. एक ethogram उत्पन्न करने के लिए प्रदान की कोड का उपयोग करें। कोड, निर्देश, और उदाहरण के डेटा के लिए पूरक सामग्री 2 देखें।
  9. उन्हें हटाने से पहले मक्खियों anesthetize करने के लिए सीओ 2 या ठंडे तापमान का प्रयोग करें।

5. 2-डी तृप्ति assays में तृप्ति रिवर्स करने के लिए Thermogenetic हेरफेर का उपयोग कर

नोट: इस प्रोटोकॉल परीक्षण एक परिभाषित न्यूरोनल जनसंख्या का thermogenetic उत्तेजना तृप्ति को दूर कर सकते है। प्रयोगात्मक FLIतों न्यूरॉन्स (यूएएस TRPA1) की आबादी में परिभाषित गर्मी के प्रति संवेदनशील केशन चैनल TRPA1 व्यक्त करते हैं। नीचे दिए गए चरणों डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (वें Gal4) है, जो संभोग ड्राइव 25 को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है की उत्तेजना के लिए लागू होते हैं। ये कदम अन्य आबादी है कि संभोग के ड्राइव को बढ़ावा देने की खोज करने के लिए अन्य न्यूरोनल चालकों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. (जैसे, 23 डिग्री सेल्सियस से 28.5 डिग्री सेल्सियस तक) एक पूर्ण 4.5 एच 2-डी तृप्ति प्रयोग पूरा करने के बाद thermogenetically, तृप्त मक्खियों में संभोग के व्यवहार के लिए प्रेरित करने के लिए इनक्यूबेटर में तापमान में वृद्धि।
  2. बाद इनक्यूबेटर वांछित तापमान तक पहुँच जाता है, गर्मी उत्तेजना जारी है और 1 घंटे (प्रतिनिधि परिणाम देखें) के लिए पुरुषों की matings (यानी। Copulations) स्कोर।
    नोट: तापमान और उत्तेजना की लंबाई जीनोटाइप के आधार पर भिन्न हो सकते हैं तो यह इष्टतम स्थिति है कि न्यूरॉन्स की overstimulation रोकने जबकि अभी भी एक Robu उत्पादन की समस्याओं का निवारण करने के लिए आवश्यक हैसेंट फेनोटाइप।

6. तृप्ति सत्यापित करें को प्रेमालाप और हरकत का प्रयोग

नोट: इस धारा 3 के वैकल्पिक तरीकों कि 2-डी तृप्ति assays के परिणामों की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन है। वे हर परख के लिए आवश्यक नहीं हैं।

  1. तृप्ति को सत्यापित करने के प्रेमालाप assays का प्रयोग करें।
    1. महाप्राण एक पुरुष और एक प्रेम प्रसंग के मैदान में 32 कक्षों में से प्रत्येक में एक कुंवारी महिला।
    2. एक मानक उपभोक्ता camcorder का उपयोग कर ~ के लिए 20 मिनट मक्खियों फिल्म।
    3. स्कोर प्रेमालाप सूचकांक (सीआई) प्रेमालाप 25 यों के लिए; इस प्रेमालाप व्यवहार प्रदर्शन खर्च (, गायन, निम्नलिखित आदि।) के समय और एक 5 मिनट खिड़की पर (यानी संभोग) संभोग के अंश है। इस विंडो प्रेमालाप व्यवहार का पहला उदाहरण से शुरू होता है। एक पुरुष मक्खी पहले 15 मिनट में प्रेम प्रसंग शुरू नहीं करता है, तो इसकी सीआई 0. भोले गुम्मट मक्खियों एक सीआई 0.9 से बड़ा दिखाना चाहिए, जबकि एक पूरी तरह से तृप्त मक्खी एक सीआई ख होना चाहिए0.2 Elow। अन्य प्रेमालाप के उपाय भी, 33, 23 पर विचार किया जा सकता है।
  2. 2-डी तृप्ति assays में स्कोरिंग प्रेमालाप
    1. समय की राशि है कि एक पुरुष मक्खी को दावत खर्च करता है, स्कोर 2-डी तृप्ति परख की एक समय अवधि (जैसे, पहले ज) से अधिक है। प्रेमालाप पुरुष किसी भी (गायन, निम्न, आदि) के अनुष्ठान के चरण का पालन करने के रूप में परिभाषित किया गया है। धारा 6.1.3 के विपरीत, इस कदम के समय पुरुष संभोग खर्च करता है शामिल नहीं है।
    2. कुल समय पुरुष एक ही समय अवधि में संभोग नहीं किया गया है (यानी मैथुन नहीं) से ऊपर फूट डालो प्रेम प्रसंग का समय है। (- 20 मिनट 60 मिनट) = 0.375 उदाहरण के लिए, अगर एक पुरुष पहले घंटे से अधिक 20 मिनट के लिए 15 मिनट के लिए अदालतों और साथियों के लिए उड़ान भरने, अनुपात 15 मिनट / है। अनुपात के रूप में प्रतिनिधि परिणाम में "प्रेम प्रसंग में समय nonmating के अंश" दिखाया गया है।
  3. थकावट का मूल्यांकन करने के लिए हरकत परख का प्रयोग
    1. आंशिक रूप से 32- इकट्ठासभी भागों लेकिन इसके विपरीत चादर के साथ चैम्बर अखाड़ा।
    2. महाप्राण एक पुरुष मक्खी (कोई मादा मक्खियों) एक प्रेम प्रसंग के मैदान में 32 कक्षों में से प्रत्येक में।
    3. एक मानक उपभोक्ता camcorder का उपयोग कर ~ के लिए 10 मिनट मक्खियों फिल्म।
    4. ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html) में MTrack2 प्लगइन के साथ मक्खियों ट्रैक।

7. के बाद 2-डी तृप्ति परख संभोग ड्राइव उबरने

  1. धारा 4 में वर्णित के रूप में एक 2-डी तृप्ति परख प्रदर्शन, लेकिन aspirate पुरुष परख के अंत में बाहर मक्खियों।
  2. दिनों की वांछित संख्या के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर नर मक्खियों अलग।
  3. बरामद पुरुषों के साथ 2-डी तृप्ति परख प्रदर्शन और सिर्फ 1 घंटे (प्रतिनिधि परिणाम देखें) के लिए अपने matings (यानी copulations) स्कोर।

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Representative Results

ड्रोसोफिला संभोग ड्राइव को चिह्नित करने के लिए, 3 दिन पुरानी, गुम्मट केंटन एस पुरुषों 2-डी तृप्ति परख में परीक्षण किया गया। परख (4.5 ज) के दौरान, पुरुषों 4.8 ± 0.3 के औसत मेट (मतलब मतलब है, SEM के ± मानक त्रुटि) बार। Matings में पहले 2 एच (78%) (चित्रा 6A, 6B) ज्यादातर आरंभ और के रूप में परख की प्रगति (चित्रा 6A, 6B) लगातार कम हो जाते हैं। यह कमी संभोग भागीदारों की कमी (74% महिलाओं परख भर unmated रहने के) या शारीरिक थकान (चित्रा 6F) की वजह से नहीं है। बल्कि, इस आशय की संभावना परख के दौरान पुरुष के प्रेम प्रसंग में कमी से, 2.0 ± 0.7% करने के लिए समझाया गया है 42.6 ± 8.0% (मतलब ± SEM) (1 सेंट ज) से (मतलब ± SEM) (पिछले घंटा) nonmating समय की (चित्रा 6C)। प्रेम प्रसंग में यह गिरावट भी देखा जाता है जब पुरुषों के नए महिलाओं के साथ प्रेम प्रसंग assays में परीक्षण कर रहे हैं (चित्रा 6D, 6E) (चित्रा 6G, 6H) से पृथक किया गया है। ये परिणाम बताते हैं कि पुरुष मक्खियों में आंतरिक रूप से बनाए रखा संभोग ड्राइव 2-डी तृप्ति परख में तृप्त जा सकता है और समय के साथ ठीक हो सकता है।

2-डी तृप्ति परख भी आसानी से ड्रोसोफिला तंत्रिका जोड़तोड़ के साथ जोड़ा जा सकता है। हमने हाल ही में सूचना दी डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की thermogenetic उत्तेजना पराजयों कि तृप्त पुरुष में संभोग ड्राइव मक्खियों 25। 2-डी तृप्ति assays का उपयोग करना, हम पाते हैं कि डोपामिनर्जिक उत्तेजना (th> TRPA1, 28.5 डिग्री सेल्सियस) तृप्ति परख के अंत में दोनों प्रेमालाप (चित्रा 7A, 7, लाल) और शयन (चित्रा 7A, 7 बी, लाल) की वृद्धि हुई। उलट प्रभाव माता पिता का नियंत्रण जीनोटाइप (- 7, काले और भूरे रंग चित्रा 7A) के साथ नहीं मनाया जाता है। इन परिणामों के सभी हाल के एक अध्ययन के साथ संगत कर रहे हैं25 और सुझाव है कि 2-डी तृप्ति परख, सहायक assays (प्रेमालाप और हरकत) के साथ-साथ संभोग ड्राइव की आणविक और neuronal घटकों काटना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. डिजाइनिंग और कोडांतरण व्यवहार एरेनास। एक 8 चैम्बर के मैदान (2 डी तृप्ति assays के लिए प्रयोग किया जाता है) 6 अंगूठे नट और हेक्स शिकंजा (ए) द्वारा एक साथ आयोजित की परतें होती हैं। एक 32-कक्ष के मैदान (प्रेमालाप assays के लिए प्रयोग किया जाता है) इसी प्रकार निर्मित है, लेकिन भोजन की दीवार के बिना (परत 4)। अखाड़ा भागों एक लेजर कटर के साथ बाहर काट रहे हैं और परतों (बी) 8-कक्ष और (सी) 32-कक्ष के लिए के लिए के रूप में गिने जा रहे हैं। इकट्ठे 8-कक्ष एरेनास (डी) (सामने का दृश्य) और (ई) (गिने परतों के साथ की ओर देखने) में दिखाया जाता है। इकट्ठे 32-कक्ष एरेनास एक समान फैशन में इकट्ठे (एफ, जी), लेकिन परत 4 (खाद्य दीवार) छोड़ा जाता है (जी) के बाद से कोई मक्खी भोजन प्रेमालाप assays के लिए मैदान में है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. खाना पकाने के साथ 2-डी तृप्ति assays। स्टैंडर्ड ड्रोसोफिला भोजन पानी (ए) के साथ एक माइक्रोवेव सुरक्षित जार में रखा गया है। जब तक पिघल (बी) खाद्य microwaved है। एक पा विंदुक टिप (सी, तीर) के एक आंशिक रूप से इकट्ठे व्यवहार के मैदान (डी) के कक्षों को भोजन हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। भोजन व्यवहार के मैदान पूरी तरह से इकट्ठा किया जाता है (एफ) से पहले 4 डिग्री सेल्सियस (ई) पर फिर से जम जाता है।पीजी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: w1118 (एक्स) / एच एस छिपाई (वाई) स्टॉक से उत्पन्न कुंवारी महिलाओं। बोतलों के लिए उड़ान भरने गर्मी हैरान होना चाहिए जब 50 - pupae के 80% के रूप में उनके opaqueness (ए) ने संकेत दिया uneclosed हैं। इनसेट छवि और uneclosed (ऊपर) के नमूने eclosed (नीचे) pupae (ए) से पता चलता है। बोतलें नीचे दबा और जल स्तर के साथ 1 घंटे बस के ऊपर बोतल stoppers के नीचे भी हीटिंग (ख) यह सुनिश्चित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पानी से स्नान में डूबे हुए हैं। Waterline के लिए (ए) में काला तीर मिलते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: लोड हो रहा है एक व्यवहार के मैदान में मक्खियों। धीरे aspirate और 15 पकड़ - खींचने की मशीन (ए) में 20 महिलाओं। विंदुक टिप घूर्णन दरवाजे (बी) खोलने के लिए प्रयोग किया जाता है, और मक्खियों धीरे चैम्बर (सी) में जारी किया। Aspirator का उपयोग घूर्णन दरवाजा (डी) बंद हुआ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: प्रदर्शन और एक 2-डी तृप्ति परख रिकॉर्डिंग। (ए) एक मानक उपभोक्ता camcorder (क) एक मशीन वांछित तापमान के लिए सेट में परख रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इनक्यूबेटर सुनिश्चित करने के लिए पानी (ख) एक फ्लास्क और एक नमी डिटेक्टर (ग) शामिल हैंउचित नमी का स्तर (> 30%)। तैयार 2-डी तृप्ति परख Camcorder (बी) के तहत फिल्माया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: तुष्टि और वित्तीय वर्ष संभोग ड्राइव की वसूली। 2-डी तृप्ति परख में, पुरुष मक्खियों परख (ए, बी) के पहले 2 घंटे के दौरान अक्सर दोस्त के रूप में लेकिन परख की प्रगति उनके प्रेम प्रसंग (सी) और matings (बी) में कमी। जब पुरुषों 0 h, या 1 घंटे, या 4.5 एच (डी, ई) के एक 2-डी तृप्ति परख पूरा करने के बाद नए महिलाओं के साथ एक प्रेम प्रसंग परख करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं प्रेमालाप व्यवहार में प्रगतिशील कमी बनाए रखा है। लाल तीर, प्रेम प्रसंग और संभोग व्यवहार का प्रदर्शन पुरुषों को इंगित करते हुए नारंगी की गिरफ्तारीपंक्तियों गैर संभोग, गैर प्रणय निवेदन मक्खियों (ए, डी) को इंगित करें। यौन व्यवहार में गिरावट शारीरिक थकावट का एक परिणाम, पुरुषों से पहले और 2-डी तृप्ति परख (एफ) के बाद हरकत गतिविधि के बराबर के स्तर को दिखाने के रूप में नहीं है। नर धीरे-धीरे खत्म महिलाओं से अलगाव के 3 डी उनकी संभोग (G) और प्रेम प्रसंग (एच) के स्तर की वसूली। इस चित्र में, *** पी <0.001, ** पी <0.01, टी टेस्ट (सी, एफ) और Tukey के बाद परीक्षण (ई, जी, एच) के साथ एक तरह से एनोवा के लिए महत्वपूर्ण नहीं एनएस। एन = 15 - 16 सब प्रयोगों के लिए हर हालत के लिए। त्रुटि सलाखों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: Thermogenetic तृप्ति माले में उलटा मक्खियों। मानक 2-डी तृप्ति परख के रूप में, पुरुषों के प्रयोग के पाठ्यक्रम पर matings में कमी है, लेकिन डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की thermogenetic उत्तेजना दिखाने (th> TRPA1, लाल), लेकिन माता पिता का नियंत्रण में नहीं जीनोटाइप (काले और भूरे रंग), तृप्त पुरुषों (ए) में ड्राइव संभोग reinstates। जब एक्स अक्ष (ए) में टूट गया है नहीं matings रन बनाए हैं। संभोग ड्राइव के इस उत्क्रमण या तो संभोग संख्या (बी) या प्रेम प्रसंग (सी) का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। (बी) और (सी) में एक्स अक्ष संख्या में (ए) के समय को देखें। (ए - सी) नारंगी रंग की पृष्ठभूमि रंग thermogenetic उत्तेजना इंगित करता है। इस चित्र में, *** पी <0.001, Bonferroni पोस्ट-परीक्षण (बी, सी) के साथ दो तरह से एनोवा में जीनोटाइप और तापमान के बीच बातचीत के लिए महत्वपूर्ण नहीं एनएस। एन = 8 प्रत्येक जीनोटाइप के लिए (बी, सी)। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं।.jove.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रेरक राज्यों, तृप्त किया जा सकता है बनाए रखा है, और 34 बरामद किए। हम एक 2-डी तृप्ति परख है कि जल्दी से और मजबूती के साथ मक्खी में ड्राइव संभोग के इन पहलुओं के सभी उपायों को प्रस्तुत करते हैं। इस परख एक से प्रेरित व्यवहार की आणविक और सर्किट घटकों का अध्ययन करने के लिए उन्नत मक्खी आनुवंशिक जोड़तोड़ उपयोग करने की संभावना को खोलता है।

तृप्ति परख पुरुष के सफलतापूर्वक अदालत और मैथुन करना, और उचित समय पर copulations को समाप्त करने की क्षमता पर निर्भर करता है। हालांकि hyposexual मक्खियों अदालत कम, कम प्रेमालाप मक्खियों जरूरी hyposexual नहीं कर रहे हैं; वे हो सकता है, उदाहरण के लिए, मुसीबत पहचानने या मादा 35 पर नज़र रखने के लिए है। इस कारण से, तृप्ति परख सबसे अच्छा परीक्षण अतिकामुकता, एक phenotype कि मज़बूती से एक मानक प्रेमालाप परख में देखा नहीं जा सकता क्योंकि भोले जंगली प्रकार पुरुषों तृप्ति परख श में आ रहा 1. अतिकामुकता प्रेमालाप सूचकांकों दिखाने के लिए अनुकूल हैसाल की उम्र के सापेक्ष माना जा ould पुरुष में हमारे अनुभव, पुराने पुरुषों 3 दिन पुरानी यहां इस्तेमाल में पुरुषों की तुलना में थोड़ा अधिक बार संभोग करते हैं।

हम neurogenetic जोड़तोड़ कि इस प्रणाली में इस्तेमाल किया जा सकता घटक अंतर्निहित प्रेरणा जांच करने के लिए उदाहरण देना डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की thermogenetic उत्तेजना का इस्तेमाल किया। इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने यह भी 2-डी तृप्ति परख भर thermogenetic उत्तेजना का उपयोग करें और hypersexual पुरुषों है कि तृप्ति तक पहुंचने के लिए धीमी कर रहे हैं के लिए देख सकते हैं। बेशक, तृप्ति assays भी न्यूरोनल मुंह बंद उपकरण 36, 37 के साथ जोड़ा जा सकता है 38 optogenetics, जेनेटिक म्यूटेशन 39, 40, 41, आरएनएआई पछाड़ना 28, 42, 43, 44, आदि

तृप्ति परख सस्ती और स्केलेबल है। प्रत्येक क्षेत्र की सामग्री ~ 10 अमरीकी 'डॉलर मूल्य के लिए निर्मित किया जा सकता (प्लस लेजर काटने की लागत, अगर कोई है) और एक किताबचा पुस्तक से भी कम जगह रह रहे हैं। वीडियो स्कोरिंग भी एक अपेक्षाकृत आसान काम है। 8 पुरुष के साथ में ~ 1.5 घंटे मक्खियों एक प्रशिक्षित प्रयोगकर्ता एक 4.5 एच वीडियो स्कोर कर सकते हैं। अधिक उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए, एक ही पिछले 2 घंटे स्कोर कर सकते हैं, सामान्य मक्खियों संभोग ड्राइव का स्तर बहुत कम दिखाने के लिए जब। वैकल्पिक रूप से, एक के रूप में इस ~ 20 मिनट के लंबे matings के बहुमत पर कब्जा होगा, assays की जांच हर 30 मिनट हाजिर कर सकते हैं।

हम इस प्रणाली को व्यापक रूप से अनुकूलित किया जाएगा और प्रेरणा के रहस्यों को ताला खोलने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली के रूप में ड्रोसोफिला के उद्भव के लिए योगदान देगा उम्मीद है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K12 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/8 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K42 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
3/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8560K219 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/32 inch black delrin McMaster-Carr 8575K132 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
Hex screws, 1 inch long (50x) McMaster-Carr 92314A115  Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.
Thumb nuts (25x) McMaster-Carr 92741A100 Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).
Camcorder Canon Vixia HF R700 Can be replaced by any consumer comcorder.

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 120 प्रेरणा ड्राइव संभोग, डोपामाइन प्रेम प्रसंग व्यवहार
मापने और माले में फेरबदल संभोग ड्राइव<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
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Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, … More

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, O., Zhang, S. X. Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (120), e55291, doi:10.3791/55291 (2017).

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