Summary
Den här artikeln beskriver en beteendeanalys som använder manlig parning enhet i Drosophila melanogaste r att studera motivation. Med den här metoden kan forskarna använda avancerad flyga neurogenetiska metoder för att avslöja de genetiska, molekylära och cellulära mekanismer som ligger bakom denna motivation.
Abstract
Trots decennier av undersökning, de neuronala och molekylära grunden för motiverande stater förblir mystisk. Vi har nyligen utvecklat en ny, reduktionistisk och skalbart system för fördjupad undersökning av motivation att använda parnings enhet av manliga Drosophila melanogaster (Drosophila), de metoder som vi detalj här. Beteende paradigmet kretsar kring upptäckten att manliga parning enhet minskar tillsammans fertilitet under loppet av upprepade kopulationer och återvinner över ~ 3 d. I detta system, de kraftfulla neurogenetiska verktyg som finns i farten konvergerar med den genetiska tillgänglighet och förmodade kopplingsschema för sexuellt beteende. Denna konvergens medger snabb isolering och förhör av små neuronala populationer med specifika motiverande funktioner. Här har vi detalj utformning och utförande av mättnadsanalys som används för att mäta och ändra uppvaktning motivation i den manliga flyga. Med användning av dennaanalysen visar vi också att låga manliga parning enhet kan övervinnas genom att stimulera dopaminerga neuroner. Den mättnadsanalysen är enkel, prisvärd och robust för påverkan av genetisk bakgrund. Vi förväntar oss att mättnadsanalys för att generera många nya insikter i neurobiologi motiverande stater.
Introduction
Arbetet i Drosophila har gett djup och banbrytande insikt i många biologiska fenomen, inklusive vilken typ av gen 1, principerna för embryonal utveckling 2, dygnsrytmen 3, samt utveckling och ledningar av nervsystemet 4, 5, 6. Motivation är långt mindre väl förstått än dessa fenomen, kanske på grund av de begränsningar på de system som har studerats hittills. Motivation i farten främst studeras i samband med hunger, vilket innebär många utmaningar på grund av deras försvinnande liten födointag per utfodring skjutningen och exoskelett som utesluter uppenbara tecken på fettlagring. Följaktligen finns det ett behov av att expandera de system som används för att studera motivation i flugan.
Vi beskriver en beteende ram för att studera parnings enhet iDrosophila. Detta system drar fördel av de neurogenetiska verktyg i farten samt tillgängligheten 7, 8, 9, 10, 11, 12 och den förmodade connectome av dess sexually dimorphic kretsarna 8, 13. Dessutom mycket av det medfödda 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 och lärt 22, 23, 24 sensomotorisk kretsar som styr uppvaktningen har arbetats fram i detalj, vilket ger en sällsynt möjlighetatt lokalisera den exakta kretsnod på vilken motivation träffar. Vi rapporterade nyligen att, i farten, som hos människor, dopaminnivåer är centrala för parning enhet 25, 26, 27. Vi har fått genetisk tillgång till relevant dopaminproducerande och ta emot nervceller i farten, vilket underlättar detaljerad molekylär- och kretsnivå analyser av denna bevarade fenomen med hjälp av analyser vi beskriver här 25.
Vi lägger till beteendemässiga analyser i Zhang et al. 25 en ny platt beteende arena som tillåter video poäng, som vi kallar en två-dimensionell (2-D) mättnad analys en viktig förbättring jämfört med tidigare metoder. Följaktligen är den nya analysen mer skalbar och mätbar, och därför mer lämpade för genetiska skärmar gener och neuroner som är involverade i motivation. Vi använder denna nya analys, tillsammans med uppvaktning analyser och neurogetiska manipulationer, för att visa hur man mäter och ändra parning enhet i farten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll beskriver framställningen (avsnitt 1 - 3), utförande (avsnitt 4), och analys (avsnitt 4) 2-D mättnad analyser. Sedan, med hjälp dopaminerg stimulering som ett exempel, visar Avsnitt 5 hur man kombinerar thermogenetic stimulering med 2-D-mättnadsanalyser för att inducera hyper. § 6 beskriver 3 sätt att kontrollera resultaten av 2-D mättnad analyser. Slutligen, Avsnitt 7 visar hur man mäter återhämtning av parnings enhet i manliga flugor.
1. Förfalskning 8- och 32-kammar Behavioral Arenas
OBS: Varje beteende arena består av flera skikt av laserskurna plastark hålls samman av insexskruvarna och vingmuttrar på vart och ett av de fyra hörnen (Figur 1A).
- Fabricera skikten av arenan. Fabricera varje skikt med hjälp av en laser-skärare för att skära skivor av akrylplast till lämplig form (se figur 1B, 1C för produkter).
OBS: Många forsknings Institutions har laserskärare i sina verkstäder eller kokare utrymmen. Om institutet har tillgång till en laserskärare, fortsätta med följande steg. Om inte, följ sedan instruktionerna i steg 1,2 i stället.- För varje skikt, öppnar designmönster i laserskärare mjukvara.
OBS! Designer kan finnas i lämpligt namngivna PDF-filer (t.ex. 8-avdelningen Arena - Nivå 2 - Doors.pdf) i kompletterande material 1. Denna fil innehåller också anteckningar för den typ av plast som ska användas (t.ex. en / 8 tum (dvs 3,175 mm) klar akryl). Den exakta tjockleken hos varje skikt är inte kritiskt. Det viktigaste kravet är att låta 0,12 inches (3 mm) eller mer av fritt vertikalt utrymme i kamrarna. - Justera laserinställningar (makt, fokus, etc.) för den typ och tjocklek av plast som ska användas. Placera plast i laserskärare sängen och kör laserskärare.
OBS: dessa inställningar varierar kraftigt baserat på laser cutter modell och styrkan i dess laser. Finna lämpliga inställningar baserat på tidigare erfarenheter eller genom att göra prov nedskärningar på skrot plast. De djupa hexagonala gravyrer ingår i utformningen urtaget de hex skruvskallarna. Denna funktion gör det möjligt att med en hand åtdragning av vingmuttrar och tillåter arenor att vila platt på bänken (utan utskjutande skruvhuvuden). Ändå gör djupa gravyrer är ofta svårt att uppnå, och tidskrävande, med hjälp av en laserskärare. Detta steg är valfritt och kan hoppas över utan att påverka beteende resultat. - När du skär av dörrkarmen (Layer 2, Figur 1A), använder också lämpliga inställningar laser för gravering kammar nummer som ingår i konstruktionen (som i figur 1B, 1C).
- För varje skikt, öppnar designmönster i laserskärare mjukvara.
- Placera en order med en online-laserskärning Fabricator. Ladda alla PDF designfiler för 8- och / eller 32-kammar arena och ange materialtypen (t ex 1/8 tum (dvs 3,175 mm) clear akryl) baserat på kommentarer i filerna. Resultaten visas som i figur 1B (8 kammare arena) och 1C (32 kammare arena).
- Montera arenor med fyra insexskruvar och fyra vingmuttrarna för att anpassa och hålla ihop plastskikten (Figur 1A). Arenorna kommer att visas som i figur 1D, 1E (8-kammare) och figur 1F, 1G (32 kammare).
OBS: maten vägg (Layer 4 i figur 1A) används för 2-D mättnads endast analyser och utelämnas i 32-kammar arenor, som används i frieri analyser.
2. Mat Förberedelse för 2-D Satiety analys
OBS: Eftersom en 2-D mättnad analysen spänner 4,5 timmar, flyga mat används i arenan för att ge näring och vatten. Detta protokoll använder, men är inte begränsad till, den konventionella majsmjöl-agar flyga mat.
- Delvis montera två-D mättnad arena (8-kammare) med lager 3-6(se figur 1A för lageruppdrag) och dra åt med vingmuttrar och sexkantskruvar.
- Placera färska flyga mat i en ren, mikrovågsugn flaska. Lägg bara tillräckligt med vatten för att täcka bottenytan av flaskan (Figur 2A).
- Mikrovågsugn mat på hög i 30 - 45 s. Kontrollera framsteg och rör var 15 s tills smält (Figur 2B). VARNING! Flyga mat kokar lätt över.
- Använd en trubbiga 1000-mikroliter pipettspets (figur 2C) att långsamt föra ~ 1 ml smält mat i varje kammare (figur 2D).
- Låt maten resolidify vid 4 ° C under ~ 10 min (Figur 2E) före fullständigt montering arenan (Figur 2F).
- Använd färdig arena för experiment (se avsnitt 4) eller förvara vid 4 ° C.
- Förvara matresterna vid 4 ° C och återanvändning.
3. Förbereda Virgin Kvinnor för beteendemässiga analyser
OBS: 2-D mättnadsanalyser använder ett stort antal jungfru kvinnliga flugor (~ 120 - 160 för en fullständig beteende arena) som är svåra att samla in med användning av standardmetoder. Detta avsnitt beskriver ett alternativt tillvägagångssätt med hjälp av hs-hid transgen på Y-kromosomen 28, som har använts med framgång i frieri analyser 25, 29. Den mald som användes för att generera vita ögon jungfru honor har genotypen w1118 (X) / HS-hid (Y); + / +, + / + (Bloomington lagernummer 24.638).
- Flip flyger in i en ny flaska en gång 20-50% av den puppor har eclosed (se figur 3A till exempel) och det finns tillräckligt många män (5 - 10) för att propagera beståndet.
- Värmechock den ursprungliga flaskan i ett 37 ° C varmt vattenbad under 1 h för att tillräckligt aktivera hs-hid att döda hanar (figur 3B). Efter värmechock, bara kvinnor kommer Eclose från dessa flaskor och så kommer att förbli oskuld tillsanalyser.
OBS: Se till att alla sidor av flaskan är jämnt uppvärmd (se figur 3A för vattenlinjen). Förlänga denna tid i upp till 2 h om 1 h är inte tillräcklig för att avliva alla hanar. - Isolera samlade honor under minst 3 d före experiment för att se till att de är gamla nog att vara sexuellt mottaglig 25, 29.
OBS: Y-kromosom-minus män ibland uppstå detta bestånd. Dessa män har vita ögon och är opåverkade av värmechock, eftersom de inte innehåller HS-HID transgen. De kan inte producera spermier och kan därför inte minska mottagligheten hos kvinnor 30, 31.
4. Utföra och poäng 2-D mättnad Analyser
OBS: Det är viktigt att kontrollera åldern på manliga flugor som parningsdriv ändras med åldern. Detta protokoll använder hanar som är 3-4 d gamla 25
- Ställ inkubatorn till den önskade temperaturen (t.ex. 23 ° C i standard, RT experiment) och luftfuktighet (> 30%). För kuvöser utan fuktreglering, lämnar en kopp vatten i inkubatorn är tillräcklig.
- Placera en 2-D mättnad analys arena i inkubatorn för ~ 30 minuter för att utjämna temperaturen och för att förhindra kondens i kamrarna under försöket. De roterande dörrar ska vara i öppet läge.
- Använd en fluga aspirator 32 att aspirera 15 - 20 jungfru honor i varje kammare av arenan (Figur 4).
OBS: Det är viktigt att de honor och hanar inte bedövas på samma dag som analysen. I vår erfarenhet, kan göra så påverkar kvinnliga receptivitet och manliga parningsbeteende. - Aspirera en hane in i varje kammare.
- Placera den laddade arenan i inkubatorn under vanlig konsument videokamera (Figur 5) och film under 4,5 timmar.
- Betyg videoklipp genom att notera när varje man flyga börjar och slutar varje parning (dvs. parning). Detta steg kan vara tidskrävande i början. Med lite övning kan en poängsätta filmer hos 5x hastighet eller högre.
OBS: Eftersom flugor mate för ~ 20 min vid ~ 23 ° C (kortare tid vid högre temperaturer) 29, kan ett skumma genom den första 15 min av varje parning. - Efter inloggning alla parningstider summera antalet parningar för varje fluga (se representativa resultat).
- Använd koden för att generera en ethogram. Se kompletterande material 2 för koden, instruktioner, och exempeldata.
- Använd CO2 eller kall temperatur för att söva flugor innan du tar bort dem.
5. Använda Thermogenetic Manipulation Reverse Satiety i 2-D Satiety Analyser
OBS: Detta protokoll testar om thermogenetic stimulering av en definierad neuronal population kan övervinna mättnad. Den experimentella flies uttrycka värmekänsliga katjon kanal TrpA1 i definierade populationer av neuroner (UAS-TrpA1). Stegen nedan gäller för stimulering av dopaminerga neuroner (TH-Gal4), som har visat sig främja parning enhet 25. Dessa steg kan användas i kombination med andra neuronala förare att upptäcka andra populationer som främjar parning enhet.
- Att thermogenetically inducera parningsbeteenden i mätta flugor, öka temperaturen i inkubatorn (t.ex. från 23 ° C till 28,5 ° C) efter att ha avslutat en fullständig 4,5 h 2-D mättnad experiment.
- Efter inkubatorn når önskad temperatur, fortsätter värmestimulering och poängsätta parningar (dvs.. Kopulationer) av hanarna för 1 h (se Representativa resultat).
OBS: Temperaturen och längden på stimulering kan variera beroende på genotypen så det är nödvändigt att felsöka de optimala förhållanden som förhindrar överstimulering av neuroner och ändå producera en Robust fenotyp.
6. Använda Uppvaktning och Locomotion att Verifiera Satiety
OBS: I det här avsnittet beskriver 3 alternativa metoder som kan användas för att kontrollera resultaten av 2-D mättnad analyser. De är inte krävs för varje analys.
- Använda uppvaktning analyser för att verifiera mättnad.
- Aspirera en hane och en jungfru hona in i var och en av de 32 kamrarna i en uppvaktning arena.
- Filma flugor för ~ 20 min med hjälp av en vanlig konsument videokamera.
- Betyg uppvaktning index (CI) för att kvantifiera frieri 25; detta är den del av tiden som upptas utföra parningsbeteende (sjunga, efter etc.) och parning (dvs. parning) under en 5 min-fönstret. Detta fönster startar från den första instansen av parningsbeteende. Om en manlig fluga inte startar uppvaktning i de första 15 min, är dess CI 0. Naiv WT flugor bör visa en CI större än 0,9, medan en helt mätt fluga bör ha en CI below 0,2. Andra uppvaktning åtgärder kan också övervägas 23, 33.
- Scoring kurtis i 2-D mättnadsanalyser
- Score den mängd tid som en manlig fluga bringar uppvakta, under en tidsperiod av en 2-D mättnad analys (t.ex., den första h). Uppvaktningen definieras som den manliga utför någon fas av ritualen (sång, efter, etc.). Till skillnad från i avsnitt 6.1.3, innebär detta steg inkluderar inte tid hanen tillbringar parning.
- Dela upp uppvaktning tid ovan av den totala tiden hanen var inte parning (dvs. inte kopulera) i samma tidsperiod. Till exempel, om en manlig flyga domstolen i 15 min och mates för 20 min under den första h är förhållandet 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. Förhållandet visas som "Fraktion av nonmating tid i uppvaktningen" i Representativa resultat.
- Med användning av locomotion analys för att utvärdera utmattning
- Delvis montera 32-kammare arena med alla delar, men kontrasten bladet.
- Sug en manlig fluga (inga kvinnliga flugor) till vart och ett av de 32 kamrarna i en uppvaktning arena.
- Filma flugor för ~ 10 min med hjälp av en vanlig konsument videokamera.
- Spåra flugor med MTrack2 plugin i ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).
7. Åter Mating Drive efter två-D Satiety analys
- Utför en 2-D mättnad analys som beskrivs i avsnitt 4, men aspirera manliga flyger ut i slutet av analysen.
- Isolera de manliga flugor vid 23 ° C för önskat antal dagar.
- Utför en 2-D mättnad analys med de återvunna hanar och göra sina parningar (dvs. kopulationer) för bara en timme (se Representativa resultat).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att karakterisera Drosophila parning enhet, tre dagar gamla, var WT Canton-S-hanar testas i en 2-D mättnad analys. Under loppet av analysen (4,5 h), hanar mate ett genomsnitt på 4,8 ± 0,3 (medelvärde ± standardfel för medelvärdet, SEM) gånger. Parningar initiera mestadels i de första 2 h (78%) (Figur 6a, 6b) och bli mindre frekvent som analysen fortskrider (Figur 6A, 6B). Denna minskning är inte på grund av bristen av med varandra ingripande partners (74% kvinnor förblir oparade genom hela analysen) eller fysisk trötthet (Figur 6F). Snarare är denna effekt sannolikt förklaras med en minskning i hanens uppvaktning under analysen, från 42,6 ± 8,0% (medelvärde ± SEM) (1 st h) till 2,0 ± 0,7% (medelvärde ± SEM) (den senaste timmen) av nonmating tid (Figur 6C). Minskningen i uppvaktningen ses också när hannarna testas i frieri analyser med nya honor (figur 6D, 6E) (Figur 6G, 6H). Dessa resultat visar att internt hållna parning enhet hos manliga flugor kan mätta i ett 2-D mättnad analysen och kan återhämta sig över tiden.
Den mättnadsanalysen 2-D kan också enkelt kombineras med Drosophila neurala manipulationer. Vi rapporterade nyligen att thermogenetic stimulering av dopaminerga neuroner vänder parning enhet i mätta man flyger 25. Med hjälp av 2-D mättnadsanalyser, finner vi att dopaminerg stimulering (TH> TrpA1, 28,5 ° C) vid slutet av mättnadsanalysen ökade både uppvaktning (Figur 7A, 7C, röd) och parning (figur 7A, 7B, röd). Återföring effekter inte observerats med föräldrakontroll genotyper (Figur 7A - 7C, svart och grått). Alla dessa resultat överensstämmer med den aktuella studien25 och tyder på att mättnadsanalysen 2-D, tillsammans med hjälp analyser (uppvaktning och locomotion), kan användas för att dissekera molekylära och neuronala komponenter av parning enhet.
Figur 1. konstruktion och montage av Behavioral Arenas. En 8-kammar arena (används för 2-D mättnadsanalyser) består av 6 skikt hålls samman av vingmuttrar och sexkantskruvar (A). En 32-kammare arena (som används för uppvaktning analyser) är tillverkad på liknande sätt, men utan mat väggen (skikt 4). Arenan delar skärs ut med en laserskärare och lagren är numrerade som (B) för 8-kammare och (C) för 32-kammare. De sammansatta 8-kammar arenor visas i (D) (framifrån) och (E) (sett från sidan med numrerade skikt). De monterade 32-kammar arenor monterade på ett liknande sätt (F, G), men Layer 4 (mat vägg) utelämnas (G) eftersom ingen fluga mat är i arenan för uppvaktning analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Förbered 2-D mättnad Analyser med mat. Standard Drosophila mat placeras i en mikrovågsugn burk med vatten (A). Maten är microwaved tills smält (B). En trubbig pipettspets (C, pil) används för att överföra mat till kamrarna i ett delvis monterat beteende arena (D). Maten på nytt stelnade vid 4 ° C (E) före beteendearenan är färdigmonterad (F).pg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Generera Virgin Kvinnor från w1118 (X) / HS-hid (Y) Lager. Flyga vatten skall finnas värme chockade när 50 - 80% av den puppor är uneclosed vilket framgår av deras ogenomskinlighet (A). Den infällda bilden visar exempel på uneclosed (överst) och eclosed (botten) puppor (A). Flaskor vägs ned och nedsänkt i 37 ° C varmt vattenbad under 1 h med vatten nivå strax ovanför botten av flaskan proppar för att säkerställa jämn uppvärmning (B). Se den svarta pilen i (A) för vattenlinjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Loading Flugor i en Behavioral Arena. Försiktigt aspirera och hålla 15 - 20 kvinnor i aspirator (A). Pipettspetsen används för att öppna den roterande dörren (B), och flugorna försiktigt frigörs in i kammaren (C). Använda aspirator för att stänga den roterande dörr (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Utföra och Inspelning av en 2-D Satiety analys. (A) En vanlig konsument videokameran (a) används för att registrera analysen i en inkubator inställd på den önskade temperaturen. Inkubatorn innehåller en kolv med vatten (b) och en fuktighetsdetektor (c) för att säkerställalämplig luftfuktighet (> 30%). Den framställda 2-D mättnad analys filmas under videokameran (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: mättnad och återställning av Fy parning Drive. I en 2-D mättnad assay, manliga flugor mate ofta under de första 2 timmarna av analysen (A, B), men minska sin uppvaktning (C) och parningar (B) enligt analysen fortskrider. Den gradvisa minskningen av parningsbeteende bibehålls när män överförs till en uppvaktning analys med nya honor efter att ha avslutat en två-D mättnad analys av 0 timmar, eller en timme, eller 4,5 h (D, E). Röda pilar pekar på män som uppvisar uppvaktning och parningsbeteende, medan apelsin arrader pekar på icke-parning, icke-uppvaktning flugor (A, D). Nedgången i sexuella beteenden är inte ett resultat av fysisk utmattning, som män visar likvärdiga nivåer av rörelseaktivitet före och efter mättnadsanalysen 2-D (F). Manlig gradvis återfå sin parning (G) och uppvaktning (H) nivåer under 3 d isolering från honor. I denna figur, *** p <0,001, ** p <0,01, NS inte signifikant för t-test (C, F) och en-vägs ANOVA med Tukey efter provet (E, G, H). N = 15-16 för varje villkor för alla experiment. Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Thermogenetic Satiety Återföring i Male Flies. Liksom i standard 2-D mättnad analys män visar en minskning av parningar under loppet av försöket, men thermogenetic stimulering av dopaminerga neuroner (TH> TrpA1, röd), men inte i föräldrakontroll genotyper (svart och grå), återinförs parning enhet i mätta män (A). Inga parningar är skårade när X-axeln är bruten i (A). Denna återföring av parning enhet kan kvantifieras med hjälp av antingen parning nummer (B) eller uppvaktning (C). X-axel nummer i (B) och (C) avser tiden i (A). Orange bakgrundsfärg indikerar thermogenetic stimulering (A - C). I denna figur, *** p <0,001, NS inte signifikant för interaktioner mellan genotyp och temperatur i två-vägs ANOVA med Bonferroni post-test (B, C). N = 8 för varje genotyp (B, C). Felstaplar representerar SEM..jove.com / filer / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Material 1. Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande materialet 2. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Motiverande tillstånd kan mätta, underhållas, och återhämtade sig 34. Vi presenterar en 2-D mättnad analys som snabbt och kraftfullt mäter alla dessa aspekter av parning enhet i farten. Denna analys öppnar upp möjligheten att använda avancerad gylf genetiska manipulationer för att studera de molekylära och kretskomponenterna i ett motiverat beteende.
Den mättnadsanalysen bygger på manliga förmåga att framgångsrikt domstol och kopulera och att avsluta kopulationer vid lämplig tidpunkt. Fastän hyposexual flugor bana mindre, låg-uppvaktning flugor är inte nödvändigtvis hyposexual; de kan, till exempel, har problem med att känna igen eller spåra honorna 35. Av denna anledning, är bäst lämpad för testning hyper en fenotyp som inte tillförlitligt kan observeras i en standard uppvaktning analys eftersom naiva vildtyp hanar visar uppvaktning index närmar sig 1. Hypersexualitet i mättnadsanalysen sh den mättnadsanalysOuld anses relativt ålder mans i vår erfarenhet, äldre män tenderar att para sig något oftare än de tre dagar gamla män som används här.
Vi använde thermogenetic stimulering av dopaminerga neuroner för att exemplifiera de neurogenetiska manipulationer som kan användas i detta system för att undersöka komponenterna underliggande motivation. Dessutom kan forskarna också använda thermogenetic stimulering under en 2-D mättnad analys och leta efter hyper hanar som är långsammare att nå mättnad. Naturligtvis kan mättnadsanalyser också kombineras med neuronala tystande verktyg 36, 37, optogenetik 38, genetiska mutationer 39, 40, 41, RNAi knockdown 28, 42, 43, 44, etc.
Den mättnadsanalysen är prisvärd och skalbar. Varje arena kan tillverkas för ~ 10 dollar till ett värde av material (plus laserskärning eventuella kostnader) och upptar mindre utrymme än en pocketbok. Scoring filmerna är också en relativt enkel uppgift. En utbildad försöks kan göra mål en 4,5 timmar video med 8 manliga flugor i ~ 1,5 timmar. För mer high-throughput screening, kan en poäng bara de sista 2 h, när normala flugor visar mycket låga nivåer av parning enhet. Alternativt kan ett stickprov analyserna var 30 min, eftersom detta kommer att fånga de flesta av de ~ 20 min långa parningar.
Vi hoppas att detta system kommer att i stor utsträckning anpassas och kommer att bidra till framväxten av Drosophila som ett kraftfullt system för att låsa upp hemligheter motivation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K12 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/8 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K42 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 3/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8560K219 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/32 inch black delrin | McMaster-Carr | 8575K132 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| Hex screws, 1 inch long (50x) | McMaster-Carr | 92314A115 | Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas. |
| Thumb nuts (25x) | McMaster-Carr | 92741A100 | Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr). |
| Camcorder | Canon | Vixia HF R700 | Can be replaced by any consumer comcorder. |
References
- Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
- Hall, J. C. Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).
- Luo, L.
- Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity. Cell. 101 (6), 671-684 (2000).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis. Cell. 75 (5), 827-830 (1993).
- Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121 (5), 795-807 (2005).
- Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior. Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).
- Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila. Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).
- Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster. Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).
- Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour. Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).
- Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain. Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).
- Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E.
- Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila. Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).
- Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice. eLife. 4, e11188 (2015).
- von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. Neuronal control of Drosophila courtship song. Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).
- Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila. eLife. 4, e08477 (2015).
- Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).
- Kohatsu, S., Yamamoto, D. Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state. Nature Communications. 6, 6457 (2015).
- Fan, P., Manoli, D. S., et al. Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species. Cell. 154 (1), 89-102 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate. Current Biology. 17, 599-605 (2007).
- Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).
- Pan, Y., Baker, B. S. Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila. Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).
- Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive. Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).
- Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism. The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).
- Sacks, O. W. Awakenings. , Vintage Books. New York. (1999).
- Dietzl, G., Chen, D., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila. Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).
- Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).
- Cook, R., Cook, A. The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet. Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).
- Toates, F. M. Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).
- Hall, J. C.
- Simpson, J. H. Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain. Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).
- Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
- Spradling, A. C., Stern, D., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).
- Parks, A. L., Cook, K. R., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).
- Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).
- Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
- Ni, J. Q., Zhou, R., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature. 8 (5), 405-407 (2011).
