Summary
В данной статье описывается поведенческий анализ , который использует мужской брачный диск в Drosophila melanogaste R для изучения мотивации. Используя этот метод, исследователи могут использовать методы нейрогенетических передовые летать, чтобы раскрыть генетические, молекулярные и клеточные механизмы, которые лежат в основе этой мотивации.
Abstract
Несмотря на десятилетия исследования, нейронные и молекулярные основы мотивационных состояний остаются тайной. Недавно мы разработали новый, редукционист и масштабируемую систему для глубокого изучения мотивации , используя матовую привод мужской дрозофилы (Drosophila), методы , для которых мы здесь подробно. Поведенческая парадигма сосредотачивается на обнаружении того, что самец спаривание диск уменьшается наряду с плодородие в течение повторных совокуплений и выздоравливает в течение ~ 3 d. В этой системе, мощные нейрогенетических инструменты, доступные в лету сходятся с генетической доступности и мнимого электросхема для сексуального поведения. Такая конвергенция позволяет осуществлять быструю изоляцию и опрос небольших популяций нейронов с определенными мотивационными функциями. Здесь мы подробно проектирование и выполнение анализа сытости, который используется для измерения и изменения мотивации ухаживания в мужском лету. С помощью этогоанализ, мы также показывают, что низкий спаривание привод самец может быть преодолена путем стимуляции дофаминергических нейронов. Анализ сытости является простым, доступным и устойчивым к воздействиям генетического фона. Мы ожидаем, что анализ сытости, чтобы генерировать много новое понимание нейробиологии мотивационных состояний.
Introduction
Работа в Drosophila обеспечила глубокую и новаторскую понимание многих биологических явлений, в том числе характер гена 1, принципы эмбрионального развития 2, 3 циркадных ритмов, а также разработка и подключение нервной системы 4, 5, 6. Мотивация остается гораздо менее понятны, чем эти явления, возможно, из-за ограничений на системы, которые были изучены до сих пор. Мотивация в лету, в первую очередь изучается в контексте голода, который создает много проблем в связи с их исчезающе малой потребляемой пищи на кормления бой и экзоскелет, чтобы исключить возможность явных признаков отложения жира. Следовательно, существует потребность в расширении систем, используемых для изучения мотивации в лету.
Мы описываем поведенческую основу для изучения сопрягаемой привода вДрозофилы. Эта система использует преимущества нейрогенетических инструментов в лету, а также доступность 7, 8, 9, 10, 11, 12 и мнимого Коннектом его половой диморфизм схемы 8, 13. Кроме того, большая часть врожденного 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 22 уроков, 23, 24 сенсомоторные схемы управления ухаживание была разработана в деталях, предоставляя уникальную возможностьЧтобы найти узел точную схему, на которой мотивация падающее. Мы недавно сообщили , что, в лету, как и у людей, уровень допамина играют центральную роль в сопрягаемой привода 25, 26, 27. Мы получили генетический доступ к соответствующему допамин-продуцирующих и приема нейронов в лету, что облегчает и детальной молекулярно - сеансового уровня анализа этого явления законсервированной с помощью анализов мы описываем здесь 25.
Добавим к поведенческим анализов в Zhang и соавт. 25 новая плоская поведенческая арена , которая позволяет видео скоринг, который мы называем анализ 2-мерный (2-D) сытости, значительное улучшение по сравнению с предыдущими методами. Следовательно, новый анализ является более масштабируемым и количественной оценке, и поэтому больше подходит для генетических экранов генов и нейронов, участвующих в мотивации. Мы используем этот новый анализ, вместе с ухаживания анализов и neurogeромагнитных манипуляции, чтобы продемонстрировать, как измерять и изменять ответная диск в лету.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол описывает получение (разделы 1 - 3), исполнение (раздел 4), а также анализ (Раздел 4) сытости анализов 2-D. Затем, используя дофаминергической стимуляции в качестве примера, в разделе 5 показано, как сочетать thermogenetic стимуляцию с сытости анализов 2-D, чтобы вызвать гиперсексуальность. Раздел 6 описывает 3 способа проверки результатов анализов сытости 2-D. Наконец, в разделе 7 показано, как измерить восстановление сопрягаемой привода у самцов мух.
1. Металлообрабатывающее 8- и 32-камерных Поведенческие Аренас
Примечание: Каждая поведенческая арена состоит из нескольких слоев лазерной резки пластиковых листов , скрепленных с помощью винтов с шестигранной головкой и большим пальцем гайки на каждом из четырех углов (Рис . 1А)
- Изготовить слои арене. Изготовить каждый слой , используя лазерный резак , чтобы вырезать листы оргстекла к соответствующей формы (рис 1B, 1C для продуктов).
Примечание: Многие исследования Institutioнс имеют лазерные резаки в своих механических мастерских или мейкера пространств. Если учреждение имеет доступ к лазерным резаком, продолжайте выполнять следующие шаги. Если нет, то следуйте инструкциям, приведенным в шаге 1.2 вместо этого.- Для каждого слоя, откройте шаблон проектирования в программном обеспечении лазерного резака.
Примечание: Проекты могут быть найдены в соответствующим названием PDF - файлов (например, 8-камерный Арена - Layer 2 - Doors.pdf) в дополнительного материала 1. Этот файл также содержит аннотации для типа пластика , которые будут использоваться (например, 1 / 8 дюймов (т.е. 3,175 мм) прозрачный акрил). Точная толщина каждого слоя не имеет решающего значения. Основным требованием является обеспечение 0,12 дюйма (3 мм) или более свободного вертикального пространства в камерах. - Настройка параметров лазера (мощность, фокус и т.д.) для типа и толщины пластика , которые будут использоваться. Поместите пластик в отрезателя кровати лазерной и запустить лазерный резак.
Примечание: Эти настройки будут широко варьироваться в зависимости от лазерного cutteг модель и сила его лазера. Найти подходящие настройки, основанные на прошлом опыте или путем сокращения испытаний на лома пластика. Глубокие шестигранные гравюр включены в конструкции с выемкой шестигранные головки винтов. Эта функция позволяет одной рукой закручивания гаек большого пальца и позволяет арен отдыхать плашмя на скамейке (без выступающих головок винтов). Тем не менее, делая глубокие гравюр часто бывает трудно достичь, и отнимает много времени, используя лазерный резак. Этот шаг является необязательным и может быть пропущен, не влияя на поведенческие результаты. - При разрезании дверную раму (Layer 2, рисунок 1А), а также использовать соответствующие параметры лазера для гравировки число камер , включенных в проект (как показано на Рисунке 1B, 1C).
- Для каждого слоя, откройте шаблон проектирования в программном обеспечении лазерного резака.
- Оформить заказ с онлайн-лазерной резки переработчиков. Загрузите все файлы дизайна PDF для 8- и / или 32-камерной арене и указать тип материала (например, 1/8 дюйма (т.е. 3,175 мм) КлиоR акрил) на основе аннотаций в файлах. Результаты будут выглядеть как на фигурах 1В (8-камера арены) и 1С (32-камерная арены).
- Сборка арен с помощью четырех шестигранных винтов и четыре пальца гайки , чтобы выровнять и скрепить пластиковых слоев (Рис . 1А) На аренах будет выглядеть как на рисунке 1D, 1E (8-камера) и рис 1F, 1G (32-камеры).
Примечание: Пищевой стенка (слой 4 на рисунке 1А) используется только для 2-D сытости анализов и опускается в 32-камерных арен, которые используются в брачных анализах.
2. Приготовление еды для 2-D сытости Пробирной
Примечание: Поскольку сытость анализ 2-Д охватывает 4,5 часа, летучая пища используется на арене, чтобы обеспечить питание и воду. Этот протокол использует, но не ограничивается, обычный кукурузной муки-агар летать пищу.
- Частично собрать 2-D сытости арены (8-камеры) с помощью слоев 3 - 6(см рисунок 1А для уровня заданий) и затяните его с накатанной гайки и винтов с шестигранной головкой.
- Поместите свежую пищу муха в чистую, микроволновой безопасной бутылки. Добавить достаточно воды , чтобы покрыть нижнюю поверхность бутылки (фиг.2А).
- Микроволновая печь еды на высоко в течение 30 - 45 сек. Ход выполнения и перемешать каждые 15 сек , пока не растает (рис 2B). ВНИМАНИЕ! Fly еды легко выкипает.
- Используйте притупляются 1000 мкл кончиком пипетки (рис 2C) медленно передавать ~ 1 мл расплавляют пищи в каждую камеру (рис 2D).
- Дайте пище resolidify при температуре 4 ° С в течение ~ 10 мин (рис 2E) до полного сборки арены (рис 2F).
- Используйте заполненную арену для экспериментов (см раздел 4) или хранить при температуре 4 ° С.
- Храните остатки пищи при 4 ° С и повторного использования.
3. Подготовка Virgin самок для поведенческого Assays
Примечание: 2-D сытости анализы используют большое количество девственных самок мух (~ 120 - 160 для полной поведенческой арены), которые трудно собрать с помощью стандартных методов. В данном разделе описывается альтернативный подход с использованием HS-спрятанный трансгенов на Y - хромосоме 28, который успешно используется в брачных анализах 25, 29. Запас используется для генерации белоглазой девственные самок имеет генотип w1118 (X) / HS-спрятанный (Y); + / + + / + (Блумингтон инвентарный номер 24638).
- Флип летит в новую бутылку когда - то 20 - 50% от куколок eclosed (см рисунок 3А, например) и имеется достаточное количество мужчин (5 - 10) распространяющиеся запас.
- Теплового шока оригинальную бутылку в ванну 37 ° C для горячей воды в течение 1 ч , чтобы в достаточной степени активировать HS-СПРЯТАННОЕ убить самцов (фигура 3В). После теплового шока, только самки Эклоз из этих бутылок и так будет оставаться девственницей до тех пор,анализов.
Примечание: Убедитесь , что все стороны бутылки равномерно нагревается (рис 3A для воды линии). Продлить на этот раз до 2 ч, если 1 ч не является достаточным, чтобы усыпить всех лиц мужского пола. - Изолировать накопившиеся самок в течение по крайней мере 3 дней до экспериментов , чтобы убедиться , что они достаточно стар , чтобы быть сексуально восприимчивым 25, 29.
Примечание: Y-хромосомы меньше мужчин иногда возникают из этого запаса. Эти самцы имеют белые глаза и не подвержены воздействию теплового шока, потому что они не содержат HS-газоразрядных трансгенов. Они не могут производить сперму и , следовательно , не может уменьшить восприимчивость у самок 30, 31.
4. Выполнение и Забив 2-D сытости Assays
Примечание: Важно контролировать возраст самцов мух как изменения спаривание привода с возрастом. Этот протокол использует мужчин, которые 3 - 4 d старый 25
- Установите инкубатор до нужной температуры (например, 23 ° C для стандартных, экспериментов RT) и влажности (> 30%). Для инкубаторах без контроля влажности, оставляя за собой чашку воды в инкубаторе достаточно.
- Поместите 2-D сытость анализа арена в инкубаторе в течение ~ 30 мин, чтобы уравновесить температуру и для предотвращения образования конденсата в камерах в процессе эксперимента. Вращающиеся двери должны быть в открытом положении.
- Используйте муха аспиратор 32 отсосать 15 - 20 девственных самок в каждую камеру арены (рисунок 4).
Примечание: Важно, что женщины и мужчины не под наркозом в тот же день, что и анализа. По нашему опыту, это может повлиять на женскую и мужскую восприимчивостью брачное поведение. - Отберите 1 самец в каждую камеру.
- Поместите загруженную арену в инкубаторе под стандартной потребительской видеокамеры (рисунок 5) и пленки в течение 4,5 ч.
- Оценка видео, отмечая , когда каждый самец летать начинается и заканчивается каждый сопряженный (т.е. совокупление). Этот шаг может занять много времени на первый взгляд. С практикой, можно забить видео на скорости 5х или выше.
Примечание: Так как мухи спариваются в течение ~ 20 мин при температуре ~ 23 ° C ( более короткий срок при более высоких температурах) , 29, можно пролистать первые 15 мин каждого спариванию. - После регистрации все время спаривания, суммировать количество спариваний для каждой мухи (см показательные результаты).
- Используйте предоставленный код для генерации ethogram. См Дополнительный материал 2 для кода, инструкции, и, например, данные.
- С помощью CO 2 или холодной температуры обезболить мух перед их удалением.
5. Использование Thermogenetic Манипуляции обратного сытости в 2-D сытости Assays
Примечание: Этот протокол проверяет, является ли thermogenetic стимуляция определенной популяции нейронов может преодолеть чувство насыщения. Экспериментальная FLIэс выразить термочувствительного катион канал TRPA1 в определенных популяциях нейронов (БАС-TRPA1). Перечисленные ниже шаги применимы к стимуляции дофаминергических нейронов (TH-Gal4), которые были показаны в целях содействия ответная привода 25. Эти шаги могут быть использованы в сочетании с другими нейронными водителей, чтобы обнаружить другие группы населения, которые способствуют ответная диск.
- Для того, чтобы побудить thermogenetically спаривание поведения в сытых мух, повышают температуру в инкубаторе (например, от 23 ° C до 28,5 ° C) после завершения полного 4,5 ч 2-D сытости эксперимент.
- После того , как инкубатор достигнет желаемой температуры, продолжайте тепловой стимуляции и оценка вязки (т.е.. Совокуплений) самцов в течение 1 ч (см Представитель Результаты).
Примечание: Температура и продолжительность стимуляции может варьироваться в зависимости от генотипа, поэтому необходимо устранить оптимальные условия, которые мешают суперстимуляции нейронов в то время как по-прежнему производя Robuй фенотип.
6. Использование ухаживания и Locomotion для проверки сытости
Примечание: В этом разделе описываются 3 дополнительных методов, которые могут быть использованы для проверки результатов анализов сытости 2-D. Они не требуются для каждого теста.
- Используйте ухаживания анализы для проверки сытости.
- Отберите один мужчина и одна девственница в каждой из 32 камер в ухаживании арене.
- Фильм мух за ~ 20 мин с использованием стандартной потребительской видеокамеры.
- Оценка индекса ухаживания (CI) для количественной оценки ухаживание 25; это доля времени , потраченное на выполнение брачного поведения (пение, следуя, и т.д..) и спаривание (т.е. совокупление) над окном в 5 мин. Это окно начинается с первого экземпляра брачного поведения. Если мужчина муха не начинается ухаживание в первые 15 мин, его CI 0. Наивные WT мух должен показать CI больше 0,9, в то время как полностью сытым муха должна иметь CI бElow 0.2. Другие меры , ухаживания могут быть также рассмотрены 23, 33.
- Забив ухаживание в сытости анализах 2-D
- Оценка количества времени , что мужчина муха проводит ухаживания, в течение определенного периода времени сытости анализа 2-D (например, первый час). Ухаживание определяется как мужчина , выполняющего любой шаг ритуала (пение, после и т.д.). В отличие в разделе 6.1.3, этот шаг не включает в себя время самец тратит спаривание.
- Разделить время ухаживания выше на общее время самец не сопряженным (т.е. не совокупляются) в тот же период времени. Например, если мужчина летать судов в течение 15 мин и помощников в течение 20 мин в течение первого часа, соотношение составляет 15 мин / (60 мин - 20 мин) = 0,375. Отношение показан как "Фракция nonmating время в ухаживании» в репрезентативных результатов.
- Использование локомоции анализа для оценки истощения
- Частично собрать 32-камера арены со всеми частями но контраст листа.
- Отберите один самец муха (ни одна женщина мух) в каждой из 32 камер в ухаживании арене.
- Фильм мух за ~ 10 мин с использованием стандартной потребительской видеокамеры.
- Отслеживание мух плагин MTrack2 в ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html~~HEAD=pobj).
7. Восстановление после Спаривание Drive 2-D сытости Пробирной
- Выполните сытость анализ 2-D, как описано в разделе 4, но аспирата самец улетает в конце анализа.
- Изолировать мужских мух при 23 ° С в течение требуемого количества дней.
- Выполните сытости анализ 2-D с восстановленными мужчин и оценка их вязки (т.е. совокуплений) всего за 1 час (см Представитель Результаты).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы охарактеризовать Drosophila сопрягаемой привод, 3-дневного возраста, WT Кантон-S самцы были протестированы в анализе на сытость 2-D. В течение анализа (4,5 ч), самцы спариваются в среднем 4,8 ± 0,3 (среднее ± стандартная ошибка среднего, SEM) раз. Спаривание инициируют в основном в течение первых 2 ч (78%) (рис 6А, 6В) и становятся менее частыми , поскольку анализ прогрессирует (рисунок 6А, 6В). Это уменьшение не из - за отсутствия брачных партнеров (74% самок остаются Разъединенные на протяжении всего анализа) или физической усталости (рис 6f). Скорее всего , этот эффект, вероятно , объясняется уменьшением ухаживания самца во время анализа, с 42,6 ± 8,0% (среднее ± SEM) (1 - й ч) до 2,0 ± 0,7% (среднее ± SEM) (последний час) от nonmating времени (фиг.6С). Это снижение в ухаживании также видно , когда самцы испытывают в брачных анализах с новыми женщинами (рис 6D, 6E) (рис 6G, 6H). Эти результаты показывают, что внутренне поддерживается спаривание привод у самцов мух могут быть сытым в сытости анализе 2-D и может восстанавливаться в течение долгого времени.
Анализ сытости 2-D также можно легко комбинировать с Drosophila нейронных манипуляций. Недавно мы сообщали , что thermogenetic стимуляция дофаминергических нейронов переворачивает спаривание привода в сытый мужчина мух 25. Использование 2-D сытости анализы, мы находим , что дофаминергическая стимуляция (TH> TRPA1, 28,5 ° C) в конце анализа сытости увеличился как ухаживание (рис 7A, 7C, красный) и совокупление (рисунок 7А, 7В, красный). Эффекты разворота не наблюдается с родительскими генотипами управления (Рисунок 7А - 7С, черный и серый). Все эти результаты согласуются с результатами недавнего исследования25 и показывают , что сытость анализ 2-Д, вместе с вспомогательными анализами (ухаживание и локомоции), может быть использован для рассекать молекулярных и нейрональные компоненты сопрягаемой привода.
Рисунок 1. Проектирование и монтаж Поведенческие Аренас. 8-камерные арена (используется для сытости анализов 2-D) состоит из 6 слоев , скрепленных накатанной гайки и винтов с шестигранной головкой (A). 32-камерный арена (используется для брачных анализов) производится аналогичным образом, но без пищи стены (слой 4). Арены части вырезаны с помощью лазерного резака и слои пронумерованы как (В) для 8-камеры и (С) для 32-камеры. Собранные 8-камерные арен приведены в (D) (вид спереди) и (E) (вид сбоку с пронумерованными слоями). Собранные 32-камерные арен , собранные подобным образом (F, G), но 4 -го уровня (пищевая стенка) опускается (G) , поскольку ни муха еда не на арене для ухаживания анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Подготовка 2-D сытости Assays с пищей. Стандартный дрозофилы пища помещают в микроволновых печах баночке с водой (A). Пища в микроволновой печи до тех пор , пока плавили (B). Затупленного наконечник пипетки (C, стрелка) используется для передачи пищи в камерах частично собранной поведенческой арене (D). Пища вновь затвердевает при температуре 4 ° С (Е) до поведенческого арены полностью собранном виде (F).пг "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Генерирующие Виргинские самок из w1118 (X) / HS-спрятанный (Y) Stock. Fly бутылки должно быть тепло в шоке , когда 50 - 80% от куколки uneclosed , как указано их непрозрачностью (A). На вставке изображения показаны образцы uneclosed (вверху) и eclosed (внизу) куколок (A). Бутылки взвешивали вниз и погружают в 37 ° C на горячей водяной бане в течение 1 ч с уровнем воды выше нижнего из бутылочных пробок , чтобы обеспечить равномерное нагревание (B). См черную стрелку в (А) для ватерлинии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Загрузка Мухи в поведенческой Арене. Аккуратно аспирата и удерживайте 15 - 20 самок в аспиратора (A). Наконечник пипетки используется для открытия вращающейся двери (В), и мух осторожно выпускают в камеру (С). С помощью аспиратора , чтобы закрыть вращающейся двери (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Выполнение и запись 2-D сытости анализа. (А) Стандартный потребитель видеокамера (а) используется для записи анализа в инкубатор до нужной температуры. Инкубатор содержит флягу воды (б) и детектор влажности (с), чтобы обеспечитьсоответствующий уровень влажности (> 30%). Подготовленный анализ сытости 2-D снят под видеокамерой (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Насыщение и восстановление фискального Спаривание Drive. В сытости анализе 2-D, самцы мух часто спариваются в течение первых 2 -х часов анализа (А, В) , но уменьшают их ухаживание (С) и вязки (В) , как анализ прогрессирует. Прогрессирующее снижение ухаживании сохраняется , когда самцы переносят в тесте ухаживании с новыми самками после завершения сытость анализа 2-D от 0 ч или 1 ч или от 4,5 ч (D, E). Красные стрелки указывают на мужчин, проявляющих ухаживания и спаривания поведения, в то время как оранжевый арстроки указывают на не-вязки, без ухаживания мух (A, D). Снижение сексуального поведения не является результатом физического истощения, так как самцы показывают эквивалентные уровни двигательной активности до и после сытости анализа 2-D (F). Мужчины постепенно восстанавливают свою спаривание (G) и уровни ухаживания (H) в течение 3 дней изоляции от самок. На этом рисунке, *** р <0,001, ** р <0,01, нс не имеет существенного значения для Т-тест (C, F) и одностороннего ANOVA с Тьюки послетестовом (E, G, H). N = 15 - 16 для каждого условия для всех экспериментов. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего (SEM). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Thermogenetic Сытость Сторно в Мале Мухи. Как и в стандартной 2-D сытости анализа, самцы демонстрируют снижение спариваний за время проведения эксперимента, но thermogenetic стимуляция дофаминергических нейронов (TH> TRPA1, красный), но не в родительском-контроль генотипы (черный и серый), спаривание диск восстанавливает в сытых самцов (А). Нет вязки не забил , когда ось Х разбивается в (А). Этот разворот сопрягаемой привода может быть определена количественно с использованием либо номера спаривание (В) или ухаживание (С). Числа Х-оси в (В) и (С) относятся к времени в (А). Оранжевый цвет фона указывает thermogenetic стимуляцию (А - С). На этом рисунке, *** р <0,001, не нс большое значение для взаимодействий между генотипом и температуры в двух направлениях ANOVA с Бонферрони послетестовом (B, C). N = 8 для каждого генотипа (В, С). Усы представляют собой SEM..jove.com / файлы / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Справочная Материал 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Справочная Материал 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мотивационные состояния могут быть сытым, поддерживается и отводили 34. Мы представляем анализ сытости 2-D, которая быстро и решительно измеряет все эти аспекты спаривание диска в лету. Этот анализ открывает возможность использования передовых мух генетические манипуляции для изучения молекулярных и схемы компонентов мотивированного поведения.
Анализ сытости зависит от способности самца успешно и судебную совокупиться, а также прекратить совокуплений в соответствующее время. Хотя hyposexual мухи суд менее, низкий ухаживание мухи не обязательно hyposexual; они могут, например, иметь проблемы с распознаванием или отслеживания самок 35. По этой причине, анализ сытости лучше всего подходит для тестирования гиперсексуальности, фенотип, который не может быть достоверно наблюдается в стандартном анализе ухаживания, потому что наивные мужчины дикого типа показывают индексы ухаживания приближающиеся 1. гиперсексуальности в сытости анализа шульд рассматриваться по отношению к возрасту мужчины, по нашему опыту, пожилые мужчины, как правило к спариванию несколько чаще, чем 3-дневных самцов, используемых здесь.
Мы использовали thermogenetic стимуляции дофаминергических нейронов, чтобы иллюстрировать нейрогенетических манипуляциям, которые могут быть использованы в этой системе, чтобы исследовать компоненты, лежащие в основе мотивации. Кроме того, исследователи могут также использовать thermogenetic стимуляцию на протяжении сытости анализа 2-D и искать гиперсексуальное мужчин, которые медленнее, чтобы достичь чувства насыщения. Конечно, сытость анализы также могут быть объединены с нейронными инструментов глушителей 36, 37, 38, оптогенетика генетические мутации 39, 40, 41, RNAi нокдаун 28, 42, 43, 44 и т.д.
Анализ сытости является доступным и масштабируемым. Каждая арена может быть изготовлена на сумму ~~~HEAD=poss~~number=plural 10 долларов США "материалов (плюс расходы лазерной резки, если таковые имеются) и занимает меньше места, чем книжка в мягкой обложке. Забив видео также является относительно простой задачей. Подготовленные экспериментатор может забить 4,5 часа видео с 8 самец летит в ~ 1,5 ч. Для получения более высокопроизводительного скрининга, можно забить только последний 2 часа, когда нормальные мухи показывают очень низкий уровень брачного привода. В качестве альтернативы, можно определить и проверить анализы каждые 30 минут, так как это будет захватить большую часть ~ 20 мин длиной спариваний.
Мы надеемся , что эта система будет широко адаптирована и будет способствовать появлению у дрозофилы в качестве мощной системы для раскрытия секретов мотивации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K12 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
1/8 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K42 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
3/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8560K219 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
1/32 inch black delrin | McMaster-Carr | 8575K132 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
Hex screws, 1 inch long (50x) | McMaster-Carr | 92314A115 | Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas. |
Thumb nuts (25x) | McMaster-Carr | 92741A100 | Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr). |
Camcorder | Canon | Vixia HF R700 | Can be replaced by any consumer comcorder. |
References
- Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
- Hall, J. C. Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).
- Luo, L.
Rho GTPases in neuronal morphogenesis. Nature reviews. Neuroscience. 1 (3), 173-180 (2000). - Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity. Cell. 101 (6), 671-684 (2000).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis. Cell. 75 (5), 827-830 (1993).
- Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121 (5), 795-807 (2005).
- Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior. Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).
- Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila. Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).
- Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster. Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).
- Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour. Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).
- Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain. Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).
- Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E.
Sexual dimorphism in the fly brain. Current biology. 20 (18), 1589-1601 (2010). - Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila. Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).
- Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice. eLife. 4, e11188 (2015).
- von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. Neuronal control of Drosophila courtship song. Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).
- Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila. eLife. 4, e08477 (2015).
- Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).
- Kohatsu, S., Yamamoto, D. Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state. Nature Communications. 6, 6457 (2015).
- Fan, P., Manoli, D. S., et al. Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species. Cell. 154 (1), 89-102 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate. Current Biology. 17, 599-605 (2007).
- Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).
- Pan, Y., Baker, B. S. Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila. Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).
- Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive. Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).
- Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism. The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).
- Sacks, O. W. Awakenings. , Vintage Books. New York. (1999).
- Dietzl, G., Chen, D., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila. Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).
- Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).
- Cook, R., Cook, A. The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet. Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).
- Toates, F. M. Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).
- Hall, J. C.
The mating of a fly. Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994). - Simpson, J. H. Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain. Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).
- Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
- Spradling, A. C., Stern, D., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).
- Parks, A. L., Cook, K. R., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).
- Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).
- Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
- Ni, J. Q., Zhou, R., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature. 8 (5), 405-407 (2011).