Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Измерение и изменяющий Спаривание Drive в Мале Published: February 15, 2017 doi: 10.3791/55291
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 3
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

В данной статье описывается поведенческий анализ , который использует мужской брачный диск в Drosophila melanogaste R для изучения мотивации. Используя этот метод, исследователи могут использовать методы нейрогенетических передовые летать, чтобы раскрыть генетические, молекулярные и клеточные механизмы, которые лежат в основе этой мотивации.

Abstract

Несмотря на десятилетия исследования, нейронные и молекулярные основы мотивационных состояний остаются тайной. Недавно мы разработали новый, редукционист и масштабируемую систему для глубокого изучения мотивации , используя матовую привод мужской дрозофилы (Drosophila), методы , для которых мы здесь подробно. Поведенческая парадигма сосредотачивается на обнаружении того, что самец спаривание диск уменьшается наряду с плодородие в течение повторных совокуплений и выздоравливает в течение ~ 3 d. В этой системе, мощные нейрогенетических инструменты, доступные в лету сходятся с генетической доступности и мнимого электросхема для сексуального поведения. Такая конвергенция позволяет осуществлять быструю изоляцию и опрос небольших популяций нейронов с определенными мотивационными функциями. Здесь мы подробно проектирование и выполнение анализа сытости, который используется для измерения и изменения мотивации ухаживания в мужском лету. С помощью этогоанализ, мы также показывают, что низкий спаривание привод самец может быть преодолена путем стимуляции дофаминергических нейронов. Анализ сытости является простым, доступным и устойчивым к воздействиям генетического фона. Мы ожидаем, что анализ сытости, чтобы генерировать много новое понимание нейробиологии мотивационных состояний.

Introduction

Работа в Drosophila обеспечила глубокую и новаторскую понимание многих биологических явлений, в том числе характер гена 1, принципы эмбрионального развития 2, 3 циркадных ритмов, а также разработка и подключение нервной системы 4, 5, 6. Мотивация остается гораздо менее понятны, чем эти явления, возможно, из-за ограничений на системы, которые были изучены до сих пор. Мотивация в лету, в первую очередь изучается в контексте голода, который создает много проблем в связи с их исчезающе малой потребляемой пищи на кормления бой и экзоскелет, чтобы исключить возможность явных признаков отложения жира. Следовательно, существует потребность в расширении систем, используемых для изучения мотивации в лету.

Мы описываем поведенческую основу для изучения сопрягаемой привода вДрозофилы. Эта система использует преимущества нейрогенетических инструментов в лету, а также доступность 7, 8, 9, 10, 11, 12 и мнимого Коннектом его половой диморфизм схемы 8, 13. Кроме того, большая часть врожденного 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 22 уроков, 23, 24 сенсомоторные схемы управления ухаживание была разработана в деталях, предоставляя уникальную возможностьЧтобы найти узел точную схему, на которой мотивация падающее. Мы недавно сообщили , что, в лету, как и у людей, уровень допамина играют центральную роль в сопрягаемой привода 25, 26, 27. Мы получили генетический доступ к соответствующему допамин-продуцирующих и приема нейронов в лету, что облегчает и детальной молекулярно - сеансового уровня анализа этого явления законсервированной с помощью анализов мы описываем здесь 25.

Добавим к поведенческим анализов в Zhang и соавт. 25 новая плоская поведенческая арена , которая позволяет видео скоринг, который мы называем анализ 2-мерный (2-D) сытости, значительное улучшение по сравнению с предыдущими методами. Следовательно, новый анализ является более масштабируемым и количественной оценке, и поэтому больше подходит для генетических экранов генов и нейронов, участвующих в мотивации. Мы используем этот новый анализ, вместе с ухаживания анализов и neurogeромагнитных манипуляции, чтобы продемонстрировать, как измерять и изменять ответная диск в лету.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Этот протокол описывает получение (разделы 1 - 3), исполнение (раздел 4), а также анализ (Раздел 4) сытости анализов 2-D. Затем, используя дофаминергической стимуляции в качестве примера, в разделе 5 показано, как сочетать thermogenetic стимуляцию с сытости анализов 2-D, чтобы вызвать гиперсексуальность. Раздел 6 описывает 3 способа проверки результатов анализов сытости 2-D. Наконец, в разделе 7 показано, как измерить восстановление сопрягаемой привода у самцов мух.

1. Металлообрабатывающее 8- и 32-камерных Поведенческие Аренас

Примечание: Каждая поведенческая арена состоит из нескольких слоев лазерной резки пластиковых листов , скрепленных с помощью винтов с шестигранной головкой и большим пальцем гайки на каждом из четырех углов (Рис . 1А)

  1. Изготовить слои арене. Изготовить каждый слой , используя лазерный резак , чтобы вырезать листы оргстекла к соответствующей формы (рис 1B, 1C для продуктов).
    Примечание: Многие исследования Institutioнс имеют лазерные резаки в своих механических мастерских или мейкера пространств. Если учреждение имеет доступ к лазерным резаком, продолжайте выполнять следующие шаги. Если нет, то следуйте инструкциям, приведенным в шаге 1.2 вместо этого.
    1. Для каждого слоя, откройте шаблон проектирования в программном обеспечении лазерного резака.
      Примечание: Проекты могут быть найдены в соответствующим названием PDF - файлов (например, 8-камерный Арена - Layer 2 - Doors.pdf) в дополнительного материала 1. Этот файл также содержит аннотации для типа пластика , которые будут использоваться (например, 1 / 8 дюймов (т.е. 3,175 мм) прозрачный акрил). Точная толщина каждого слоя не имеет решающего значения. Основным требованием является обеспечение 0,12 дюйма (3 мм) или более свободного вертикального пространства в камерах.
    2. Настройка параметров лазера (мощность, фокус и т.д.) для типа и толщины пластика , которые будут использоваться. Поместите пластик в отрезателя кровати лазерной и запустить лазерный резак.
      Примечание: Эти настройки будут широко варьироваться в зависимости от лазерного cutteг модель и сила его лазера. Найти подходящие настройки, основанные на прошлом опыте или путем сокращения испытаний на лома пластика. Глубокие шестигранные гравюр включены в конструкции с выемкой шестигранные головки винтов. Эта функция позволяет одной рукой закручивания гаек большого пальца и позволяет арен отдыхать плашмя на скамейке (без выступающих головок винтов). Тем не менее, делая глубокие гравюр часто бывает трудно достичь, и отнимает много времени, используя лазерный резак. Этот шаг является необязательным и может быть пропущен, не влияя на поведенческие результаты.
    3. При разрезании дверную раму (Layer 2, рисунок 1А), а также использовать соответствующие параметры лазера для гравировки число камер , включенных в проект (как показано на Рисунке 1B, 1C).
  2. Оформить заказ с онлайн-лазерной резки переработчиков. Загрузите все файлы дизайна PDF для 8- и / или 32-камерной арене и указать тип материала (например, 1/8 дюйма (т.е. 3,175 мм) КлиоR акрил) на основе аннотаций в файлах. Результаты будут выглядеть как на фигурах 1В (8-камера арены) и 1С (32-камерная арены).
  3. Сборка арен с помощью четырех шестигранных винтов и четыре пальца гайки , чтобы выровнять и скрепить пластиковых слоев (Рис . 1А) На аренах будет выглядеть как на рисунке 1D, 1E (8-камера) и рис 1F, 1G (32-камеры).
    Примечание: Пищевой стенка (слой 4 на рисунке 1А) используется только для 2-D сытости анализов и опускается в 32-камерных арен, которые используются в брачных анализах.

2. Приготовление еды для 2-D сытости Пробирной

Примечание: Поскольку сытость анализ 2-Д охватывает 4,5 часа, летучая пища используется на арене, чтобы обеспечить питание и воду. Этот протокол использует, но не ограничивается, обычный кукурузной муки-агар летать пищу.

  1. Частично собрать 2-D сытости арены (8-камеры) с помощью слоев 3 - 6(см рисунок 1А для уровня заданий) и затяните его с накатанной гайки и винтов с шестигранной головкой.
  2. Поместите свежую пищу муха в чистую, микроволновой безопасной бутылки. Добавить достаточно воды , чтобы покрыть нижнюю поверхность бутылки (фиг.2А).
  3. Микроволновая печь еды на высоко в течение 30 - 45 сек. Ход выполнения и перемешать каждые 15 сек , пока не растает (рис 2B). ВНИМАНИЕ! Fly еды легко выкипает.
  4. Используйте притупляются 1000 мкл кончиком пипетки (рис 2C) медленно передавать ~ 1 мл расплавляют пищи в каждую камеру (рис 2D).
  5. Дайте пище resolidify при температуре 4 ° С в течение ~ 10 мин (рис 2E) до полного сборки арены (рис 2F).
  6. Используйте заполненную арену для экспериментов (см раздел 4) или хранить при температуре 4 ° С.
  7. Храните остатки пищи при 4 ° С и повторного использования.

3. Подготовка Virgin самок для поведенческого Assays

Примечание: 2-D сытости анализы используют большое количество девственных самок мух (~ 120 - 160 для полной поведенческой арены), которые трудно собрать с помощью стандартных методов. В данном разделе описывается альтернативный подход с использованием HS-спрятанный трансгенов на Y - хромосоме 28, который успешно используется в брачных анализах 25, 29. Запас используется для генерации белоглазой девственные самок имеет генотип w1118 (X) / HS-спрятанный (Y); + / + + / + (Блумингтон инвентарный номер 24638).

  1. Флип летит в новую бутылку когда - то 20 - 50% от куколок eclosed (см рисунок 3А, например) и имеется достаточное количество мужчин (5 - 10) распространяющиеся запас.
  2. Теплового шока оригинальную бутылку в ванну 37 ° C для горячей воды в течение 1 ч , чтобы в достаточной степени активировать HS-СПРЯТАННОЕ убить самцов (фигура 3В). После теплового шока, только самки Эклоз из этих бутылок и так будет оставаться девственницей до тех пор,анализов.
    Примечание: Убедитесь , что все стороны бутылки равномерно нагревается (рис 3A для воды линии). Продлить на этот раз до 2 ч, если 1 ч не является достаточным, чтобы усыпить всех лиц мужского пола.
  3. Изолировать накопившиеся самок в течение по крайней мере 3 дней до экспериментов , чтобы убедиться , что они достаточно стар , чтобы быть сексуально восприимчивым 25, 29.
    Примечание: Y-хромосомы меньше мужчин иногда возникают из этого запаса. Эти самцы имеют белые глаза и не подвержены воздействию теплового шока, потому что они не содержат HS-газоразрядных трансгенов. Они не могут производить сперму и , следовательно , не может уменьшить восприимчивость у самок 30, 31.

4. Выполнение и Забив 2-D сытости Assays

Примечание: Важно контролировать возраст самцов мух как изменения спаривание привода с возрастом. Этот протокол использует мужчин, которые 3 - 4 d старый 25

  1. Установите инкубатор до нужной температуры (например, 23 ° C для стандартных, экспериментов RT) и влажности (> 30%). Для инкубаторах без контроля влажности, оставляя за собой чашку воды в инкубаторе достаточно.
  2. Поместите 2-D сытость анализа арена в инкубаторе в течение ~ 30 мин, чтобы уравновесить температуру и для предотвращения образования конденсата в камерах в процессе эксперимента. Вращающиеся двери должны быть в открытом положении.
  3. Используйте муха аспиратор 32 отсосать 15 - 20 девственных самок в каждую камеру арены (рисунок 4).
    Примечание: Важно, что женщины и мужчины не под наркозом в тот же день, что и анализа. По нашему опыту, это может повлиять на женскую и мужскую восприимчивостью брачное поведение.
  4. Отберите 1 самец в каждую камеру.
  5. Поместите загруженную арену в инкубаторе под стандартной потребительской видеокамеры (рисунок 5) и пленки в течение 4,5 ч.
  6. Оценка видео, отмечая , когда каждый самец летать начинается и заканчивается каждый сопряженный (т.е. совокупление). Этот шаг может занять много времени на первый взгляд. С практикой, можно забить видео на скорости 5х или выше.
    Примечание: Так как мухи спариваются в течение ~ 20 мин при температуре ~ 23 ° C ( более короткий срок при более высоких температурах) , 29, можно пролистать первые 15 мин каждого спариванию.
  7. После регистрации все время спаривания, суммировать количество спариваний для каждой мухи (см показательные результаты).
  8. Используйте предоставленный код для генерации ethogram. См Дополнительный материал 2 для кода, инструкции, и, например, данные.
  9. С помощью CO 2 или холодной температуры обезболить мух перед их удалением.

5. Использование Thermogenetic Манипуляции обратного сытости в 2-D сытости Assays

Примечание: Этот протокол проверяет, является ли thermogenetic стимуляция определенной популяции нейронов может преодолеть чувство насыщения. Экспериментальная FLIэс выразить термочувствительного катион канал TRPA1 в определенных популяциях нейронов (БАС-TRPA1). Перечисленные ниже шаги применимы к стимуляции дофаминергических нейронов (TH-Gal4), которые были показаны в целях содействия ответная привода 25. Эти шаги могут быть использованы в сочетании с другими нейронными водителей, чтобы обнаружить другие группы населения, которые способствуют ответная диск.

  1. Для того, чтобы побудить thermogenetically спаривание поведения в сытых мух, повышают температуру в инкубаторе (например, от 23 ° C до 28,5 ° C) после завершения полного 4,5 ч 2-D сытости эксперимент.
  2. После того , как инкубатор достигнет желаемой температуры, продолжайте тепловой стимуляции и оценка вязки (т.е.. Совокуплений) самцов в течение 1 ч (см Представитель Результаты).
    Примечание: Температура и продолжительность стимуляции может варьироваться в зависимости от генотипа, поэтому необходимо устранить оптимальные условия, которые мешают суперстимуляции нейронов в то время как по-прежнему производя Robuй фенотип.

6. Использование ухаживания и Locomotion для проверки сытости

Примечание: В этом разделе описываются 3 дополнительных методов, которые могут быть использованы для проверки результатов анализов сытости 2-D. Они не требуются для каждого теста.

  1. Используйте ухаживания анализы для проверки сытости.
    1. Отберите один мужчина и одна девственница в каждой из 32 камер в ухаживании арене.
    2. Фильм мух за ~ 20 мин с использованием стандартной потребительской видеокамеры.
    3. Оценка индекса ухаживания (CI) для количественной оценки ухаживание 25; это доля времени , потраченное на выполнение брачного поведения (пение, следуя, и т.д..) и спаривание (т.е. совокупление) над окном в 5 мин. Это окно начинается с первого экземпляра брачного поведения. Если мужчина муха не начинается ухаживание в первые 15 мин, его CI 0. Наивные WT мух должен показать CI больше 0,9, в то время как полностью сытым муха должна иметь CI бElow 0.2. Другие меры , ухаживания могут быть также рассмотрены 23, 33.
  2. Забив ухаживание в сытости анализах 2-D
    1. Оценка количества времени , что мужчина муха проводит ухаживания, в течение определенного периода времени сытости анализа 2-D (например, первый час). Ухаживание определяется как мужчина , выполняющего любой шаг ритуала (пение, после и т.д.). В отличие в разделе 6.1.3, этот шаг не включает в себя время самец тратит спаривание.
    2. Разделить время ухаживания выше на общее время самец не сопряженным (т.е. не совокупляются) в тот же период времени. Например, если мужчина летать судов в течение 15 мин и помощников в течение 20 мин в течение первого часа, соотношение составляет 15 мин / (60 мин - 20 мин) = 0,375. Отношение показан как "Фракция nonmating время в ухаживании» в репрезентативных результатов.
  3. Использование локомоции анализа для оценки истощения
    1. Частично собрать 32-камера арены со всеми частями но контраст листа.
    2. Отберите один самец муха (ни одна женщина мух) в каждой из 32 камер в ухаживании арене.
    3. Фильм мух за ~ 10 мин с использованием стандартной потребительской видеокамеры.
    4. Отслеживание мух плагин MTrack2 в ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html~~HEAD=pobj).

7. Восстановление после Спаривание Drive 2-D сытости Пробирной

  1. Выполните сытость анализ 2-D, как описано в разделе 4, но аспирата самец улетает в конце анализа.
  2. Изолировать мужских мух при 23 ° С в течение требуемого количества дней.
  3. Выполните сытости анализ 2-D с восстановленными мужчин и оценка их вязки (т.е. совокуплений) всего за 1 час (см Представитель Результаты).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того, чтобы охарактеризовать Drosophila сопрягаемой привод, 3-дневного возраста, WT Кантон-S самцы были протестированы в анализе на сытость 2-D. В течение анализа (4,5 ч), самцы спариваются в среднем 4,8 ± 0,3 (среднее ± стандартная ошибка среднего, SEM) раз. Спаривание инициируют в основном в течение первых 2 ч (78%) (рис 6А, 6В) и становятся менее частыми , поскольку анализ прогрессирует (рисунок 6А, 6В). Это уменьшение не из - за отсутствия брачных партнеров (74% самок остаются Разъединенные на протяжении всего анализа) или физической усталости (рис 6f). Скорее всего , этот эффект, вероятно , объясняется уменьшением ухаживания самца во время анализа, с 42,6 ± 8,0% (среднее ± SEM) (1 - й ч) до 2,0 ± 0,7% (среднее ± SEM) (последний час) от nonmating времени (фиг.6С). Это снижение в ухаживании также видно , когда самцы испытывают в брачных анализах с новыми женщинами (рис 6D, 6E) (рис 6G, 6H). Эти результаты показывают, что внутренне поддерживается спаривание привод у самцов мух могут быть сытым в сытости анализе 2-D и может восстанавливаться в течение долгого времени.

Анализ сытости 2-D также можно легко комбинировать с Drosophila нейронных манипуляций. Недавно мы сообщали , что thermogenetic стимуляция дофаминергических нейронов переворачивает спаривание привода в сытый мужчина мух 25. Использование 2-D сытости анализы, мы находим , что дофаминергическая стимуляция (TH> TRPA1, 28,5 ° C) в конце анализа сытости увеличился как ухаживание (рис 7A, 7C, красный) и совокупление (рисунок 7А, 7В, красный). Эффекты разворота не наблюдается с родительскими генотипами управления (Рисунок 7А - 7С, черный и серый). Все эти результаты согласуются с результатами недавнего исследования25 и показывают , что сытость анализ 2-Д, вместе с вспомогательными анализами (ухаживание и локомоции), может быть использован для рассекать молекулярных и нейрональные компоненты сопрягаемой привода.

Рисунок 1
Рисунок 1. Проектирование и монтаж Поведенческие Аренас. 8-камерные арена (используется для сытости анализов 2-D) состоит из 6 слоев , скрепленных накатанной гайки и винтов с шестигранной головкой (A). 32-камерный арена (используется для брачных анализов) производится аналогичным образом, но без пищи стены (слой 4). Арены части вырезаны с помощью лазерного резака и слои пронумерованы как (В) для 8-камеры и (С) для 32-камеры. Собранные 8-камерные арен приведены в (D) (вид спереди) и (E) (вид сбоку с пронумерованными слоями). Собранные 32-камерные арен , собранные подобным образом (F, G), но 4 -го уровня (пищевая стенка) опускается (G) , поскольку ни муха еда не на арене для ухаживания анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Подготовка 2-D сытости Assays с пищей. Стандартный дрозофилы пища помещают в микроволновых печах баночке с водой (A). Пища в микроволновой печи до тех пор , пока плавили (B). Затупленного наконечник пипетки (C, стрелка) используется для передачи пищи в камерах частично собранной поведенческой арене (D). Пища вновь затвердевает при температуре 4 ° С (Е) до поведенческого арены полностью собранном виде (F).пг "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Генерирующие Виргинские самок из w1118 (X) / HS-спрятанный (Y) Stock. Fly бутылки должно быть тепло в шоке , когда 50 - 80% от куколки uneclosed , как указано их непрозрачностью (A). На вставке изображения показаны образцы uneclosed (вверху) и eclosed (внизу) куколок (A). Бутылки взвешивали вниз и погружают в 37 ° C на горячей водяной бане в течение 1 ч с уровнем воды выше нижнего из бутылочных пробок , чтобы обеспечить равномерное нагревание (B). См черную стрелку в (А) для ватерлинии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Загрузка Мухи в поведенческой Арене. Аккуратно аспирата и удерживайте 15 - 20 самок в аспиратора (A). Наконечник пипетки используется для открытия вращающейся двери (В), и мух осторожно выпускают в камеру (С). С помощью аспиратора , чтобы закрыть вращающейся двери (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Выполнение и запись 2-D сытости анализа. (А) Стандартный потребитель видеокамера (а) используется для записи анализа в инкубатор до нужной температуры. Инкубатор содержит флягу воды (б) и детектор влажности (с), чтобы обеспечитьсоответствующий уровень влажности (> 30%). Подготовленный анализ сытости 2-D снят под видеокамерой (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Насыщение и восстановление фискального Спаривание Drive. В сытости анализе 2-D, самцы мух часто спариваются в течение первых 2 -х часов анализа (А, В) , но уменьшают их ухаживание (С) и вязки (В) , как анализ прогрессирует. Прогрессирующее снижение ухаживании сохраняется , когда самцы переносят в тесте ухаживании с новыми самками после завершения сытость анализа 2-D от 0 ч или 1 ч или от 4,5 ч (D, E). Красные стрелки указывают на мужчин, проявляющих ухаживания и спаривания поведения, в то время как оранжевый арстроки указывают на не-вязки, без ухаживания мух (A, D). Снижение сексуального поведения не является результатом физического истощения, так как самцы показывают эквивалентные уровни двигательной активности до и после сытости анализа 2-D (F). Мужчины постепенно восстанавливают свою спаривание (G) и уровни ухаживания (H) в течение 3 дней изоляции от самок. На этом рисунке, *** р <0,001, ** р <0,01, нс не имеет существенного значения для Т-тест (C, F) и одностороннего ANOVA с Тьюки послетестовом (E, G, H). N = 15 - 16 для каждого условия для всех экспериментов. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего (SEM). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7: Thermogenetic Сытость Сторно в Мале Мухи. Как и в стандартной 2-D сытости анализа, самцы демонстрируют снижение спариваний за время проведения эксперимента, но thermogenetic стимуляция дофаминергических нейронов (TH> TRPA1, красный), но не в родительском-контроль генотипы (черный и серый), спаривание диск восстанавливает в сытых самцов (А). Нет вязки не забил , когда ось Х разбивается в (А). Этот разворот сопрягаемой привода может быть определена количественно с использованием либо номера спаривание (В) или ухаживание (С). Числа Х-оси в (В) и (С) относятся к времени в (А). Оранжевый цвет фона указывает thermogenetic стимуляцию (А - С). На этом рисунке, *** р <0,001, не нс большое значение для взаимодействий между генотипом и температуры в двух направлениях ANOVA с Бонферрони послетестовом (B, C). N = 8 для каждого генотипа (В, С). Усы представляют собой SEM..jove.com / файлы / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Справочная Материал 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Справочная Материал 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мотивационные состояния могут быть сытым, поддерживается и отводили 34. Мы представляем анализ сытости 2-D, которая быстро и решительно измеряет все эти аспекты спаривание диска в лету. Этот анализ открывает возможность использования передовых мух генетические манипуляции для изучения молекулярных и схемы компонентов мотивированного поведения.

Анализ сытости зависит от способности самца успешно и судебную совокупиться, а также прекратить совокуплений в соответствующее время. Хотя hyposexual мухи суд менее, низкий ухаживание мухи не обязательно hyposexual; они могут, например, иметь проблемы с распознаванием или отслеживания самок 35. По этой причине, анализ сытости лучше всего подходит для тестирования гиперсексуальности, фенотип, который не может быть достоверно наблюдается в стандартном анализе ухаживания, потому что наивные мужчины дикого типа показывают индексы ухаживания приближающиеся 1. гиперсексуальности в сытости анализа шульд рассматриваться по отношению к возрасту мужчины, по нашему опыту, пожилые мужчины, как правило к спариванию несколько чаще, чем 3-дневных самцов, используемых здесь.

Мы использовали thermogenetic стимуляции дофаминергических нейронов, чтобы иллюстрировать нейрогенетических манипуляциям, которые могут быть использованы в этой системе, чтобы исследовать компоненты, лежащие в основе мотивации. Кроме того, исследователи могут также использовать thermogenetic стимуляцию на протяжении сытости анализа 2-D и искать гиперсексуальное мужчин, которые медленнее, чтобы достичь чувства насыщения. Конечно, сытость анализы также могут быть объединены с нейронными инструментов глушителей 36, 37, 38, оптогенетика генетические мутации 39, 40, 41, RNAi нокдаун 28, 42, 43, 44 и т.д.

Анализ сытости является доступным и масштабируемым. Каждая арена может быть изготовлена ​​на сумму ~~~HEAD=poss~~number=plural 10 долларов США "материалов (плюс расходы лазерной резки, если таковые имеются) и занимает меньше места, чем книжка в мягкой обложке. Забив видео также является относительно простой задачей. Подготовленные экспериментатор может забить 4,5 часа видео с 8 самец летит в ~ 1,5 ч. Для получения более высокопроизводительного скрининга, можно забить только последний 2 часа, когда нормальные мухи показывают очень низкий уровень брачного привода. В качестве альтернативы, можно определить и проверить анализы каждые 30 минут, так как это будет захватить большую часть ~ 20 мин длиной спариваний.

Мы надеемся , что эта система будет широко адаптирована и будет способствовать появлению у дрозофилы в качестве мощной системы для раскрытия секретов мотивации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K12 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/8 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K42 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
3/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8560K219 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/32 inch black delrin McMaster-Carr 8575K132 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
Hex screws, 1 inch long (50x) McMaster-Carr 92314A115  Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.
Thumb nuts (25x) McMaster-Carr 92741A100 Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).
Camcorder Canon Vixia HF R700 Can be replaced by any consumer comcorder.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).
  2. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
  3. Hall, J. C. Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).
  4. Luo, L. Rho GTPases in neuronal morphogenesis. Nature reviews. Neuroscience. 1 (3), 173-180 (2000).
  5. Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity. Cell. 101 (6), 671-684 (2000).
  6. Jan, Y. N., Jan, L. Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis. Cell. 75 (5), 827-830 (1993).
  7. Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121 (5), 795-807 (2005).
  8. Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior. Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).
  9. Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila. Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).
  10. Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster. Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).
  11. Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour. Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).
  12. Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain. Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).
  13. Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E. Sexual dimorphism in the fly brain. Current biology. 20 (18), 1589-1601 (2010).
  14. Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila. Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).
  15. Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice. eLife. 4, e11188 (2015).
  16. von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. Neuronal control of Drosophila courtship song. Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).
  17. Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila. eLife. 4, e08477 (2015).
  18. Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).
  19. Kohatsu, S., Yamamoto, D. Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state. Nature Communications. 6, 6457 (2015).
  20. Fan, P., Manoli, D. S., et al. Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species. Cell. 154 (1), 89-102 (2013).
  21. Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
  22. Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate. Current Biology. 17, 599-605 (2007).
  23. Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).
  24. Pan, Y., Baker, B. S. Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila. Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).
  25. Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive. Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).
  26. Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism. The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).
  27. Sacks, O. W. Awakenings. , Vintage Books. New York. (1999).
  28. Dietzl, G., Chen, D., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  29. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  30. Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila. Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).
  31. Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  32. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).
  33. Cook, R., Cook, A. The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet. Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).
  34. Toates, F. M. Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).
  35. Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994).
  36. Simpson, J. H. Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain. Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).
  37. Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  38. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  39. Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
  40. Spradling, A. C., Stern, D., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).
  41. Parks, A. L., Cook, K. R., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).
  42. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).
  43. Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  44. Ni, J. Q., Zhou, R., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature. 8 (5), 405-407 (2011).

Tags

Neuroscience выпуск 120 мотивация Спаривание диск, Дофамин ухаживание Поведение
Измерение и изменяющий Спаривание Drive в Мале<em&gt; Дрозофилы</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, … More

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, O., Zhang, S. X. Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (120), e55291, doi:10.3791/55291 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter