Summary
توضح هذه المقالة الفحص السلوكي يستخدم محرك التزاوج من الذكور في ذبابة الفاكهة melanogaste ص لدراسة الدوافع. باستخدام هذه الطريقة، يمكن للباحثين الاستفادة الطيران المتقدمة تقنيات العصبية الوراثية للكشف عن الآليات الوراثية والجزيئية والخلوية التي تكمن وراء هذا الدافع.
Abstract
وعلى الرغم من عقود من التحقيق، تبقى القواعد العصبية والجزيئية للدول تحفيزية غامضة. لقد وضعت مؤخرا رواية، اختزالية، ونظام قابلة للتحقيق معمق لدوافع استخدام محرك الأقراص التزاوج من الذكور ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة)، الأساليب التي نحن هنا بالتفصيل. مراكز النموذج السلوكي على النتيجة التي مفادها أن يقلل محرك التزاوج من الذكور إلى جانب الخصوبة على مدى copulations المتكررة ويسترد أكثر من 3 ~ د. في هذا النظام، والأدوات العصبية الوراثية القوية المتاحة في ذبابة تلتقي مع إمكانية الوصول الوراثية والاسلاك الرسم البياني المفترض متاحة للسلوك الجنسي. هذا التقارب يسمح العزلة السريعة واستجواب السكان العصبية صغيرة مع وظائف تحفيزية محددة. نحن هنا بالتفصيل تصميم وتنفيذ فحص الشبع الذي يستخدم لقياس وتغيير الدافع الخطوبة في الطيران الذكور. استخدام هذافحص، علينا أن نظهر أيضا أن انخفاض محرك التزاوج الذكور يمكن التغلب عليها من خلال تحفيز الخلايا العصبية الدوبامين. فحص الشبع هو بسيط، وبأسعار معقولة، وقوية إلى تأثيرات الخلفية الوراثية. نتوقع أن فحص بالشبع لتوليد العديد من الأفكار الجديدة في البيولوجيا العصبية للدول تحفيزية.
Introduction
وقد وفرت العمل في ذبابة الفاكهة نظرة عميقة ورائدة في العديد من الظواهر البيولوجية، بما في ذلك طبيعة الجينات 1، ومبادئ التطور الجنيني 2، ايقاعات كل يوم 3، وتطوير والأسلاك من الجهاز العصبي 4 و 5 و 6. ولا يزال الدافع حتى تفهم بشكل أقل من هذه الظواهر، وربما بسبب القيود المفروضة على الأنظمة التي تم دراستها حتى الآن. تدرس الدافع في الطيران في المقام الأول في سياق الجوع، والذي يقدم العديد من التحديات بسبب تناول المواد الغذائية الصغيرة بزوال بها في نوبة التغذية والهيكل الخارجي الذي يحول دون علامات الصريحة من ترسب الدهون. ونتيجة لذلك، هناك حاجة لتوسيع النظم المستخدمة لدراسة الدوافع في الطيران.
نحن تصف الإطار السلوكي لدراسة محرك التزاوج فيذبابة الفاكهة. هذا النظام يستفيد من أدوات العصبية الوراثية في الطيران، فضلا عن إمكانية الوصول 7، 8، 9، 10، 11، 12 وconnectome المفترضة للدوائر في ديمبرافيك جنسيا 8 و 13. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الكثير من فطريه 14، 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21 و المستفادة 22، 23، وقد تم عمل 24 الدوائر الحسية والحركية السيطرة الخطوبة في التفاصيل، وتوفير فرصة نادرةلتحديد موقع العقدة الدوائر الدقيقة التي على يفتئت الدافع. بلغنا مؤخرا أنه في الطيران، كما هو الحال في البشر، ومستويات الدوبامين هي محور التزاوج محرك 25 و 26 و 27. لقد تمكنت من الوصول الجيني للمفصل على مستوى الدائرة الجزيئي وواستقبال الخلايا العصبية في الطيران، وتسهيل المنتجة للدوبامين ذات الصلة يحلل هذه الظاهرة الحفظ باستخدام فحوصات وصفنا هنا 25.
أضفنا إلى المقايسات السلوكية في تشانغ وآخرون. 25 ساحة مسطحة جديدة السلوكية التي تتيح تسجيل الفيديو، الذي نسميه 2-الأبعاد (2-D) الشبع الفحص، تحسنا هاما مقارنة مع الطرق السابقة. وبالتالي، فإن الفحص الجديد هو أكثر قابلة للقياس، وبالتالي أكثر ملاءمة لشاشات الوراثية الجينات والخلايا العصبية التي تشارك في الدافع. نحن نستخدم هذا الاختبار الجديد، جنبا إلى جنب مع فحوصات الخطوبة وneurogeالتلاعب المغنطيسية، لشرح كيفية قياس وتغيير محرك التزاوج في الطيران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إعداد (الأقسام 1-3) والتنفيذ (القسم 4)، والتحليل (القسم 4) لسنة 2-D المقايسات الشبع. ثم، وذلك باستخدام التحفيز الدوبامين كمثال، القسم 5 يبين كيفية الجمع بين التحفيز توليد الحرارة مع 2-D المقايسات بالشبع للحث على فرط الرغبة الجنسية. ويصف الجزء 6 3 طرق للتحقق من النتائج من 2-D المقايسات الشبع. وأخيرا، القسم 7 يوضح كيفية قياس استرداد محرك التزاوج في الذباب الذكور.
1. افتعال 8- و 32 غرفة اريناس السلوكية
ملاحظة: تتكون كل الساحة السلوكية من عدة طبقات من الأغطية البلاستيكية الليزر قطع عقدت معا بواسطة مسامير عرافة والمكسرات الإبهام في كل من الزوايا الأربع (الشكل 1A).
- افتعال طبقات من الساحة. افتعال كل طبقة باستخدام الليزر القاطع لقطع ورقة من البلاستيك الاكريليك على شكل المناسب (انظر الشكل 1B، 1C للمنتجات).
ملاحظة: العديد من الأبحاث المؤسسة:NS لها قطع الليزر في المحلات التجارية آلة أو المساحات صانع. إذا كانت المؤسسة لديه حق الوصول إلى قطع الليزر، مع الاستمرار في الخطوات التالية. إذا لم يكن كذلك، ثم اتبع الإرشادات في الخطوة 1.2 بدلا من ذلك.- لكل طبقة، فتح نمط تصميم في برنامج القاطع الليزر.
ملاحظة: التصاميم يمكن العثور عليها في ملفات PDF اسم مناسب (على سبيل المثال، 8-غرفة أرينا - طبقة 2 - Doors.pdf) في خلفية مادة 1. يحتوي هذا الملف على شروح لنوع من البلاستيك لاستخدامها (على سبيل المثال، 1 / 8 بوصة (أي 3.175 مم) الاكريليك واضحة). سمك المحدد من كل طبقة ليست حرجة. الشرط الرئيسي هو السماح 0.12 بوصة (3 مم) أو أكثر من المساحة العمودية مجانا في الغرف. - ضبط الإعدادات ليزر (السلطة، والتركيز، الخ) لنوع وسمك من البلاستيك لاستخدامها. وضع البلاستيك في السرير قطع الليزر وتشغيل القاطع ليزر.
ملاحظة: سوف تختلف على نطاق واسع هذه الإعدادات على cutte الليزرنموذج r وقوة الليزر لها. البحث عن الإعدادات المناسبة استنادا إلى الخبرة السابقة أو عن طريق خفض اختبار على البلاستيك الخردة. يتم تضمين النقوش سداسية عميقة في التصميم لعطلته رؤساء عرافة المسمار. تسمح هذه الميزة لتشديد بيد واحدة من المكسرات الإبهام ويسمح الساحات للراحة شقة على مقاعد البدلاء (بدون جاحظ رؤساء المسمار). ومع ذلك، مما يجعل النقوش العميقة غالبا ما يكون من الصعب تحقيقه، و، وذلك باستخدام الليزر القاطع تستغرق وقتا طويلا. هذه الخطوة اختيارية ويمكن تخطي دون التأثير على النتائج السلوكية. - عندما قطع إطار الباب (طبقة 2، الشكل 1A)، أيضا استخدام إعدادات الليزر المناسبة لنقش أرقام غرفة المدرجة في التصميم (كما في الشكل 1B، 1C).
- لكل طبقة، فتح نمط تصميم في برنامج القاطع الليزر.
- وضع النظام مع القطع بالليزر كاذب على الانترنت. تحميل جميع ملفات PDF تصميم لالساحة 8- و / أو 32 غرفة وتحديد نوع المادة (على سبيل المثال، 1/8 بوصة (أي 3.175 مم) جزءا لا يتجزأ منالاكريليك ص) على أساس الشروح في ملفات. سوف تظهر النتائج كما هو الحال في أرقام 1B (8 غرفة الساحة) و1C (32 غرفة الساحة).
- تجميع الساحات باستخدام أربعة مسامير عرافة وأربعة المكسرات الإبهام لمحاذاة، وتماسك طبقات البلاستيك (الشكل 1A). سوف تظهر على الساحتين كما في الشكل 1D، 1E (8-غرفة) والشكل 1F، 1G (32 غرفة).
ملاحظة: جدار الغذائية (طبقة 4 في الشكل 1A) ويستخدم لمدة 2-D المقايسات الشبع فقط وحذفت في الساحات 32 غرفة، والتي تستخدم في فحوصات الخطوبة.
2. إعداد الطعام لمدة 2-D التخمة الفحص
ملاحظة: لأن الشبع فحص 2-D يمتد 4.5 ساعة، ويطير يستخدم الطعام في الساحة لتوفير التغذية والمياه. يستخدم هذا البروتوكول، ولكن لا يقتصر على، التقليدي دقيق الذرة أجار يطير الغذاء.
- تجميع جزئيا الشبع الساحة 2-D (8 الغرفة) مع طبقات 3-6(انظر الشكل 1A للقيام بمهام طبقة) وتشديد عليه مع المكسرات الإبهام والبراغي عرافة.
- وضع الطعام ذبابة جديدة في زجاجة نظيفة، الميكروويف آمنة. إضافة قليل من الماء لتغطية السطح السفلي من القمقم (الشكل 2A).
- الميكروويف الطعام على ارتفاع لمدة 30 - 45 ثانية. تحقق من التقدم ويقلب كل 15 ثانية حتى ذاب (الشكل 2B). الحذر! يطير الغذاء الدمامل بسهولة على.
- استخدام اضعافها 1000 ميكرولتر ماصة (الشكل 2C) لنقل ببطء ~ 1 ذاب مل الغذاء في كل غرفة (الشكل 2D).
- السماح الغذائية لresolidify في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ~ (الشكل 2E) قبل تجميع تماما الساحة (الشكل 2F).
- استخدام الساحة الانتهاء للتجارب (انظر القسم 4) أو تخزينها في 4 درجات مئوية.
- تخزين بقايا الطعام في 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها.
3. إعداد العذراء الإناث السلوكية فحوصات
ملاحظة: 2-D المقايسات الشبع استخدام أعداد كبيرة من الذباب الإناث البكر (~ 120-160 لالساحة السلوكية كاملة) التي يصعب جمع باستخدام الطرق القياسية. يصف هذا القسم نهج بديل باستخدام التحوير-HS اختبأ على كروموسوم Y 28، والتي استخدمت بنجاح في المقايسات الخطوبة 25 و 29. في الأوراق المالية المستخدمة لتوليد الإناث البكر البيضاء العينين لديه w1118 الوراثي (X) / HS-اختبأ (Y)؛ + / +، + / + (بلومينغتون عدد الاسهم 24638).
- الوجه الذباب في زجاجة جديدة مرة واحدة 20 - 50٪ من الشرانق وeclosed (انظر الشكل 3A على سبيل المثال) وهناك ما يكفي من الذكور (5-10) لنشر الأسهم.
- الحرارة صدمة زجاجة الأصلي في حمام الماء الساخن 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتنشيط بما فيه الكفاية HS-اختبأ لقتل الذكور (الشكل 3B). بعد الصدمة الحرارية، إلا الإناث سوف eclose من هذه الزجاجات وهكذا سوف تظل عذراء حتىالمقاييس.
ملاحظة: تأكد يتم تسخينها جميع الاطراف من القمقم بالتساوي (انظر الشكل 3A لخط الماء). تمديد هذه المرة لتصل إلى 2 ساعة إذا 1 ساعة ليست كافية لقتل الرحيم عن جميع الذكور. - عزل الإناث التي تم جمعها لا يقل عن 3 د قبل التجارب لضمان أن تكون من العمر ما يكفي لتكون تقبلا جنسيا 25 و 29.
ملاحظة: Y كروموسوم-أقل من الذكور تنشأ من حين لآخر من هذه الأسهم. هذه الذكور لها عيون بيضاء ولا تتأثر الصدمة الحرارية لأنها لا تحتوي على التحوير HS-اختبأ. أنهم لا يستطيعون إنتاج الحيوانات المنوية، وبالتالي لا يمكن أن تقلل التقبل لدى الإناث 30، 31.
4. أداء وتسجيل النقاط 2-D التخمة فحوصات
ملاحظة: من المهم للسيطرة على عمر ذكر الذباب عن التغيرات محرك التزاوج مع التقدم في السن. يستخدم هذا البروتوكول الذكور التي هي 3-4 د من العمر 25
- تعيين الحاضنة إلى درجة الحرارة المطلوبة (على سبيل المثال، 23 درجة مئوية لمدة قياسية، التجارب RT) والرطوبة (> 30٪). لحاضنات دون مراقبة الرطوبة، وترك كوب من الماء في الحاضنة غير كافية.
- ضع 2-D الشبع فحص الساحة في الحاضنة لمدة 30 دقيقة ~ لكي تتوازن درجة الحرارة ومنع التكثيف في غرف أثناء التجربة. يجب أن تكون الأبواب الدوارة في موقف فتح.
- استخدام الشافطة ذبابة 32 إلى نضح 15-20 الإناث البكر في كل غرفة من الساحة (الشكل 4).
ملاحظة: من المهم أن الإناث والذكور لا تخدير على نفس يوم الاختبار. في تجربتنا، والقيام بذلك قد يؤثر على تقبل الإناث وسلوك التزاوج من الذكور. - نضح 1 الذكور في كل غرفة.
- وضع الساحة المحملة في الحاضنة تحت كاميرا الفيديو المستهلك القياسية (الشكل 5) وفيلم عن 4.5 ساعة.
- تسجيل أشرطة الفيديو عن طريق الانتباه عند كل من الذكور تطير يبدأ وينتهي كل التزاوج (أي الجماع). قد تكون هذه الخطوة في البداية تستغرق وقتا طويلا. مع الممارسة، يمكن للمرء أن يسجل الفيديو بسرعة 5X أو أعلى.
ملاحظة: منذ الذباب تتزاوج ل~ 20 دقيقة في ~ 23 درجة مئوية (مدة أقصر عند ارتفاع درجات الحرارة) 29، يمكن للمرء أن المقشود من خلال دقيقة 15 الأول من كل التزاوج. - بعد تسجيل جميع الأوقات التزاوج، تلخيص عدد من التزاوج لكل ذبابة (انظر نتائج تمثيلية).
- استخدام التعليمات البرمجية المقدمة لتوليد ethogram. رؤية خلفية المادة 2 لرمز والتعليمات والبيانات سبيل المثال.
- استخدام CO 2 أو درجات الحرارة الباردة لتخدير الذباب قبل إزالتها.
5. عن طريق التلاعب توليد الحرارة إلى عكس التخمة في 2-D التخمة فحوصات
ملاحظة: هذا البروتوكول الاختبارات سواء تحفيز توليد الحرارة من السكان العصبية محددة يمكن التغلب على الشبع. وFLI التجريبيوفاق التعبير عن قناة الموجبة الحساسة للحرارة TrpA1 في السكان محددة من الخلايا العصبية (UAS-TrpA1). تطبيق الخطوات التالية لتحفيز الخلايا العصبية الدوبامين (TH-GAL4)، والتي ثبت لتعزيز التزاوج محرك 25. هذه الخطوات التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع السائقين العصبية الأخرى لاكتشاف الشعوب الأخرى التي تعزز محرك التزاوج.
- للحث على thermogenetically سلوكيات التزاوج في الذباب الاشباع، وزيادة درجة الحرارة في الحاضنة (على سبيل المثال، من 23 درجة مئوية إلى 28.5 درجة مئوية) بعد الانتهاء من كامل 4.5 ح 2-D الشبع التجربة.
- بعد أن تصل حاضنة درجة الحرارة المطلوبة، ومواصلة التحفيز الحرارة لتصبح النتيجة التزاوج (أي. copulations) من الذكور لمدة 1 ساعة (انظر ممثل النتائج).
ملاحظة: درجة الحرارة وطول التحفيز قد تختلف تبعا لنمط وراثي لذلك من الضروري استكشاف الظروف المثلى التي تحول دون فرط الخلايا العصبية في حين لا تزال تنتج روبوالحادي والنمط الظاهري.
6. استخدام تودد وتنقل إلى التحقق من التخمة
ملاحظة: يصف هذا القسم 3 طرق الاختيارية التي يمكن استخدامها للتحقق من النتائج من 2-D المقايسات الشبع. لا حاجة إليها لكل فحص.
- استخدام فحوصات التودد للتحقق الشبع.
- نضح ذكر واحد وأنثى واحدة البكر في كل دائرة من الدوائر 32 في ساحة الخطوبة.
- تصوير الذباب ل~ 20 دقيقة باستخدام كاميرا الفيديو المستهلك القياسية.
- يسجل مؤشر المغازلة (CI) لتحديد الخطوبة 25. هذا هو جزء من الوقت الذي يقضيه أداء المغازلة (الغناء بعد، الخ) والتزاوج (أي الجماع) خلال نافذة 5 دقائق. يبدأ هذا الإطار من الدرجة الأولى من المغازلة. إذا لم يبدأ ذبابة الذكور الخطوبة في دقيقة 15 الأولى، CI منه هو أن 0. الذباب السذاجة WT تظهر CI أكبر من 0.9، في حين يجب أن يكون ذبابة الاشباع بالكامل CI بelow 0.2. ويمكن أيضا النظر في اتخاذ تدابير الخطوبة أخرى 23، 33.
- سجل الخطوبة في 2-D المقايسات الشبع
- يسجل مقدار الوقت الذي يطير الذكور تنفق بمغازلة، على مدى فترة زمنية من الشبع فحص 2-D (على سبيل المثال، في ساعة الأولى). ويعرف الخطوبة كما ذكر القيام بأي خطوة من طقوس (الغناء بعد، وما إلى ذلك). خلافا لما حدث في القسم 6.1.3، هذه الخطوة لا يشمل الوقت الذكر تنفق التزاوج.
- تقسيم وقت الخطوبة أعلاه الوقت الإجمالي كان الذكر لا التزاوج (أي لا جماع) في نفس الفترة الزمنية. على سبيل المثال، إذا كان الذكور تطير المحاكم لمدة 15 دقيقة وزملائه لمدة 20 دقيقة على مدى ساعة الأولى، والنسبة هي 15 دقيقة / (60 دقيقة - 20 دقيقة) = 0.375. وأظهرت نسبة بأنها "جزء من nonmating الوقت في التودد" في ممثل النتائج.
- استخدام تنقل فحص لتقييم استنفاد
- تجميع جزئيا 32-الساحة غرفة مع جميع أجزاء ولكن ورقة التباين.
- نضح واحد يطير الذكور (لا الذباب الإناث) في كل غرفة 32 في ساحة الخطوبة.
- تصوير الذباب ل~ 10 دقيقة باستخدام كاميرا الفيديو المستهلك القياسية.
- تتبع الذباب مع البرنامج المساعد MTrack2 في ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).
7. استعادة التزاوج محرك بعد 2-D التخمة الفحص
- إجراء فحص بالشبع 2-D كما هو موضح في القسم 4، ولكن نضح ذكر الذباب في نهاية الفحص.
- عزل الذباب الذكور في 23 درجة مئوية لمدة العدد المطلوب من أيام.
- إجراء فحص بالشبع 2-D مع الذكور تعافى ويسجل التزاوج بهم (أي copulations) للساعة فقط 1 (انظر ممثل النتائج).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوصيف حملة التزاوج ذبابة الفاكهة، البالغ من العمر 3 أيام، تم اختبار WT كانتون-S الذكور في الشبع فحص 2-D. على مدى مقايسة (4.5 ساعة)، الذكور تتزاوج في المتوسط 4.8 ± 0.3 (يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط، SEM) مرات. التزاوج الشروع في الغالب في ساعة الأولى 2 (78٪) (الشكل 6A، 6B) وتصبح أقل تواترا كما الفحص تقدم (الشكل 6A، 6B). هذا الانخفاض لا يعود إلى عدم وجود شركاء التزاوج (لا تزال 74٪ من بين الإناث unmated في جميع أنحاء فحص) أو التعب البدني (الشكل 6F). بدلا من ذلك، من المرجح تفسير هذا التأثير من خلال انخفاض في تودد الذكر أثناء الفحص، من 42.6 ± 8.0٪ (يعني ± SEM) (1 ش ح) إلى 2.0 ± 0.7٪ (يعني ± SEM) (آخر ساعة) من الوقت nonmating (الشكل 6C). وينظر أيضا هذا الانخفاض في الخطوبة عندما يتم اختبار الذكور في المقايسات الخطوبة مع الإناث الجديدة (الشكل 6D، 6E) (الشكل 6G، 6H). وتشير هذه النتائج إلى أن المحافظة داخليا محرك التزاوج في الذباب الذكور يمكن مشبع في الشبع فحص 2-D ويمكن استرداد مع مرور الوقت.
ويمكن أيضا أن الشبع فحص 2-D تكون مجتمعة بسهولة مع التلاعب العصبية ذبابة الفاكهة. نحن ذكرت مؤخرا ان تحفيز توليد الحرارة من الخلايا العصبية الدوبامين عكس محرك التزاوج في الذكور الاشباع الذباب 25. باستخدام 2-D المقايسات الشبع، نجد أن التحفيز الدوبامين (TH> TrpA1، 28.5 درجة مئوية) في نهاية الفحص الشبع زيادة كل من الخطوبة (الشكل 7A، 7C، أحمر) والجماع (الشكل 7A، 7B والأحمر). ليست لاحظ آثار انعكاس مع الأنماط الوراثية الوالدين التحكم (الشكل 7A - 7C، سوداء ورمادية). كل هذه النتائج تتفق مع دراسة حديثة25 وتشير إلى أن الشبع فحص 2-D، جنبا إلى جنب مع فحوصات المساعدة (الخطوبة والحركة)، ويمكن استخدامها لتشريح المكونات الجزيئية والخلايا العصبية من محرك التزاوج.
الشكل 1. تصميم وتركيب السلوكية اريناس. ساحة 8-غرفة (التي تستخدم ل2-D المقايسات الشبع) وتتألف من 6 طبقات التي عقدت معا من المكسرات الإبهام والبراغي عرافة (A). يتم تصنيعها والساحة 32 غرفة (التي تستخدم لفحوصات الخطوبة) على نحو مماثل، ولكن من دون جدار الغذائية (الطبقة 4). يتم قطع أجزاء الساحة الخروج مع قطع الليزر ويتم ترقيم طبقات (B) لمدة 8-غرفة و (C) ل32 غرفة. وترد تجميعها الساحات 8 غرفة في (D) (عرض الجبهة) و (E) (عرض جنب مع طبقات مرقمة). وتجميعها الساحتين 32 غرفة تجميعها بطريقة مماثلة (F، G)، ولكن طبقة 4 (جدار الغذاء) تم حذف (G) لأنه لا طعام الذبابة في الساحة لفحوصات الخطوبة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التحضير 2-D التخمة فحوصات مع الغذاء. يتم وضع الطعام ذبابة الفاكهة القياسية في وعاء الميكروويف آمنة مع الماء (A). وميكرووافيد الطعام حتى ذاب (B). يتم استخدام ماصة اضعافها (C، السهم) لنقل الطعام إلى الغرف على الساحة السلوكية تجميعها جزئيا (D). وإعادة عزز-الطعام في 4 درجات مئوية (E) قبل الساحة السلوكية يتم تجميعها بشكل كامل (F).خريج "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: توليد العذراء الإناث من w1118 (X) / HS-اختبأ (Y) سهم. وينبغي أن تكون ذبابة زجاجات الحرارة صدمت عندما 50-80٪ من الشرانق هي uneclosed كما يتبين من الغموض على (A). تظهر الصورة أقحم عينات من uneclosed (أعلى) وeclosed (القاع) الشرانق (A). يتم وزن زجاجات أسفل ومغمورة في 37 ° C حمام الماء الساخن لمدة 1 ساعة مع مستوى الماء فوق الجزء السفلي من سدادات الزجاجات لضمان حتى التدفئة (B). انظر السهم الأسود في الفقرة (أ) من أجل الماء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحميل يطير إلى السلوكية الساحة. نضح بلطف وعقد 15-20 الإناث في الشافطة (A). يستخدم طرف ماصة لفتح باب دوار (B)، والذباب صدر بلطف إلى غرفة (C). استخدام الشافطة لإغلاق باب دوار (D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: تنفيذ وتسجيل 2-D التخمة الفحص. يستخدم (A) وكاميرا الفيديو المستهلك القياسية (أ) لتسجيل فحص في حاضنة لتعيين درجة الحرارة المطلوبة. تحتوي الحاضنة قارورة من المياه (ب) وكاشف الرطوبة (ج) لضمانمستوى الرطوبة المناسبة (> 30٪). وصورت استعداد 2-D الشبع فحص تحت كاميرا الفيديو (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الإشباع والانتعاش من السنة المالية التزاوج محرك. في الشبع فحص 2-D، الذباب الذكور تتزاوج في كثير من الأحيان خلال 2 ساعة الأولى من الفحص (A، B) ولكن انخفاض التودد لهم (C) والتزاوج (B) كما تقدم الفحص. يتم الحفاظ على انخفاض تدريجي في المغازلة عند تحويل الذكور إلى فحص الخطوبة مع الإناث الجديدة بعد الانتهاء من الشبع فحص 2-D من 0 ساعة، أو 1 ساعة، أو 4.5 ساعة (D، E). وتشير السهام الحمراء للذكور واظهار المغازلة والتزاوج السلوكيات، بينما البرتقال عوتشير صفوف بعدم التزاوج، الذباب غير مغازلة (A، D). تراجع في السلوك الجنسي ليس نتيجة الارهاق البدني، كما تظهر الذكور مستويات مماثلة من النشاط الحركي قبل وبعد الشبع فحص 2-D (F). الذكور على التعافي تدريجيا التزاوج (G) ومستويات الخطوبة (H) أكثر من 3 د من العزلة من الإناث. في هذا الرقم، *** ع <0.001 **، ف <0.01، NS لا أهمية للاختبار t (C، F) وفي اتجاه واحد أنوفا مع توكي بعد اختبار (E، G، H). N = 15-16 لكل حالة لجميع التجارب. تمثل أشرطة الخطأ خطأ المعياري للمتوسط (SEM). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: توليد الحرارة التخمة الانعكاس في ذكر الذباب. كما هو الحال في معيار 2-D الشبع الفحص، الذكور تظهر انخفاضا في التزاوج على مسار التجربة، ولكن التحفيز توليد الحرارة من الخلايا العصبية الدوبامين (TH> TrpA1 والأحمر)، ولكن ليس في السيطرة الأبوية المورثات (الأسود والرمادي)، تعيد التزاوج محرك الأقراص في الذكور الاشباع (A). وسجل لا التزاوج عندما يتم كسر المحور X في الفقرة (أ). هذا عكس محرك التزاوج يمكن كميا باستخدام أرقام التزاوج (ب) أو الخطوبة (C). أرقام X-axis في (ب) و (ج) تشير إلى الوقت في الفقرة (أ). البرتقال لون الخلفية يشير تحفيز توليد الحرارة (A - C). في هذا الرقم، *** ع <0.001، NS يست كبيرة للتفاعلات بين النمط الجيني ودرجة الحرارة في اتجاهين أنوفا مع بونفيروني بعد اختبار (B، C). N = 8 لكل نمط وراثي (B، C). أشرطة الخطأ تمثل SEM..jove.com / ملفات / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تكميلية المادة 1. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية المادة 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
دول تحفيزية يمكن مشبع، حافظ، وانتشال 34. نقدم الشبع فحص 2-D أن بسرعة وبقوة يقيس كل من هذه الجوانب من التزاوج محرك الأقراص في الطيران. هذا الاختبار يفتح إمكانية استخدام التلاعب الجيني الطيران المتقدمة لدراسة المكونات الجزيئية والدائرة من سلوك دوافع.
ويعتمد الفحص الشبع على قدرة الذكر إلى المحكمة بنجاح والتزاوج، وإنهاء copulations في الوقت المناسب. على الرغم من الذباب hyposexual محكمة أقل، الذباب الخطوبة المنخفضة ليست hyposexual بالضرورة. قد كانوا، على سبيل المثال، لديك مشكلة في الاعتراف أو تتبع الإناث 35. لهذا السبب، وفحص الشبع هو الانسب لاختبار فرط الرغبة الجنسية، النمط الظاهري الذي لا يمكن ملاحظتها بشكل صحيح في فحص الخطوبة القياسية بسبب السذاجة الذكور من النوع البري تظهر مؤشرات الخطوبة تقترب 1. فرط الرغبة في ش الشبع فحصولد تعتبر نسبة إلى عمر الذكور في تجربتنا، وكبار السن من الذكور تميل لزميله قليلا أكثر في كثير من الأحيان من الذكور القديمة لمدة 3 أيام المستخدمة هنا.
كنا تحفيز توليد الحرارة من الخلايا العصبية الدوبامين لتجسد التلاعب العصبية الوراثية التي يمكن أن تستخدم في هذا النظام للتحقيق في المكونات الأساسية الدافع. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للباحثين أيضا استخدام التحفيز توليد الحرارة في جميع أنحاء الشبع فحص 2-D وننظر للذكور hypersexual التي هي أبطأ لتصل إلى الشبع. وبطبيعة الحال، المقايسات الشبع يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع أدوات إسكات العصبية 36، 37، 38 علم البصريات الوراثي، والطفرات الوراثية 39، 40، 41، رني ضربة قاضية 28، 42، 43، 44، الخ.
فحص الشبع هو بأسعار معقولة وقابلة لل. كل الساحة يمكن تصنيعها لقيمتها ~ 10 دولار "للمواد (زائد تكاليف القطع بالليزر، إن وجدت)، وتحتل مساحة أقل من كتاب ورقي الغلاف. سجل أشرطة الفيديو هي أيضا مهمة بسيطة نسبيا. ومجرب تدريب يمكن أن يسجل الفيديو 4.5 ساعة مع الذباب 8 من الذكور في ~ 1.5 ساعة. لمزيد من الفحص الإنتاجية العالية، يمكن للمرء أن يسجل سوى ساعة الأخيرة (2)، عندما يظهر الذباب العادي مستويات منخفضة جدا من محرك التزاوج. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن بقعة تحقق فحوصات كل 30 دقيقة، حيث سيؤدي ذلك إلى التقاط غالبية ~ 20 التزاوج لمدة دقيقة.
ونحن نأمل أن يكون هذا النظام سيتم تكييفها على نطاق واسع وسيسهم في ظهور ذبابة الفاكهة كنظام قوي لفتح أسرار التحفيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K12 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/8 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K42 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 3/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8560K219 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/32 inch black delrin | McMaster-Carr | 8575K132 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| Hex screws, 1 inch long (50x) | McMaster-Carr | 92314A115 | Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas. |
| Thumb nuts (25x) | McMaster-Carr | 92741A100 | Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr). |
| Camcorder | Canon | Vixia HF R700 | Can be replaced by any consumer comcorder. |
References
- Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
- Hall, J. C. Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).
- Luo, L.
- Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity. Cell. 101 (6), 671-684 (2000).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis. Cell. 75 (5), 827-830 (1993).
- Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121 (5), 795-807 (2005).
- Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior. Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).
- Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila. Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).
- Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster. Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).
- Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour. Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).
- Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain. Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).
- Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E.
- Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila. Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).
- Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice. eLife. 4, e11188 (2015).
- von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. Neuronal control of Drosophila courtship song. Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).
- Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila. eLife. 4, e08477 (2015).
- Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).
- Kohatsu, S., Yamamoto, D. Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state. Nature Communications. 6, 6457 (2015).
- Fan, P., Manoli, D. S., et al. Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species. Cell. 154 (1), 89-102 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate. Current Biology. 17, 599-605 (2007).
- Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).
- Pan, Y., Baker, B. S. Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila. Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).
- Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive. Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).
- Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism. The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).
- Sacks, O. W. Awakenings. , Vintage Books. New York. (1999).
- Dietzl, G., Chen, D., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila. Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).
- Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).
- Cook, R., Cook, A. The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet. Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).
- Toates, F. M. Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).
- Hall, J. C.
- Simpson, J. H. Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain. Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).
- Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
- Spradling, A. C., Stern, D., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).
- Parks, A. L., Cook, K. R., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).
- Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).
- Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
- Ni, J. Q., Zhou, R., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature. 8 (5), 405-407 (2011).
