Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Måling og Ændre Parring Drive i Male Published: February 15, 2017 doi: 10.3791/55291
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 3
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel beskriver en adfærdsmæssig analyse der bruger mandlige parring drev i Drosophila melanogaste r at studere motivation. Ved hjælp af denne metode, kan forskerne udnytte avancerede flyve neurogenetic teknikker til at afdække de genetiske, molekylære og cellulære mekanismer der ligger til grund denne motivation.

Abstract

Trods årtiers efterforskning, de neuronale og molekylære grundlag for motiverende stater forbliver mystisk. Vi har for nylig udviklet en ny, reduktionistisk og skalerbare system til dybtgående undersøgelse af motivation ved hjælp af parring drevet af mandlige Drosophila melanogaster (Drosophila), de metoder, som vi detaljer her. Den adfærdsmæssige paradigme centre på den konstatering, at mandlige parring drev falder sammen fertiliteten i løbet af gentagne parringer og genopretter løbet ~ 3 d. I dette system, de kraftfulde neurogenetic værktøjer til rådighed i fluen konvergerer med den genetiske tilgængelighed og formodede ledningsdiagram til rådighed for seksuel adfærd. Denne konvergens muliggør hurtig isolation og forhør af små neuronale populationer med specifikke motiverende funktioner. Here We detalje projektering og udførelse af mæthed assay, der bruges til at måle og ændre frieri motivation i den mandlige flue. Brug af denneassay viser vi også, at lave mandlige parring drev kan overvindes ved at stimulere dopaminerge neuroner. Den mæthedsfornemmelse analysen er enkel og billig, og robust til påvirkninger af genetisk baggrund. Vi forventer, at mæthed assay til at generere mange nye indsigter i neurobiologi af motiverende stater.

Introduction

Arbejde i Drosophila har givet dybe og banebrydende indsigt i mange biologiske fænomener, herunder arten af genet 1, principperne for fosterudvikling 2, døgnrytmen 3, samt udvikling og ledningsføring af nervesystemet 4, 5, 6. Motivation er stadig langt mindre godt forstået end disse fænomener, måske på grund af de begrænsninger på de systemer, der er blevet undersøgt hidtil. Motivation i gylp primært undersøgt i forbindelse med sult, som rummer mange udfordringer på grund af deres forsvindende lille fødeindtagelse pr fodring Bout og exoskelet der udelukker åbenlyse tegn på fedtaflejring. Der er derfor et behov for at udvide de anvendte systemer til at studere motivation i gylp.

Vi beskriver en adfærdsmæssig ramme for studiet af parring drev iDrosophila. Dette system drager fordel af de neurogenetic værktøjer i gylp samt tilgængeligheden 7, 8, 9, 10, 11, 12 og den formodede connectome af sin seksuelt dimorfe kredsløb 8, 13. Desuden er meget af den medfødte 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 og lærte 22, 23, 24 sensorisk-motorisk kredsløb kontrollerende frieri er udarbejdet i detaljer, hvilket giver en sjælden mulighedat finde den nøjagtige kredsløb node hvorpå motivation rammer. Vi har for nylig rapporteret, at i fluen, som hos mennesker, dopamin niveauer er centrale for parring drev 25, 26, 27. Vi har fået genetisk adgang til den relevante dopamin-producerende og modtage neuroner i fluen, lette detaljerede molekylære mekanisme og kredsløb niveau analyser af denne bevaret fænomen ved hjælp af de analyser vi beskriver her 25.

Vi tilføjer til de adfærdsmæssige analyser i Zhang et al. 25 en ny flad adfærdsmæssige arena, der giver mulighed for video scoring, som vi kalder en 2-dimensional (2-D) mæthed assay, en vigtig forbedring i forhold til tidligere metoder. Følgelig den nye assay er mere skalerbar og målelig, og derfor mere egnet til genetiske skærme af gener og neuroner involveret i motivation. Vi bruger denne nye analyse, sammen med frieri assays og neurogetiske manipulationer, at vise, hvordan man kan måle og ændre parring drev i fluen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol beskriver fremstillingen (§§ 1 - 3), udførelse (afsnit 4), og analyse (afsnit 4) 2-D mæthed analyser. Derefter bruger dopaminerg stimulation som et eksempel, afsnit 5 viser, hvordan man kan kombinere thermogenetic stimulation med 2-D mæthed assays til at fremkalde hyperseksualitet. Afsnit 6 beskriver 3 måder at kontrollere resultaterne af 2-D mæthed analyser. Endelig, afsnit 7 viser hvordan man kan måle inddrivelse af parring drev i mandlige fluer.

1. Bearbejdning 8- og 32-kammer Adfærdsmæssige Arenas

BEMÆRK: Hver adfærdsmæssig arena består af flere lag af laser-cut plastplader holdes sammen af sekskantskruer og tommelfinger møtrikker på hvert af de fire hjørner (figur 1A).

  1. Fabrikere lagene af arenaen. Fabrikere hvert lag under anvendelse af en laserskærer at skære plader af akrylplast til den passende form (se figur 1B, 1C for produkter).
    BEMÆRK: Mange forskning Institutions har laserskærere i deres maskinværksteder eller maker rum. Hvis institutionen har adgang til en laserskærer, fortsætte med følgende trin. Hvis ikke, følg derefter anvisningerne i trin 1.2 i stedet.
    1. For hvert lag åbne mønster i laser cutter software.
      BEMÆRK: De designs kan findes i passende navngivne PDF-filer (f.eks 8-Chamber Arena - Lag 2 - Doors.pdf) til i supplerende materiale 1. Denne fil indeholder også anmærkninger for den type plast anvendes (fx 1 / 8 tommer (dvs. 3,175 mm) klar akryl). Den nøjagtige tykkelse af hvert lag er ikke kritisk. Det vigtigste krav er at give 0,12 inches (3 mm) eller mere fri lodret plads i kamrene.
    2. Justere indstillingerne laser (effekt, fokus, osv) for arten og tykkelsen af plast, der skal anvendes. Placer plastik i laserskærer seng og køre laser cutter.
      BEMÆRK: Disse indstillinger varierer meget baseret på laser Cutter model og styrken af ​​dens laser. Find relevante indstillinger baseret på tidligere erfaringer eller ved at gøre test nedskæringer på skrot plast. De dybe sekskantede graveringer indgår i designet til at Indbygningsniche hex skruehoveder. Denne funktion giver mulighed for én hånd stramning af tommelfinger nødder og tillader arenaerne at hvile fladt på bænken (uden fremspringende skruehoveder). Alligevel gør dybe graveringer er ofte svært at opnå, og tidskrævende, ved anvendelse af en laserskærer. Dette trin er valgfrit og kan springes uden at påvirke de adfærdsmæssige resultater.
    3. Ved skæring dørkarmen (Layer 2, figur 1A), bruger også passende laser indstillingerne for gravering kammeret numre i design (som i figur 1B, 1C).
  2. Placer en ordre med en online laserskæring fabrikator. Upload alle de PDF design filer til 8- og / eller 32-kammer arena og angiv materialetype (fx 1/8 tomme (dvs. 3,175 mm) clear acryl) baseret på anmærkninger i filerne. Resultaterne vises som i figur 1B (8-kammer arena) og 1C (32-kammer arena).
  3. Saml arenaer bruger fire sekskantskruer og fire tommelfinger nødder at tilpasse og holde sammen plastlagene (figur 1A). De arenaer vises som i figur 1D, 1E (8-kammer) og figur 1F, 1G (32-kammer).
    BEMÆRK: fødevarer væg (Layer 4 i figur 1A) anvendes til kun 2-D mæthed assays og er udeladt i 32-kammer arenaer, som anvendes i frieri assays.

2. Fødevarer Forberedelse 2-D Mæthed Assay

BEMÆRK: Da en 2-D mæthed assay spænder 4,5 timer, flyve fødevarer anvendes i arenaen at tilvejebringe ernæring og vand. Denne protokol anvender, men er ikke begrænset til, den konventionelle majsmelet-agar flyve mad.

  1. Delvist samle 2-D mæthed arena (8-kammer) med Layers 3. - 6.(se figur 1A for lag opgaver) og spænd den med tommelfinger nødder og sekskantskruer.
  2. Placer frisk flue mad i en ren, mikrobølgeovn-safe flaske. Fyld netop tilstrækkeligt vand til at dække den nederste overflade af flasken (figur 2A).
  3. Mikroovn mad på høj i 30 - 45 s. Check fremskridt og omrør hver 15 s, indtil smeltet (figur 2B). ADVARSEL! Flyve mad let koger over.
  4. Brug en afstumpet 1000-pi pipettespids (figur 2C) til langsomt overføre ~ 1 ml smeltet fødevarer ind i hvert kammer (figur 2D).
  5. Tillad mad til resolidify ved 4 ° C i ~ 10 minutter (figur 2E), før fuldstændig samling af arenaen (figur 2F).
  6. Brug den færdige arena for eksperimenter (se afsnit 4), eller opbevares ved 4 ° C.
  7. Opbevar madrester ved 4 ° C og genbrug.

3. Forberedelse Virgin Kvinder for Behavioral Analyser

BEMÆRK: 2-D mæthed analyser anvender et stort antal ubrugte kvindelige fluer (~ 120 - 160 for en fuld adfærdsmæssige arena), som er vanskeligt at indsamle anvendelse af standardmetoder. Dette afsnit beskriver en alternativ fremgangsmåde under anvendelse af hs-HID transgen på Y kromosom 28, som er blevet anvendt med succes i frieri assays 25, 29. Det materiel, der anvendes til at generere hvid-eyed jomfruelige hunner har genotypen w1118 (X) / hs-HID (Y); + / +; + / + (Bloomington lager nummer 24.638).

  1. Flip flyver ind i en ny flaske, når 20 - 50% af pupper har eclosed (se figur 3A for eksempel) og der er nok hanner (5 - 10) for at udbrede bestanden.
  2. Varmechok den originale flaske i et 37 ° C varmt vandbad i 1 time for tilstrækkelig aktivere hs-HID at dræbe hanner (figur 3B). Efter varmechok, kun hunner vil Eclose fra disse flasker og så vil forblive jomfru indtilassays.
    BEMÆRK: Sørg for at alle sider af flasken er jævnt opvarmet (se figur 3A for vand linje). Forlæng denne gang i op til 2 timer, hvis en time ikke er tilstrækkelig til at aflive alle mænd.
  3. Isoler indsamlede hunner i mindst 3 d før eksperimenter for at sikre, at de er gamle nok til at være seksuelt modtagelig 25, 29.
    BEMÆRK: Y-kromosom-færre hanner lejlighedsvis skyldes denne bestand. Disse mænd har hvide øjne og er upåvirket af varmechok, fordi de ikke indeholder hs-HID transgen. De kan ikke producere sæd og kan derfor ikke falde modtagelighed hos kvinder 30, 31.

4. Performing og Scoring 2-D Mæthed Analyser

BEMÆRK: Det er vigtigt at styre mandens alder fluer som parring drevet skifter med alderen. Denne protokol bruger mænd, der er 3 - 4 d old 25

  1. Indstil inkubatoren til den ønskede temperatur (f.eks 23 ° C i standard, RT eksperimenter) og luftfugtighed (> 30%). For væksthuse uden fugtstyring, der forlader en kop vand i inkubatoren er tilstrækkelig.
  2. Placer en 2-D mæthed assay arena i inkubatoren i ~ 30 min til ækvilibrering af temperaturen og forhindre kondensation i kamrene i løbet af forsøget. De roterende døre bør være i åben stilling.
  3. Brug en flue aspirator 32 at aspirere 15 - 20 jomfruelige hunner i hvert kammer i arenaen (figur 4).
    BEMÆRK: Det er vigtigt, at kvinder og mænd ikke bedøves på samme dag som assayet. Det er vores erfaring, kan gøre det påvirke kvindelige modtagelighed og mandlige parring adfærd.
  4. Aspirer 1 han i hvert kammer.
  5. Placer den fyldte arena i inkubatoren under en standard forbruger videokamera (figur 5) og film i 4,5 time.
  6. Score videoer ved at bemærke, når hver mandlige flyve starter og slutter hver parring (dvs. samleje). Dette trin kan være tidskrævende i første omgang. Med praksis, kan man score videoerne på 5x hastighed eller højere.
    BEMÆRK: Da fluer mate for ~ 20 min ved ~ 23 ° C (kortere varighed ved højere temperaturer) 29, kan man skimme de første 15 min for hver parring.
  7. Når du har logget alle parring gange, opsummere antallet af parringer for hver flue (se repræsentative resultater).
  8. Brug den medfølgende kode til at generere en ethogram. Se supplerende materiale 2 for koden, instruktion, og eksempel data.
  9. Brug CO 2 eller kold temperatur for at bedøve fluerne, før du fjerner dem.

5. Brug Thermogenetic Manipulation Reverse Mæthed i 2-D Mæthed Analyser

BEMÆRK: Denne protokol tester, om thermogenetic stimulering af en defineret neuronal population kan overvinde mæthed. Den eksperimentelle Flies udtrykke det varmefølsomme kationkanal TRPA1 i definerede populationer af neuroner (UAS-TRPA1). Trinene nedenfor gælder for stimulering af dopaminerge neuroner (TH-Gal4), som har vist sig at fremme parring drev 25. Disse trin kan anvendes sammen med andre neuronale drivere til at opdage andre populationer, der fremmer parring drev.

  1. Til thermogenetically inducere parring adfærd i mætte fluer, forøge temperaturen i inkubatoren (f.eks fra 23 ° C til 28,5 ° C) efter afslutning af en fuld 4,5 timer 2-D mæthed eksperiment.
  2. Efter inkubatoren når den ønskede temperatur, fortsætte varme stimulation og score de parringer (dvs.. Parringer) af hannerne i 1 time (se Repræsentative resultater).
    BEMÆRK: Temperaturen og længden af ​​stimulation kan variere afhængigt af genotypen så det er nødvendigt at foretage fejlfinding de optimale betingelser, der forhindrer overstimulering af neuroner, mens stadig producerer en Robust fænotype.

6. Brug bejlen og Locomotion at Bekræft Mæthed

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver 3 valgfrie metoder, der kan bruges til at verificere resultaterne af 2-D mæthed analyser. De er ikke påkrævet for hver assay.

  1. Brug frieri assays til at verificere mæthed.
    1. Aspirer en han og en jomfru kvinde i hver af de 32 kamre i en frieri arena.
    2. Film fluerne til ~ 20 min ved hjælp af en standard forbruger videokamera.
    3. Score frieri indeks (CI) for at kvantificere frieri 25; dette er den del af tid brugt udføre frieri adfærd (sang, efter, osv.) og parring (dvs. parring) over en 5 min vindue. Dette vindue starter fra den første forekomst af frieri adfærd. Hvis en mandlig flue ikke starter frieri i de første 15 min, sin CI er 0. Naïve WT fluer bør vise en CI større end 0,9, mens en fuldt mæt flue bør have en CI below 0,2. Kan også overvejes 23 andre frieri foranstaltninger, 33.
  2. Scoring frieri i 2-D mæthed analyser
    1. Score mængden af tid, som en mandlig flue tilbringer kur til, over et tidsrum af en 2-D mæthed assay (f.eks første h). Frieri er defineret som den mandlige udfører nogen trin af ritual (sang, efter, osv). I modsætning til i afsnit 6.1.3, er dette trin ikke omfatte tid hannen tilbringer parring.
    2. Opdel frieri tid ovenfor ved den samlede tid hannen blev ikke parring (dvs. ikke kopulerende) i samme periode. For eksempel, hvis en mandlig flyve retten på 15 min og hjælpere i 20 minutter over den første time, forholdet er 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. Forholdet er vist som "Fraktion af nonmating tid i frieri" i Repræsentative resultater.
  3. Brug af bevægelsesevne assay til at evaluere udmattelse
    1. Delvist samle 32-kammer arena med alle dele, men kontrasten ark.
    2. Aspirer en mandlig flue (ingen kvindelige fluer) i hver af de 32 kamre i en frieri arena.
    3. Film fluerne til ~ 10 min ved hjælp af en standard forbruger videokamera.
    4. Spor fluerne med MTrack2 plugin i ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

7. Gendannelse Parring Drive efter 2-D Mæthed Assay

  1. Udfør en 2-D mæthed assay som beskrevet i afsnit 4, men aspireres hannen flyver ud i slutningen af ​​assayet.
  2. Isolere de mandlige fluer ved 23 ° C i det ønskede antal dage.
  3. Udfør en 2-D mæthed assay med de gendannede hanner og score deres parringer (dvs. parringer) for kun 1 time (se Repræsentative resultater).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at karakterisere Drosophila parring drev, 3 dage gammel, WT Canton-S hanner blev testet i en 2-D mæthed assay. I løbet af assayet (4,5 timer), hanner parrer et gennemsnit på 4,8 ± 0,3 (middelværdi ± standardfejl på middelværdi, SEM) gange. Parringer indlede meste i de første 2 timer (78%) (figur 6a, 6b) og blive mindre hyppige som assayet skrider (figur 6A, 6B). Dette fald skyldes ikke mangel på parring partnere (74% kvinder forbliver frakobles hele assay) eller fysisk træthed (figur 6F). Snarere er denne effekt sandsynligvis forklares ved et fald i hannens frieri under analysen, fra 42,6 ± 8,0% (middel ± SEM) (1 st h) til 2,0 ± 0,7% (middel ± SEM) (sidste time) af nonmating tid (figur 6C). Faldet i frieri ses også når hannerne testes i frieri analyser med nye hunner (figur 6D, 6E) (figur 6G, 6H). Disse resultater viser, at internt vedligeholdt parring drev i mandlige fluer kan mæt i en 2-D mæthed assay og kan gendanne over tid.

Det 2-D mæthed analyse kan også let kombineres med Drosophila neurale manipulationer. Vi har for nylig rapporteret, at thermogenetic stimulering af dopaminerge neuroner vender parring drev i mæt mandlige fluer 25. Anvendelse af 2-D mæthed assays, finder vi, at dopaminerg stimulation (TH> TRPA1, 28,5 ° C) i slutningen af mæthed assayet steg både frieri (figur 7A, 7C, rød) og parring (figur 7A, 7B, rød). Tilbageførsel effekter er ikke observeret med forældrekontrol genotyper (Figur 7A - 7C, sort og grå). Alle disse resultater stemmer overens med en nylig undersøgelse25 og antyder, at 2-D mæthed assay, sammen med de hjælpestoffer assays (frieri og bevægelseskomponenter), kan anvendes til at dissekere molekylære og neuronale komponenter af parring drev.

figur 1
Figur 1. Design og montage adfærdsmæssige Arenas. En 8-kammer arena (bruges til 2-D mæthed assays) består af 6 lag holdes sammen af tommelfinger møtrikker og sekskantskruer (A). En 32-kammer arena (bruges til frieri assays) er fremstillet på lignende måde, men uden fødevarer væg (lag 4). Arenaen dele er skåret ud med en laserskærer, og lagene er nummereret som (B) i 8-kammer og (C) i 32-kammer. De forsamlede 8-kammer arenaer er vist i (D) (set forfra) og (E) (set fra siden med nummererede lag). De samlede 32-kammer arenaer samlet på en lignende måde (F, G), men Lag 4 (mad væg) udelades (G), da ingen flue fødevarer er i arena for frieri analyser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Forberedelse 2-D Mæthed Analyser med Food. Standard Drosophila fødevarer anbringes i en mikrobølgeovn-safe krukke med vand (A). Maden er microwaved indtil smeltet (B). En afstumpet pipettespids (C, pil) bruges til at overføre mad til kamre i en delvist samlet adfærdsmæssige arena (D). Fødevarer er re-størkner ved 4 ° C (E), inden den adfærdsmæssige arena er helt samlet (F).pg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Generering Virgin Hunner fra w1118 (X) / hs-HID (Y) lager. Fly flasker skal være varme chokeret, når 50 - 80% af den pupper er uneclosed som angivet ved deres uigennemsigtighed (A). Det indsatte billede viser prøver af uneclosed (øverst) og eclosed (nederst) pupper (A). Flasker er tynget og nedsænket i 37 ° C varmt vandbad i 1 time med vand niveau lige over bunden af flasken propper for at sikre jævn opvarmning (B). Se den sorte pil i (A) til vandlinien. Klik her for at se en større version af dette tal.

"Figur Figur 4: Loading Flies til en Behavioral Arena. Forsigtigt aspireres og hold 15 - 20 hunner i aspirator (A). Pipettespidsen bruges til at åbne den roterende dør (B), og fluerne forsigtigt frigives ind i kammeret (C). Brug aspiratoren at lukke den roterende dør (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Udførelse og Optagelse af et 2-D Mæthed analysen. (A) En standard forbruger videokamera (a) anvendes til at registrere assayet i en inkubator indstillet til den ønskede temperatur. Inkubatoren indeholder en kolbe af vand (b) og en fugtighed detektor (c) for at sikrepassende fugtighedsniveau (> 30%). Den forberedte 2-D mæthed assay er filmet under videokameraet (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: mæthed og Inddrivelse af Fy Parring Drive. I en 2-D mæthed assay mandlige fluer parrer ofte under de første 2 timer af assayet (A, B), men nedsætte deres frieri (C) og parringer (B) som assayet skrider frem. Den gradvise fald i frieri adfærd opretholdes, når mænd bliver overført til et frieri assay med nye hunner efter udløbet af en 2-D mæthed assay af 0 timer eller 1 time, eller 4,5 h (D, E). Røde pile peger på mænd udviser frieri og parring adfærd, mens appelsin arrækker peger på ikke-parring, ikke-kur til fluer (A, D). Faldet i seksuelle adfærd er ikke et resultat af fysisk udmattelse, da hannerne viser tilsvarende niveauer af bevægeapparatet aktivitet før og efter 2-D mæthed assay (F). Hannerne gradvist genvinde deres parring (G) og bejlen (H) niveauer i løbet af 3 d af isolation fra hunner. I denne figur *** p <0,001, ** p <0,01, NS ikke signifikant for t-test (C, F) og envejs ANOVA med Tukey post-test (E, G, H). N = 15 - 16 for hver tilstand for alle forsøg. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7: Thermogenetic Mæthed Tilbageførsel i Male Fluer. Som i standard 2-D mæthed assay hanner viser et fald i parringer i løbet af eksperimentet, men thermogenetic stimulering af dopaminerge neuroner (TH> TRPA1, rød), men ikke i parentale-kontrol genotyper (sort og grå), genindsætter parring drev i mætte hanner (A). Ingen parringer er scoret når X-aksen er brudt i (A). Denne vending af parring drev kan kvantificeres ved hjælp af enten parring tal (B) eller frieri (C). X-akse Tallene i (B) og (C) henviser til anden i (A). Orange farve baggrund angiver thermogenetic stimulation (A - C). I denne figur *** p <0,001, NS ikke signifikant for interaktioner mellem genotype og temperatur i to-vejs ANOVA med Bonferroni post-test (B, C). N = 8 for hver genotype (B, C). Fejl- søjler repræsenterer SEM..jove.com / filer / ftp_upload / 55.291 / 55291fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende materiale 1. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende materiale 2. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Motiverende stater kan mæt, vedligeholdes, og genvundet 34. Vi præsenterer en 2-D mæthed assay, der hurtigt og håndfast måler alle disse aspekter af parring drev i fluen. Dette assay åbner mulighed for at anvende avancerede flyve genetiske manipulationer for at studere de molekylære og kredsløbskomponenter i en motiveret adfærd.

Den mæthed analysen er afhængig af mandens evne til at retten og parre sig, og for at afslutte parringer på et passende tidspunkt. Selvom hyposeksuelle fluer domstol mindre, lav-frieri fluer er ikke nødvendigvis hyposeksuelle; kan de for eksempel har problemer med at genkende eller sporing hunnerne 35. Af denne grund er den mæthed assayet er bedst egnet til testning hyperseksualitet en fænotype, der ikke pålideligt kan observeres i en standard frieri assay fordi naive vildtype-hanner viser frieri indekser nærmer 1. hyperseksualitet i mæthed assay shOuld betragtes i forhold til alder af mandlige-vores erfaring, ældre mænd har tendens til at parre lidt hyppigere end de 3 dage gamle hanner bruges her.

Vi anvendte thermogenetic stimulering af dopaminerge neuroner til at eksemplificere de neurogenetic manipulationer, der kan anvendes i dette system for at undersøge komponenterne underliggende motivation. Desuden kan forskerne også bruge thermogenetic stimulation gennem en 2-D mæthed assay og kigge efter hyperseksuelle hanner, der er langsommere til at nå mæthed. Selvfølgelig kan mæthed assays også kombineres med neuronale lyddæmpende værktøjer 36, 37, optogenetics 38, genetiske mutationer 39, 40, 41, RNAi knockdown 28, 42, 43, 44, etc.

Den mæthedsfornemmelse analysen er overkommelig og skalerbar. Hver arena kan fremstilles for ~ 10 dollars værd af materialer (plus laserskæring omkostninger, hvis nogen) og optager mindre plads end en paperback bog. Scoring videoerne er også en forholdsvis enkel opgave. En uddannet forsøgslederen kan score en 4,5 h video med 8 mandlige fluer i ~ 1,5 time. For mere højkapacitetsscreening, kan man score kun det sidste 2 timer, når normale fluer viser meget lave niveauer af parring drev. Alternativt kan man stikprøvekontrol assayene hver 30 min, da dette vil opfanger størstedelen af ​​de ~ 20 min lange parringer.

Vi håber, at dette system vil blive bredt tilpasset og vil bidrage til fremkomsten af Drosophila som et kraftfuldt system til oplåsning hemmelighederne af motivation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K12 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/8 inch clear acrylic McMaster-Carr 8589K42 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
3/16 inch clear acrylic McMaster-Carr 8560K219 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/32 inch black delrin McMaster-Carr 8575K132 Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
Hex screws, 1 inch long (50x) McMaster-Carr 92314A115  Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.
Thumb nuts (25x) McMaster-Carr 92741A100 Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).
Camcorder Canon Vixia HF R700 Can be replaced by any consumer comcorder.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).
  2. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
  3. Hall, J. C. Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).
  4. Luo, L. Rho GTPases in neuronal morphogenesis. Nature reviews. Neuroscience. 1 (3), 173-180 (2000).
  5. Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity. Cell. 101 (6), 671-684 (2000).
  6. Jan, Y. N., Jan, L. Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis. Cell. 75 (5), 827-830 (1993).
  7. Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121 (5), 795-807 (2005).
  8. Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior. Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).
  9. Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila. Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).
  10. Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster. Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).
  11. Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour. Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).
  12. Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain. Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).
  13. Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E. Sexual dimorphism in the fly brain. Current biology. 20 (18), 1589-1601 (2010).
  14. Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila. Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).
  15. Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice. eLife. 4, e11188 (2015).
  16. von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. Neuronal control of Drosophila courtship song. Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).
  17. Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila. eLife. 4, e08477 (2015).
  18. Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).
  19. Kohatsu, S., Yamamoto, D. Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state. Nature Communications. 6, 6457 (2015).
  20. Fan, P., Manoli, D. S., et al. Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species. Cell. 154 (1), 89-102 (2013).
  21. Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
  22. Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate. Current Biology. 17, 599-605 (2007).
  23. Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).
  24. Pan, Y., Baker, B. S. Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila. Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).
  25. Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive. Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).
  26. Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism. The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).
  27. Sacks, O. W. Awakenings. , Vintage Books. New York. (1999).
  28. Dietzl, G., Chen, D., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  29. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  30. Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila. Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).
  31. Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  32. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).
  33. Cook, R., Cook, A. The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet. Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).
  34. Toates, F. M. Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).
  35. Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994).
  36. Simpson, J. H. Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain. Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).
  37. Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  38. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  39. Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
  40. Spradling, A. C., Stern, D., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).
  41. Parks, A. L., Cook, K. R., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).
  42. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).
  43. Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  44. Ni, J. Q., Zhou, R., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature. 8 (5), 405-407 (2011).

Tags

Neuroscience Motivation Parring drev, Dopamin bejlen Behavior
Måling og Ændre Parring Drive i Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, … More

Boutros, C. L., Miner, L. E., Mazor, O., Zhang, S. X. Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (120), e55291, doi:10.3791/55291 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter