Summary
本文介绍了采用果蝇 melanogaste R以学习动机男性交配驱动器中的行为分析。利用这种方法，研究人员可以利用先进的飞神经源性技术来揭开背后这个动机的遗传，分子和细胞机制。
Abstract
尽管几十年的调查，动机状态的神经细胞和分子基础仍然神秘。我们最近开发了一种新型，还原，和可扩展的系统使用雄性果蝇 （果蝇）的交配驱动动机进行了深入调查，采用何种方法在这里，我们的细节。行为模式集中在雄性交配驱动器一起生育过多次交配的过程中减少并恢复了〜3天的发现。在这个系统中，在飞可用的有力神经源性工具收敛与遗传访问性和可用于性行为推定接线图。这种融合允许快速隔离和小神经元群体具有特定功能的动机审讯。在这里，我们详细地是，用于测量和在雄性苍蝇改变求偶动机的饱足感测定的设计和执行。使用此实验中，我们还表明，男性低交配驱动器可通过刺激多巴胺能神经元加以克服。饱腹法简单，价格适中，和强大的遗传背景的影响。我们预计饱腹感检测，以产生许多新的见解激励状态的神经生物学。
Introduction
在果蝇的工作提供了深刻的开拓洞察许多生物现象，包括基因1的性质，胚胎发育2，昼夜节律3，和神经系统4，5，6的发展和布线的原则。动机仍然因为上迄今已研究了系统的限制可能远不如比这些现象可知，。动机在飞主要研究了饥饿，它提出了许多挑战的背景下，由于每次喂食发作和外骨骼这就排除脂肪沉积明显的迹象了微乎其微的食物摄入量。因此，有必要扩大用于研究动机在飞的系统。
我们描述一个行为框架，配合驱动器的研究果蝇 。该系统以在飞以及辅助7，8，9，10，11，12和其性二态电路8,13的推定连接组优势的神经发生的工具。此外，许多先天的14，15，16，17，18，19，20，21和22的教训，23，24感觉运动电路控制求爱已详细制定出来，提供了一个难得的机遇找到赖以动机撞击的精确电路节点。我们最近报道，在飞，如在人类中，多巴胺水平是中央交配驱动装置25，26，27。我们已经获得了相关产生多巴胺和飞接受神经元，促进详细molecular-和电路级的遗传访问使用试验，我们在这里介绍25这种现象的保守分析。
我们添加到张某等人的行为分析。 25一个新的平行为竞技场，允许视频得分，我们称之为一个2维（2-D）的饱足感测定中，在以前的方法的一个重要的改进。因此，新的检测更可扩展性和可量化的，因此更适合参与积极性的基因和神经元的遗传筛选。我们使用这种新的检测，加上求爱分析和neurogeNETIC操作，演示了如何衡量和改变苍蝇交配的车程。
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Protocol
备注：本协议描述的准备（第1 - 3），执行（第4节），和分析的2-D饱足感检测（第4节）。然后，用多巴胺能刺激作为一个例子，第5显示了如何thermogenetic刺激的2-D饱足测定结合来诱导亢进。第6节说明3种方式来验证的2-D饱足感测定的结果。最后，第7展示了如何衡量雄蝇交配驱动器的恢复。
1.编造8位和32室行为阿里纳斯
注意：每个行为竞技场包括在每个四角（ 图1A）的由六角螺钉和拇指螺母保持在一起激光切割的塑料片材的几层。
- 制作的舞台上层。制造使用激光切割机切割亚克力吸塑给适当的形状床单每一层（ 见图1B，1C的产品）。
注意：许多研究institutioNS在他们的机器店或制造商的空间激光切割机。如果该机构有获得了激光切割机，继续以下步骤。如果不是，则按照步骤1.2代替说明书。- 对于每一层，打开激光切割机的软件设计模式。
注：该设计可以在适当命名的PDF文件中找到（ 例如 ，8商会竞技场- Doors.pdf - 2层 ）将用于补充材料1.本文件也包含塑料种类标注（ 如 1 / 8英寸（ 即 3.175毫米）透明丙烯酸）。每层的精确厚度不是关键的。主要要求是，让0.12英寸（3毫米）或更多的可用垂直空间中的腔室。 - 调整的类型和塑料厚度的激光设置（功率，焦点等 ）的使用。将塑料激光切割机的床和运行激光切割机。
注意：这些设置会差异很大，根据激光cutteR型和激光的强度。查找根据以往的经验或对废塑料制作试切适当的设置。深六角形版画都包含在设计休庭六角螺丝头。此功能允许单手收紧拇指坚果，让赛场休息平放在板凳上（不包括凸出的螺丝头）。尽管如此，使得深雕刻通常很难实现的，耗时的，使用激光切割机。这个步骤是可选的，并且可以在不影响行为的结果被跳过。 - 切割门框（第2层， 图1A）的时候，也可以使用适当的激光设置雕刻包括在设计中的室数（如在图1B，1C）。
- 对于每一层，打开激光切割机的软件设计模式。
- 将带有在线激光切割制造者的订单。上传所有的8位和/或32腔舞台上的PDF设计文件和指定材料类型（ 如 1/8英寸（ 即 3.175毫米）CLEAř丙烯酸）的基础上在文件中的注释。结果将显示， 如图1B（8-室舞台）和1C（32室舞台）。
- 装配使用四个六角螺钉和四个螺帽拇指对齐并保持塑料层（ 图1A）一起阿里纳斯。该场馆将出现如图1D，1E（8室）和图1F，1G（32室）。
注：食物壁（第4层中的图1A）仅用于二维饱足测定法和在32室舞台，其在求爱测定中使用被省略。
2.食品准备2-D饱分析
注：由于2-D饱足感检测跨越4.5小时，飞食品在舞台上用来提供营养和水分。该协议使用，但并不限于，常规玉米面琼脂飞食品。
- 部分组装的2-D饱腹感的舞台（8室）使用图层3 - 6（参见层分配图1A），并用拇指螺母，六角螺丝拧紧。
- 将新鲜飞食品到一个干净，微波安全瓶。添加刚好足够的水以覆盖瓶（ 图2A）的底表面。
- 微波食品高30 - 45秒。检查进度，搅拌每15秒，直到融化（ 图2B）。 警告！飞食品容易沸腾了。
- 使用钝1,000微升枪头（ 图2C），以慢慢转移〜1毫升融化食物进入各腔室（ 图2D）。
- 让食品完全组装舞台（ 图2F）之前在4℃再固化为〜10分钟（ 图2E）。
- 使用实验完成的舞台上（见第4节），或保存在4℃。
- 在4℃和再利用储存吃剩的食物。
3.准备处女的女性行为测定
注：2-D饱足感测定采用大量处女雌蝇（〜120 - 160一个完整的行为体育馆）难以用标准的方法来收集。本节将介绍如何使用Y染色体28，已在求偶化验25,29成功使用在HS-HID转基因的另一种方法。用于生成白眼处女雌股票有基因型w1118（X）/ HS-HID（Y）+ / + + / +（布卢明顿库存编号24638）。
- 倒装飞入一个新瓶一次20 -蛹的50％已eclosed（参见例如图3A）和有足够的男性（5 - 10）传播的库存。
- 热休克原瓶在37℃的热水浴1小时，充分激活HS-HID杀男性（ 图3B）。热休克后，只有女性会从这些瓶子E关闭，因此将保持处女，直到检测。
注：确保瓶子的四周均匀地加热（见水线图3A）。延长这段时间长达2小时，如果1小时是不够的安乐死所有男性。 - 隔离收集的女性至少3天实验之前，确保他们老得足以当性接受25，29。
注：Y染色体，男性少偶尔此股票产生。这些男性有白色的眼睛，而且不受热冲击，因为它们不包含HS-HID转基因。他们不能产生精子，因此，女性30不能减少感受性，31。
4.执行并打进2-D饱腹感化验
注意：控制男性的年龄蝇与年龄交配驱动变化是重要的。该协议使用了3个男性- 4日龄25
- 设置培养箱到所需的温度（ 例如 ，23℃的标准，RT实验）和湿度（> 30％）。对于没有孵化器的湿度控制，剩下的一杯水在孵化器就足够了。
- 放置一个2-D饱足测定舞台在培养箱中约30分钟以平衡温度，并防止在实验过程中在所述室凝结。旋转门应在打开位置。
- 使用飞抽吸32抽吸15 - 20处女的女性进入竞技场（ 图4）的各腔室。
注：重要的是，在女性和男性不麻醉上的同一天，在测定。根据我们的经验，这样做可能会影响女性的接受能力和男性的交配行为。 - 吸1男到每个室。
- 放置在孵化器加载的舞台上标准的消费摄像机（ 图5）和电影4.5小时以下。
- 通过记录当每个男性飞行开始和结束每一个交配（ 即交配）进球视频。此步骤可能是耗时的在第一。通过实践，我们可以在得分速度5倍或更高的视频。
注意：由于苍蝇在约23℃（在较高温度下的持续时间短）29相配合为〜20分钟，可以通过每个配合的前15分钟，脱脂。 - 记录所有交配次后，总结交配每个苍蝇的数量（见代表性的结果）。
- 使用所提供的代码生成行为谱。见参考文献2的代码，指令，和实施例的数据。
- 使用二氧化碳或低温环境中删除它们之前，麻醉苍蝇。
5.使用Thermogenetic操纵反向饱腹感的2-D饱腹感化验
注：此协议测试定义的神经元群的thermogenetic刺激是否能够克服饱腹感。实验FLIES表达对热敏感阳离子通道TRPA1神经元（UAS-TRPA1）的特定人群。下面的步骤适用于多巴胺能神经元（TH-Gal4的），它已显示出促进交配驱动25的刺激。这些步骤可以与其它神经元的司机一起使用，以发现，促进交配驱动其他人群。
- 到thermogenetically诱导交配行为在饱足苍蝇，增加温度在孵化器（ 例如 ，从23℃至28.5℃）在完成一个完整的4.5小时的2-D饱足实验之后。
- 孵化器达到所需的温度后，继续热刺激和得分男性的交配（ 即交配）1小时（见代表性的结果）。
注：刺激器的温度和长度可取决于基因型所以，有必要排除阻止神经元的过度刺激，同时还产生一个robu的最佳条件ST表型。
6.使用求爱和运动验证饱
注意：这部分描述3可用于验证的2-D饱测定结果可选方法。它们不是必需为每一个试验。
- 使用求爱实验来验证饱腹感。
- 吸一雄一雌处女到每个在求爱舞台上32室。
- 影片使用标准的消费者摄像机〜20分钟的苍蝇。
- 分数求爱指数（CI）量化求爱25;这是花了表演求偶行为（唱歌，以下等 ）时间超过5分钟的窗口交配（ 即交配）的比例。这个窗口从求偶行为的第一个实例开始。如果雄性苍蝇不会在第15分钟开始求爱，其CI是0朴素WT苍蝇应显示的CI大于0.9，而充分饱足苍蝇应具有的CI below 0.2。其他求爱措施也可考虑23,33。
- 在2-D饱试验得分求爱
- 得分超过的2-D饱足测定的时间段（ 例如 ，第一h）说明一个雄性苍蝇花费求爱的时间量。求爱被定义为执行仪式的任何步骤（唱歌，下面等 ）的男性。不像在第6.1.3节，这一步时间并不包括男性花费交配。
- 通过阳未在同一时间段配合（ 即不交尾）的总时间除以上述求偶时间。例如，如果一个男性飞15分钟法院和配合20分钟在第一小时，比为15分钟/（60分钟 - 20分钟）= 0.375。该比率显示为代表性的成果“nonmating求偶时的分数。”
- 利用运动检测以确定耗尽
- 部分组装32室内竞技场所有部分，但对比表。
- 吸一男飞（无雌蝇）到每一个求爱舞台上32室。
- 影片使用标准的消费者摄像机〜10分钟的苍蝇。
- 跟踪与ImageJ的（http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html）的MTrack2插件苍蝇。
7.经过2-D饱含量恢复配合驱动器
- 如在第4节中所述进行的2-D饱足测定法，但吸阳在测定结束飞出。
- 隔离雄蝇在23℃的天所需的号码。
- 与恢复男性执行2-D饱足感试验和评分的交配（ 即交配）只需1小时（见代表性的结果）。
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Representative Results
为了描述果蝇交配的车程，3日龄，广州WT-S男性被在2-D饱法检测。过测定（4.5小时）的过程中，雄性交配的4.8±0.3的平均（平均均值，SEM±标准误差）次。交配发起大多在最初2小时（78％）（ 图6A，6B）和变得较不频繁的测定法的进展（ 图6A，6B）。这种减少不是由于缺乏配合伙伴的（74％的女性在整个试验保持未配合）或肉体疲劳（ 图6F）。相反，这种影响很可能在男性的试验期间求爱的下降解释说，从42.6±8.0％（平均值±SEM）（1 日 h）至2.0±0.7％（平均值±SEM）的nonmating时间（最后一小时） （ 图6C）。这种下降在求爱也看到，当男性与女性的新求爱测定进行了测试（ 图6D，6E） 图6G，6H）隔离。这些结果表明，在雄蝇内部维护交配驱动器可以在一个2-D饱足感试验来饱足，并且可以随时间恢复。
二维饱足感测定还可以与果蝇神经操作很容易地结合。我们最近报道说，多巴胺能神经元的刺激thermogenetic逆转饱足交配雄性苍蝇驱动器25。使用2-D饱足感试验，我们发现，多巴胺能刺激（TH> TRPA1，28.5℃）在饱足测定结束增加两个求偶（ 图7A，7C，红色）和交配（ 图7A，图7B，红色）。逆转效果不与父母控制基因型（ - 7C，黑色和灰色图7A）观察。所有这些结果与最近的研究是一致的25表明2-D饱足感测定中，与辅助测定（求偶和运动）一起可用于解剖配合驱动的分子和神经元的部件。
图1.设计和组装行为阿里纳斯。 8室竞技场（用于2-D饱足感检测）由拇指螺母，六角螺丝（A）一起举行6层。一个32室竞技场（用于求爱测定）同样制造，但没有食品壁（4层）。竞技场部分用激光切割器切出的层编号为（B）的8-室和（C）为32室。组装-8-室竞技场示于（D）（正视图）和（E）（侧视图编号层）。以类似的方式组装组装32室竞技场（F， G），但第4层（食品墙）省略（G），因为没有飞食品是在竞技场求爱检测。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.准备食品的2-D饱腹感检测。标准果蝇食品被放置在一个微波安全罐用水（A）中 。食物被微波处理，直到融化（B）。钝枪头（C，箭头）用于食品转移到部分组装的行为竞技场（D）的腔室。食物在4°C（E）行为竞技场完全组装（F）之前重新凝固。PG“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：从w1118（X）/ HS-HID（Y）股票发电处女女性。飞瓶宜清热震惊，当50 -蛹的80％uneclosed其不透明性（A）所示。插图图像显示uneclosed（顶部）的样品和eclosed（底部）蛹（A）中。瓶称重下来，并在37℃的热水浴中浸没与水位1小时正上方的瓶塞的底部，以确保均匀加热（B）。见（A）为水线的黑色箭头。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：加载飞入一个行为的竞技场。轻轻吸并保持15 -在吸气（A）20女。枪头用于打开旋转门（B）和苍蝇轻轻释放到室（C）。使用吸气器以关闭旋转门（D）的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：表演和录制的2-D饱含量。 （A）标准的消费摄像机（一）用于记录设定所需温度孵化器的检测。培养箱中含有的水（B）的烧瓶和一个湿度检测器（C），以确保适宜的湿度水平（> 30％）。所制备的2-D饱腹感测定法摄像机（B）下拍摄的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：饱食和FY交配驱采收率。在一个2-D饱足感测定中，雄蝇中的前2小时内测定（A，B）的频繁配合但作为该测定的进行降低其求偶（C）和交配（B）中。当男性正在完成的0小时，或1小时，或4.5小时（D，E）的2-D饱腹感检测后，转移到新的雌性求爱法的求偶行为的逐步减少，保持不变。红色箭头指向参展求偶和交配行为的男性，而橙色AR行指向不匹配，非求爱苍蝇（A，D）。在性行为的下降是不是身体疲惫的结果，男性表现出前后2-D饱足感检测（F）后的自发活动的水平相等。男性逐渐恢复它们的交配（G）和求爱（H）水平以上的女性，从3天的隔离。在该图中，*** P <0.001，** P <0.01，NS对t检验（C，F），并与图基检测后（E，G，H）的单向方差分析不显著。 N = 15 - 16所有实验每个条件。误差棒代表平均值（SEM）的标准误差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：Thermogenetic饱逆转雄蝇。如在标准的2-D饱足感测定中，雄性显示在交配在实验的过程中的减少，但多巴胺能神经元的thermogenetic刺激（TH> TRPA1，红色），但不是在父母控制基因型（黑色和灰色），在恢复了男性酒足饭饱（A）相配合驱动器。当X轴（A）被破坏没有交配的得分。交配时，此光驱可以逆转使用要么交配号（B）或求爱（C）进行量化。在（B）和（C）的X轴的数字是指时间（A）中。橙色背景颜色表示thermogenetic刺激（A - C）。在该图中，*** P <0.001，NS不用于双向ANOVA和Bonferroni后检验（B，C）基因型和温度之间的相互作用显著。 N = 8的每个基因型（B，C）。误差棒表示SEM。.jove.com /文件/ ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
补充材料1. 请点击这里下载此文件。
补充材料2。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
动机状态可以满足，维护，并回收34。我们提出的2-D饱足测定迅速，鲁棒测量所有的在飞配合驱动器的这些方面。该测定中开辟了采用先进的飞基因操作来研究动机的行为的分子和电路元件的可能性。
饱腹感检测依赖于男性的能力，成功地法院和交配，并在适当的时候终止交配。虽然hyposexual苍蝇少法庭，低求爱苍蝇不一定hyposexual;他们可能，例如，具有难以识别或跟踪女35。出于这个原因，所述饱足感测定法是最适合的测试亢进，即不能在标准求偶测定可靠地观察到，因为幼稚野生型雄性显示求偶指数在饱足感测定SH接近1.性欲亢进的表型乌尔德被认为是相对于年龄的男性，在我们的经验，老年男性往往稍有更频繁地交配比这里所用的3日龄男性。
我们用多巴胺能神经元的thermogenetic刺激在举例，可以在该系统中用于调查潜在动机组件的神经遗传操纵。此外，研究人员还可以使用thermogenetic刺激整个2-D饱足感试验和寻找纵欲男性的速度较慢，达到饱腹感。当然，饱足感测定也可与神经元沉默工具36,37相结合，光遗传学38，基因突变39，40，41，RNAi敲低28，42，43，44， 等等。
饱腹法是负担得起的和可扩展性。每一个竞技场，可以制造的〜10美元的价值的材料（加上激光切割的成本，如果有的话），占地超过一本平装书的空间较小。进球视频也是一个相对简单的任务。 8男性在〜1.5小时飞行训练有素的实验者可以得分，4.5小时视频。对于更高通量筛选，可以分数只有最后2小时，当正常蝇显示配合驱动器的非常低的水平。或者，可以当场检查测定每30分钟，因为这将捕获大部分〜20分钟长的交配。
我们希望这一系统将被广泛地适应，并将有助于果蝇的出现为解锁动机的秘密强大的系统。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K12 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/8 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K42 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 3/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8560K219 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/32 inch black delrin | McMaster-Carr | 8575K132 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| Hex screws, 1 inch long (50x) | McMaster-Carr | 92314A115 | Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas. |
| Thumb nuts (25x) | McMaster-Carr | 92741A100 | Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr). |
| Camcorder | Canon | Vixia HF R700 | Can be replaced by any consumer comcorder. |
References
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