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Neuroscience

Medir e alterando Acasalamento Drive em Male Published: February 15, 2017 doi: 10.3791/55291
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 3
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Este artigo descreve um ensaio comportamental que utiliza a unidade de acasalamento dos machos em Drosophila melanogaste r para estudar motivação. Usando este método, os pesquisadores podem utilizar técnicas neurogenéticos mosca avançada para descobrir os mecanismos genéticos, moleculares e celulares que fundamentam essa motivação.

Abstract

Apesar de décadas de investigação, as bases neuronais e moleculares de estados motivacionais permanecem misteriosas. Recentemente, desenvolvemos um romance, reducionista e sistema escalável para investigação aprofundada de motivação usando a unidade de acasalamento dos machos Drosophila melanogaster (Drosophila), os métodos para as quais detalhes aqui. O paradigma comportamental centra-se na constatação de que a unidade de acasalamento dos machos diminui ao lado de fertilidade ao longo de cópulas repetidas e recupera mais ~ 3 d. Neste sistema, as poderosas ferramentas neurogenéticos disponíveis na mosca convergir com a acessibilidade genética e esquema de ligação putativo disponíveis para o comportamento sexual. Esta convergência permite o isolamento rápido e interrogatório de pequenas populações neuronais com funções motivacionais específicos. Aqui nós detalhe a concepção e execução do ensaio saciedade que é usado para medir e alterar a motivação corte na mosca masculino. usando esteensaio, que também demonstram que a baixa unidade de acasalamento dos machos pode ser superado através da estimulação neurónios dopaminérgicos. O ensaio de saciedade é simples, acessível e robusto às influências de fundo genético. Esperamos que o ensaio de saciedade para gerar muitos novos insights sobre a neurobiologia de estados motivacionais.

Introduction

Trabalho em Drosophila tem proporcionado uma visão profunda e pioneira em muitos fenómenos biológicos, incluindo a natureza do gene 1, os princípios do desenvolvimento embrionário 2, ritmos circadianos 3, bem como o desenvolvimento e a fiação do sistema nervoso 4, 5, 6. A motivação permanece bastante menos conhecidas do que estes fenómenos, talvez por causa das limitações dos sistemas que foram estudados até agora. A motivação da mosca é estudado principalmente no contexto de fome, que apresenta diversos desafios devido a sua ingestão de alimentos muito pequeno por ataque de alimentação e impede que exoesqueleto sinais evidentes de deposição de gordura. Por conseguinte, existe uma necessidade de expandir os sistemas utilizados para estudar a motivação em tempo real.

Nós descrevemos um quadro comportamental para o estudo da unidade de acasalamento emDrosophila. Este sistema tira vantagem das ferramentas neurogenéticos em tempo real, bem como a acessibilidade 7, 8, 9, 10, 11, 12 e o putativo conectoma de seus circuitos dimorfismo sexual 8, 13. Além disso, grande parte da inata 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e aprendeu 22, 23, 24 circuito sensório-motor namoro controle foi elaborado em detalhes, proporcionando uma rara oportunidadepara localizar o nó de circuito exato em que a motivação colide. Recentemente, relatou que, em tempo real, como nos seres humanos, os níveis de dopamina são centrais para a unidade de acoplamento 25, 26, 27. Ganhamos o acesso genética para o nível do circuito molecular-e detalhada e recebimento de neurônios na mosca, facilitando produtoras de dopamina relevantes análises deste fenómeno conservada utilizando os ensaios aqui descrita 25.

Nós adicionar aos ensaios comportamentais em Zhang et ai. 25 uma nova arena comportamental plana que permite pontuação de vídeo, que chamamos de um ensaio de saciedade 2-dimensional (2-D), uma importante melhoria em relação aos métodos anteriores. Consequentemente, o novo ensaio é mais escalável e quantificável e, portanto, mais adequado para telas genéticas de genes e de neurônios envolvidas na motivação. Usamos este novo ensaio, juntamente com ensaios de namoro e neurogemanipulações magnética, para demonstrar como medir e alterar unidade de acasalamento na mosca.

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Protocol

NOTA: Este protocolo descreve a preparação (Seções 1 - 3), execução (Seção 4), e análise (Seção 4) de ensaios de saciedade 2-D. Em seguida, utilizando estimulação dopaminérgica, como exemplo, a secção 5 mostra como combinar estimulação termogênico com ensaios de saciedade 2-D para induzir hipersexualidad. Secção 6 descreve 3 maneiras de verificar os resultados de ensaios de saciedade 2-D. Finalmente, a Seção 7 mostra como medir a recuperação da unidade de acasalamento em moscas macho.

1. Confecção de 8 e 32 câmaras Arenas Comportamentais

NOTA: cada arena comportamental consiste em diversas camadas de folhas de plástico cortadas a laser mantidas juntas por meio de parafusos e porcas sextavadas polegar em cada um dos quatro cantos (Figura 1A).

  1. Fabricar as camadas de arena. Fabricar cada camada utilizando um cortador laser para cortar folhas de plástico acrílico com a forma adequada (ver Figura 1B, 1C pelo produto).
    NOTA: Muitos institutio pesquisans tem cortadores de laser em suas lojas de máquinas ou espaços fabricante. Se a instituição tem acesso a um cortador de laser, continue com as seguintes etapas. Se não, então siga as instruções na etapa 1.2, em vez.
    1. Para cada camada, abra o padrão de design no software do cortador a laser.
      NOTA: Os desenhos podem ser encontrados em arquivos PDF apropriadamente nomeado (por exemplo, 8-Câmara Arena - Layer 2 - Doors.pdf) em material suplementar 1. Este arquivo também contém anotações para o tipo de plástico a ser utilizado (por exemplo, 1 / 8 polegadas (ou seja, 3,175 mm) acrílico). A espessura exacta de cada camada não é crítica. O principal requisito é permitir que 0,12 polegadas (3 mm) ou mais de espaço livre vertical nas câmaras.
    2. Ajuste as configurações de laser (energia, foco, etc.) para o tipo e espessura do plástico para ser usado. Coloque plástico na cama cortador de laser e executar o corte a laser.
      NOTA: Estas definições variam amplamente com base na cutte a laserModelo R e a força de seu laser. Encontrar as configurações adequadas com base na experiência do passado ou fazendo cortes de teste em sucata de plástico. As gravuras hexagonais profundas estão incluídas no projeto de recesso as cabeças dos parafusos hex. Este recurso permite que para o aperto de uma mão das porcas polegar e permite que as arenas para descansar plana no banco (sem salientes cabeças dos parafusos). No entanto, fazendo gravuras profundas é muitas vezes difícil de alcançar, e, usando um cortador a laser demorado. Este passo é opcional e pode ser ignorada sem afetar os resultados comportamentais.
    3. Ao cortar a moldura da porta (Layer 2, Figura 1A), também usam as configurações de laser adequadas para a gravura os números de câmara incluídos no projeto (como na Figura 1B, 1C).
  2. Coloque uma ordem com um fabricante de corte a laser online. Carregar todos os arquivos de projeto em PDF para a arena 8 e / ou 32 câmaras e especificar o tipo de material (por exemplo, 1/8 de polegada (ou seja, 3,175 mm) clear acrílico) com base nas anotações nos arquivos. Os resultados aparecerão como nas Figuras 1B (arena de 8 câmaras) e 1C (arena de 32 câmaras).
  3. Montar arenas usando quatro parafusos sextavados e quatro porcas polegar para alinhar e manter unidas as camadas de plástico (Figura 1A). As arenas aparece como na Figura 1D, 1E (8-câmara) e Figura 1F, 1G (32-câmara).
    NOTA: A parede de alimentos (Camada 4 na Figura 1A) é utilizado apenas para os ensaios de saciedade 2-D e é omitida em arenas 32-câmara, que são utilizados em ensaios de corte.

2. Preparação de Alimentos para 2-D Saciedade Assay

Observação: Uma vez que um ensaio de saciedade 2-D estende por 4,5 h, mosca alimentar é usado na arena para fornecer nutrição e água. Este protocolo utiliza, mas não se restringe a, a farinha de milho-agar convencional mosca alimentos.

  1. Parcialmente montar o 2-D arena de saciedade (8 câmaras) com camadas 3-6(veja a Figura 1A para atribuições de camadas) e aperte-o com nozes polegar e parafusos sextavados.
  2. Coloque os alimentos frescos fly em um frasco limpo, micro-ondas. Adicionar água suficiente para cobrir a superfície do fundo do frasco (Figura 2A).
  3. comida de microondas em alta por 30 - 45 s. Verificar o progresso e mexa a cada 15 s até derreter (Figura 2B). CUIDADO! alimentos voar ferve facilmente sobre.
  4. Usar um embotados-1000 uL ponta da pipeta (Figura 2C) para transferir lentamente ~ 1 mL derretido alimentos em cada uma das câmaras (Figura 2D).
  5. Permitir que o alimento resolidify a 4 ° C durante ~ 10 min (Figura 2E), antes de montar completamente na arena (Figura 2F).
  6. Use a arena concluída para experiências (ver Secção 4) ou armazenar a 4 ° C.
  7. Armazenar o alimento restante a 4 ° C e reutilização.

3. Preparar Virgens fêmeas para ensaios comportamentais

NOTA: 2-D ensaios de saciedade utilizar um grande número de moscas fêmeas virgens (~ 120 - 160 para uma arena comportamental cheio) que são difíceis de recolher, utilizando métodos convencionais. Esta seção descreve uma abordagem alternativa utilizando o transgene HS-HID no cromossoma Y 28, que tem sido utilizado com sucesso em ensaios de corte 25, 29. O estoque usado para gerar fêmeas virgens de olhos brancos tem o w1118 genótipo (X) / hs-HID (Y); + / +; + / + (Bloomington estoque número 24638).

  1. Virar voa em uma nova garrafa, uma vez 20 - 50% das pupas têm eclosed (veja a Figura 3A, por exemplo) e há bastante sexo masculino (5 - 10) para propagar as ações.
  2. Choque térmico a garrafa original em um banho de água quente a 37 ° C durante 1 h para activar suficientemente HS-HID para matar os machos (Figura 3B). Após o choque térmico, a apenas fêmeas Eclose destes frascos e assim permanecerá virgem até oensaios.
    NOTA: Certifique-se de todos os lados da garrafa são uniformemente aquecido (ver Figura 3A para a linha de água). Estender esse tempo para até 2 h se 1 h não é suficiente para sacrificar todos os homens.
  3. Isolar fêmeas coletadas por pelo menos 3 d antes de experiências para garantir que eles são velhos o suficiente para ser sexualmente receptiva 25, 29.
    NOTA: os machos cromossomo Y-menos ocasionalmente surgem a partir deste estoque. Estes machos têm olhos brancos e não são afetados pelo choque térmico, porque eles não contêm o transgene hs-HID. Eles não podem produzir esperma e, portanto, não pode diminuir a receptividade em mulheres de 30, 31.

4. A realização e marcando 2-D saciedade Ensaios

NOTA: É importante para controlar a idade do macho voa como alterações de unidade de acoplamento com a idade. Este protocolo usa machos que são 3-4 d velha 25

  1. Ajuste da incubadora para a temperatura desejada (por exemplo, 23 ° C durante padrão, experiências de RT) e humidade (> 30%). No caso de incubadoras sem controle de umidade, deixando um copo de água na incubadora é suficiente.
  2. Coloque um 2-D arena de ensaio de saciedade no incubador durante ~ 30 minutos para equilibrar a temperatura e para evitar a condensação nas câmaras durante o decurso da experiência. As portas rotativas deve estar na posição aberta.
  3. Use um aspirador de fly 32 para aspirar 15 - 20 fêmeas virgens em cada câmara da arena (Figura 4).
    NOTA: É importante que as fêmeas e machos não são anestesiados, no mesmo dia como o ensaio. Em nossa experiência, isso pode afetar a receptividade feminina e comportamento de acasalamento dos machos.
  4. Aspirar 1 macho em cada câmara.
  5. Coloque a arena carregado na incubadora sob uma câmara de vídeo de consumo normal (Figura 5) e a película durante 4,5 h.
  6. Pontuação vídeos observando quando cada macho mosca começa e termina cada (ou seja, a cópula) acasalamento. Este passo pode ser no primeiro demorado. Com a prática, pode-se marcar os vídeos com velocidade 5x ou superior.
    Observação: Uma vez que as moscas acasalar para ~ 20 min a ~ 23 ° C (duração mais curto a temperaturas mais elevadas) 29, pode-se percorrer os primeiros 15 minutos de cada acoplamento.
  7. Após o login todos os momentos de acasalamento, somar o número de acasalamentos para cada mosca (ver resultados representativos).
  8. Use o código fornecido para gerar um etograma. Ver material suplementar para o código 2, instruções e dados de exemplo.
  9. Use CO 2 ou temperatura fria para anestesiar as moscas antes de removê-los.

5. Usando a manipulação termogênico para inverter Saciedade em 2-D saciedade Ensaios

NOTA: Este teste de protocolo se a estimulação termogênico de uma população neuronal definido pode superar saciedade. O FLI experimentales expressam o canal de cátions sensível ao calor TRPA1 em populações definidas de neurónios (UAS-TRPA1). As etapas a seguir aplicam-se à estimulação dos neurónios dopaminérgicos (TH-Gal4), que foram mostrados para promover a unidade de acoplamento 25. Estes passos podem ser usados ​​em conjunto com os outros condutores neuronais para descobrir outras populações que promovem a unidade de acoplamento.

  1. Para induzir thermogenetically comportamentos de acoplamento em moscas saciados, aumente a temperatura na incubadora (por exemplo, a partir de 23 ° C a 28,5 ° C) depois de completar um 4,5 H 2-D experimento saciedade completa.
  2. Depois da incubadora atingir a temperatura desejada, continue a estimulação de calor e marcar os acasalamentos (ie. Cópulas) dos machos para 1 h (ver resultados representativos).
    NOTA: A temperatura e a duração da estimulação pode variar dependendo do genótipo por isso, é necessário solucionar as condições óptimas que impedem a sobre-estimulação dos neurónios, enquanto continua produzindo um Robufenótipo st.

6. Usando Courtship e locomoção para Verifique Saciedade

Nota: Esta secção descreve métodos de 3 opcionais que podem ser utilizados para verificar os resultados de ensaios de saciedade 2-D. Eles não são necessários para cada ensaio.

  1. Use ensaios de corte para verificar a saciedade.
    1. Aspirar um macho e uma fêmea virgem em cada uma das câmaras 32 numa arena de corte.
    2. Filmar as moscas para ~ 20 min, utilizando uma câmara de vídeo padrão.
    3. Pontuação do índice de namoro (CI) para quantificar o namoro 25; esta é a fração de tempo gasto na execução de comportamento de corte (cantando, seguindo, etc.) e acasalamento (ou seja, a cópula) ao longo de uma janela de 5 min. Esta janela começa a partir da primeira instância do comportamento de corte. Se uma mosca macho não iniciar corte nos primeiros 15 min, a sua IC é 0. moscas Naive WT deve mostrar um CI superior a 0,9, ao passo que uma mosca totalmente saciado deve ter um IC below 0,2. Outras medidas de corte também pode ser considerado 23, 33.
  2. Marcando o namoro em ensaios de saciedade 2-D
    1. Conseguir a quantidade de tempo que uma mosca macho passa cortejando, ao longo de um período de tempo de um ensaio de saciedade 2-D (por exemplo, o primeiro h). O namoro é definido como o macho de executar qualquer etapa do ritual (cantando, seguindo, etc.). Ao contrário no ponto 6.1.3, este passo não inclui o tempo o macho passa o acasalamento.
    2. Dividir o tempo de corte acima pelo tempo total do macho não foi acasalamento (ou seja, não copular) no mesmo período de tempo. Por exemplo, se um macho fazer cortes durante 15 min e companheiros durante 20 minutos ao longo da primeira hora, a proporção é de 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. A relação é mostrada como "Fração de nonmating tempo no namoro" em resultados representativos.
  3. Usando o ensaio de locomoção para avaliar exaustão
    1. Parcialmente montar o 32-Arena câmara com todas as peças, mas a folha de contraste.
    2. Aspirar uma mosca macho (sem moscas fêmeas) em cada uma das câmaras 32 numa arena de corte.
    3. Filmar as moscas para ~ 10 min, utilizando uma câmara de vídeo padrão.
    4. Acompanhe as moscas com o plugin MTrack2 em ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

7. Recuperando Acasalamento unidade depois de 2-D Saciedade Assay

  1. Realizar um ensaio de saciedade 2-D, tal como descrito na secção 4, mas aspirar o moscas macho no final do ensaio.
  2. Isolar as moscas macho a 23 ° C durante o número pretendido de dias.
  3. Realizar um ensaio de saciedade 2-D com os machos recuperados e marcar seus cruzamentos (ou seja, cópulas) por apenas 1 h (ver resultados representativos).

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Representative Results

Para caracterizar unidade de acoplamento de Drosophila, de 3 dias de idade, Canton WT-S machos foram testados num ensaio de saciedade 2-D. Durante o curso do ensaio (4,5 h), machos acasalam uma média de 4,8 ± 0,3 (média ± erro padrão da média, SEM) vezes. Acasalamentos iniciar principalmente nas primeiras 2 h (78%) (Figura 6A, 6B) e tornam-se menos frequentes como o ensaio avança (Figura 6A, 6B). Esta redução não é devido à falta de parceiros de acasalamento (74% do sexo feminino permanecem unmated ao longo do ensaio) ou fadiga física (Figura 6F). Pelo contrário, este efeito é provavelmente explicada por uma diminuição em corte do macho durante o ensaio, a partir de 42,6 ± 8,0% (média ± SEM) (1 r h) a 2.0 ± 0.7% (média ± SEM) (última hora) de tempo nonmating (Figura 6C). Este declínio no namoro também é visto quando os machos são testados em ensaios de namoro com novas fêmeas (Figura 6D, 6E) (Figura 6G, 6H). Estes resultados mostram que a unidade de acoplamento mantido internamente em moscas macho pode ser saciado em um ensaio de saciedade 2-D e podem recuperar com o tempo.

O ensaio de saciedade 2-D também pode ser facilmente combinado com as manipulações neurais de Drosophila. Nós informou recentemente que a estimulação termogênico dos neurónios dopaminérgicos inverte unidade de acasalamento no sexo masculino saciado voa 25. Utilizando ensaios de saciedade 2-D, descobrimos que a estimulação dopaminérgica (TH> TRPA1, 28,5 ° C), no final do ensaio de saciedade aumentada tanto corte (Figura 7A, 7C, vermelho) e a cópula (Figura 7A, 7B, vermelho). Os efeitos de reversão não são observados com genótipos de controlo parental (Figura 7A - 7C, preto e cinza). Todos estes resultados são consistentes com o estudo recente25 e sugerem que o ensaio de saciedade 2-D, juntamente com os ensaios de corte auxiliares (e locomoção), pode ser utilizado para dissecar os componentes moleculares e neuronais da unidade de acoplamento.

figura 1
Figura 1. concepção e montagem de Arenas comportamentais. Uma arena 8-câmara (utilizadas para ensaios de saciedade 2-D) consiste em 6 camadas unidas por porcas e parafusos sextavados polegar (A). Uma arena 32-câmara (utilizado para os ensaios de corte) é fabricado de forma semelhante, mas sem a parede a comida (camada 4). As partes de arena são cortadas com um cortador a laser e as camadas são numerados como (B) para 8-câmara e (C) para 32 câmaras. As arenas de 8 câmaras montadas são mostrados em (D) (vista frontal) e (E) (vista lateral com camadas numeradas). As arenas de 32 câmaras montadas montados de um modo semelhante (f, G), mas Camada 4 (parede de alimentos) é omitido (G) uma vez que nenhum alimento mosca é na arena para ensaios de corte. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Preparação de 2-D saciedade Os ensaios com os alimentos. Comida normal Drosophila é colocado em um frasco de micro-ondas com água (A). A comida é microondas até derreter (B). Uma ponta de pipeta embotada (C, seta) é usado para transferir alimentos de câmaras de uma arena comportamental parcialmente montada (D). A comida é re-solidificado a 4 ° C (E) antes da arena comportamental é completamente montada (F).pg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Gerando Virgens fêmeas da w1118 (X) / hs-HID (Y) Stock. Garrafas de voar deve ser de calor chocado quando 50-80% das pupas são uneclosed como indicado pela sua opacidade (A). A imagem ampliada mostra exemplos de uneclosed (parte superior) e eclosed (parte inferior) pupas (A). Os frascos são carregados e submersa em 37 ° C banho de água quente durante 1 h com o nível de água um pouco acima da parte inferior das rolhas de garrafa para assegurar uniformidade de aquecimento (B). Veja a seta preta no (A) para a linha de água. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"Figura Figura 4: Carregamento voa em uma Arena Comportamental. Aspirar cuidadosamente e mantenha 15 - 20 fêmeas na aspirador (A). A ponta da pipeta é utilizado para abrir a porta rotativa (B), e as moscas suavemente lançado para dentro da câmara (C). Use o aspirador para fechar a porta rotativa (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: tocar e gravar a 2-D Saciedade de Ensaio. (A) uma câmara de vídeo padrão (a) é utilizado para registar o ensaio num incubador ajustado para a temperatura desejada. A incubadora contém um frasco de água (b) e um detector de humidade (C) para assegurar anível de umidade adequada (> 30%). O ensaio de saciedade 2-D preparado é filmado sob a câmara de vídeo (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Saciação e Recuperação de Fy Acasalamento Drive. Num ensaio de saciedade 2-D, moscas macho mate frequentemente durante as primeiras 2 horas do teste (A, B), mas diminuir o seu namoro (C) e acasalamentos (B) como o ensaio avança. A diminuição progressiva no comportamento de corte é mantida quando os machos são transferidos para um ensaio de corte com fêmeas novas depois de completar um ensaio de saciedade 2-D de 0 h, 1 h, or ou 4,5 h (D, E). As setas vermelhas apontam para os machos exibem namoro e acasalamento comportamentos, enquanto laranja arlinhas apontar para não-acasalamento, as moscas não-namoro (A, D). O declínio no comportamento sexual não é um resultado da exaustão física, como machos mostram níveis equivalentes de actividade locomotora antes e depois do ensaio de saciedade 2-D (F). Os machos recuperar gradualmente seu acasalamento (G) e os níveis de corte (H) mais de 3 d do isolamento das fêmeas. Nesta figura, *** p <0,001, ** p <0,01, NS não significativo para o t-teste (C, F) e ANOVA de uma via com o pós-teste de Tukey (E, G, H). N = 15-16 para cada condição para todas as experiências. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7: termogênico Saciedade Reversão em Male moscas. Como no ensaio de saciedade 2-D padrão, machos mostram uma diminuição nos acasalamentos durante o decurso da experiência, mas a estimulação termogênico de neurónios dopaminérgicos (TH> TRPA1, vermelho), mas não em parental-controlo genótipos (preto e cinzento), repõe acasalamento unidade em homens saciados (a). Sem acasalamentos são marcados quando o eixo X é quebrado em (A). Esta inversão da unidade de acoplamento pode ser quantificada utilizando quer os números de acoplamento (B) ou corte (C). Números do eixo X em (B) e (C) referem-se ao tempo em (A). Cor de fundo laranja indica estimulação termogênico (A - C). Nesta figura, *** p <0,001, não NS significativo para interações entre genótipo e da temperatura em two-way ANOVA com Bonferroni pós-teste (B, C). N = 8 para cada genótipo (B, C). As barras de erro representam SEM..jove.com / files / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Material suplementar 1. Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.

Material suplementar 2. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

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Discussion

Estados motivacionais pode ser saciado, mantidos e recuperados 34. Nós apresentamos um ensaio de saciedade 2-D que rapidamente e de forma robusta mede todos esses aspectos do acasalamento unidade na mosca. Este ensaio abre-se a possibilidade de utilizar mosca avançada manipulações genéticas para estudar os componentes moleculares e um circuito de comportamento motivado.

O ensaio de saciedade confia na capacidade do homem para o tribunal com sucesso e copular, e para terminar cópulas no momento apropriado. Embora moscas tribunal hipossexuais menos, moscas baixa de corte não são necessariamente hipossexuais; eles podem, por exemplo, têm dificuldade em reconhecer ou rastrear as fêmeas 35. Por esse motivo, o ensaio de saciedade é mais adequado para hipersexualidad teste, um fenótipo que não pode ser observada de forma fiável em um ensaio padrão de corte, porque sem tratamento prévio com os machos de tipo selvagem mostram os índices de corte se aproximam 1. Hipersexualidade no ensaio SH saciedadeould ser considerado em relação à idade do sexo masculino em nossa experiência, os homens mais velhos tendem a acasalar um pouco mais frequentemente do que os 3 dias de idade machos usados ​​aqui.

Utilizou-se estimulação de neurónios dopaminérgicos termogênico para exemplificar as manipulações neurogenéticos que podem ser usados ​​neste sistema para investigar os componentes subjacentes motivação. Além disso, os pesquisadores também possível utilizar estimulação termogênico ao longo de um ensaio de saciedade 2-D e olhar para o sexo masculino hipersexuais que são mais lentos para atingir a saciedade. Claro, ensaios de saciedade também podem ser combinados com ferramentas de silenciamento neuronais 36, 37, 38, optogenética mutações genéticas 39, 40, 41, RNAi knockdown 28, 42, 43, 44, etc.

O ensaio de saciedade é acessível e escalável. Cada arena pode ser fabricado para o valor de materiais ~ 10 dólares norte-americanos "(mais os custos de corte a laser, se houver) e ocupa menos espaço do que um livro de bolso. Marcando os vídeos também é uma tarefa relativamente simples. Um pesquisador treinado pode marcar um 4,5 horas de vídeo com 8 do sexo masculino voa em ~ 1,5 h. Para mais rastreio de alto rendimento, pode-se marcar apenas o último 2 h, quando as moscas normais apresentam níveis muito baixos de unidade de acoplamento. Alternativamente, pode-se verificar no local os ensaios a cada 30 minutos, pois isso irá capturar a maioria dos ~ 20 acasalamentos mínimo de duração.

Esperamos que este sistema será amplamente adaptado e irá contribuir para o surgimento de Drosophila como um sistema poderoso para desvendar os segredos da motivação.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K12 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/8 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K42 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
3/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8560K219 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/32 inch black delrin McMaster-Carr 8575K132 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
Hex screws, 1 inch long (50x) McMaster-Carr 92314A115  Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.
Thumb nuts (25x) McMaster-Carr 92741A100 Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).
Camcorder Canon Vixia HF R700 Can be replaced by any consumer comcorder.

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References

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Neurociência Edição 120 Motivação acoplamento rígido, Dopamina corte comportamento
Medir e alterando Acasalamento Drive em Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em
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Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, … More

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, O., Zhang, S. X. Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (120), e55291, doi:10.3791/55291 (2017).

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