Summary
Bu makale melanogaste motivasyon incelemek için r Drosophila erkek çiftleşme sürücüsünü kullanan bir davranış deneyi anlatır. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar bu motivasyonu altında yatan genetik moleküler ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için ileri sinek neurogenetic teknikler kullanabilirler.
Abstract
soruşturmanın yıllardır rağmen, motivasyon devletlerin nöronal ve moleküler temelleri gizemli kalır. Biz son zamanlarda burada detay metotları olan erkek Drosophila melanogaster (Drosophila) çiftleşme sürücüyü kullanarak motivasyon derinlemesine soruşturulması için bir roman, indirgemeci ve ölçeklenebilir bir sistem geliştirdik. davranışsal paradigma erkek çiftleşme sürücü tekrarlanan çiftleştirerek boyunca doğurganlık yanında azalır ve ~ 3 d üzerinde kurtarır bulgu merkezleri. Bu sistemde, sinek mevcut güçlü neurogenetic araçlar genetik erişilebilirlik ve cinsel davranış için varsayılan bağlantı şemasına ile birleşir. Bu yakınlaşma hızlı izolasyon ve özel motivasyon fonksiyonları ile küçük nöronal popülasyonlarının sorgulama sağlar. Burada detay ölçmek ve erkek sinek kur motivasyonu değiştirmek için kullanılır tokluk testinin tasarımı ve yürütülmesi biz. Kullanımı BuTahlil, biz de düşük erkek çiftleşme sürücü dopaminerjik nöronların uyararak aşılabilir olduğunu göstermektedir. tokluk tahlil genetik arka plan etkilerine basit, hesaplı ve sağlamdır. Biz tokluk tahlil motivasyon devletler nörobiyolojisine içine birçok yeni anlayışlar üretmek için bekliyoruz.
Introduction
Drosophila iş geninin 1. doğası dahil olmak üzere birçok biyolojik olayların derinliklerine ve öncü fikir sağlamıştır, embriyonik gelişim 2, sirkadiyen ritimler 3 ve sinir sistemi 4, 5, 6 gelişmesi ve kablolama ilkeleri. Motivasyon belki de şimdiye kadar çalışılmıştır sistemlerde sınırlamalar, çok daha az iyi bu olayların daha anlaşılamamıştır. sinek Motivasyon öncelikle yağ depolanmasının açık belirtilerini engeller besleme maçın ve exoskeleton başına onların yok denecek kadar az gıda alımı için birçok zorluklarla karşı karşıya açlık bağlamında ele alınmıştır. Sonuç olarak, sinek motivasyon incelemek için kullanılan sistemler genişletmek için bir ihtiyaç vardır.
Biz çiftleşme sürücünün çalışmasında bir davranış çerçeveyi tanımlamakDrosophila. Bu sistem, sinek gibi erişilebilirlik 7, 8, 9, 10, 11, 12 ve cinsi olarak dimorfik devresi 8, 13, varsayılan connectome içinde nörogenetik araçlar yararlanır. Buna ek olarak, çok doğal, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ve 22, 23, 24 duyu-motor devre kontrol kur nadir bir fırsat sağlamaktadır ayrıntılı bir şekilde olmuştur öğrenilenmotivasyon çarptığı bunun üzerine tam devre düğümü bulun. Son zamanlarda sinek, insanlarda olduğu gibi, dopamin düzeyleri eşleşen tahrik 25, 26, 27 için merkezi bildirmiştir. Biz burada 25 tarif deneyleri kullanılarak bu korunmuş fenomenin analizi, ilgili dopamin üreten ve sinek nöronlar alma kolaylaştıran detaylı Molecular ve devre düzeyinde genetik erişim kazanmıştır.
Bu Zhang ve arkadaşları davranış testleri ekle. Biz 2 boyutlu (2-D) tokluk testi, önceki yöntemlere göre önemli bir iyileşme çağrı, video puanlama, izin verir 25 yeni bir düz davranış arenada. Sonuç olarak, yeni tahlil daha ölçeklenebilir ve ölçülebilir ve motivasyon yer alan genlerin ve nöronların genetik ekranlar için bu nedenle daha uygundur. Bu kur analizleri ve neuroge ile birlikte bu yeni tahlil kullanımımanyetik manipülasyonlar, ölçmek ve sinek çiftleşme sürücüyü değiştirmek için nasıl göstermek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol hazırlanması (Bölüm 1-3) açıklar, yürütme (Bölüm 4), ve analiz 2-D tokluk tahlillerin (Bölüm 4). Sonra, bir örnek olarak dopaminerjik stimülasyon kullanarak, Bölüm 5 hiperseksüalite ikna etmek için 2-D tokluk deneyleri ile thermogenetic stimülasyon birleştirmek nasıl gösterir. Bölüm 6 2-D tokluk deneyleri sonuçları doğrulamak için 3 yolları anlatılmaktadır. Son olarak, Bölüm 7 erkek sinekler çiftleşme sürücünün kurtarma ölçmek için nasıl gösterir.
1. 8 ve 32 odası Davranış Arenas Fabricating
Not: her davranış Arena dört köşe (Şekil 1A) her birinde altıgen vida ve başparmak somunları ile bir arada tutulan, lazer kesme plastik levhalar birkaç tabakadan oluşur.
- arena katmanları Üretiyor. Uygun şekline akrilik plastik levha kesmek için lazer kesici kullanarak her katmanı Üretiyor (Şekil 1B, 1C ürünler için bakınız).
NOT: Birçok araştırma institutions kendi makine dükkan veya yapıcı alanlarda lazer kesiciler var. Kurum bir lazer kesici erişimi varsa, aşağıdaki adımlarla devam edin. Değilse, o zaman yerine Adım 1.2 yönergeleri izleyin.- Her bir katman için, lazer kesicinin yazılımında tasarım deseni açın.
NOT: tasarımlar uygun adlandırılmış PDF dosyalarında bulunabilir (örneğin, 8-Chamber Arena - Katman 2 - Doors.pdf) Ltd. Malzeme 1. Bu dosya aynı zamanda plastik türü için açıklamaları içeren kullanılmak üzere (örneğin, 1 / 8 inç (yani 3.175 mm) net akrilik). Her bir katmanın tam kalınlığı kritik değildir. ana şartı odalarında 0.12 inç (3 mm) veya serbest dikey alanı daha fazla olanak sağlamaktır. - Çeşidi ve plastik kalınlığı lazer ayarları (güç, odak vs.) ayarlama kullanılır. Lazer kesici yatakta plastik yerleştirin ve lazer kesici çalıştırın.
NOT: Bu ayarlar yaygın lazer cutte göre değişirr modeli ve lazer gücü. Geçmiş deneyimlere veya hurda plastik test kesikler yaparak göre uygun ayarları bulun. Derin altıgen gravürler altıgen vida başları girinti tasarım dahil edilir. Bu özellik, başparmak fındık tek elle sıkılaştırma sağlar ve arenalar (vida başları çıkıntılı olmadan) bankta düz dinlenmesini sağlar. Bununla birlikte, derin gravürler yaparak sık sık elde etmek zor ve zaman alıcı bir lazer kesici kullanıyor. Bu adım isteğe bağlıdır ve davranışsal sonuçları etkilemeden atlanabilir. - Kapı çerçevesi (Katman 2, Şekil 1A) keserken, aynı zamanda (Şekil 1B, 1C gibi) tasarıma dahil bölme numaraları oyularak için uygun lazer ayarlarını kullanır.
- Her bir katman için, lazer kesicinin yazılımında tasarım deseni açın.
- Bir online lazer kesme fabrikatör bir sipariş. Malzeme tip 8- ve / veya 32 odalı arena tüm PDF tasarım dosyalarını yükleyin ve belirtin (örneğin, 1/8 inç (yani 3.175 mm) Cleadosyaları ek açıklamaları dayalı r akrilik). Sonuçlar Şekil 1B (8 odacıklı arena) ve 1C (32 odacıklı arena) olarak görünecektir.
- Hizalamak ve birlikte plastik tabakaları (Şekil 1A) tutmak için dört altıgen vida ve dört parmak somun kullanarak arenalarda birleştirin. Arenalar Şekil 1D, 1E (8 odacıklı) ve Şekil 1F, 1G (32 odacıklı) olarak görünecektir.
Not: (Şekil 1A Katman 4) Gıda duvarı sadece 2-B doyma deneyleri için kullanılır ve kur deneylerinde kullanılan 32 bölmeli sahalarda atlandı.
2-D Satiety Testi için 2. Gıda Hazırlama
NOT: 2-D tokluk tahlil 4.5 saat yayılan Çünkü, gıda beslenme ve su sağlamak için arenada kullanılır sinek. Bu protokol kullanmaktadır, ama geleneksel mısır unu-Agar gıda kalkan ile sınırlı değildir.
- Kısmen Katmanlar 2-D tokluk arena (8 odacıklı) monte 3-6(katman atamaları için Şekil 1A) ve başparmak fındık ve altıgen vida ile sıkın.
- Temiz, mikrodalga güvenli şişeye taze sinek gıda yerleştirin. Şişe (Şekil 2A) alt yüzeyini kaplamak için yeterli miktarda su ilave edilir.
- 45 sn - 30 yüksek mikrodalga yiyecek. Ilerlemeyi kontrol edin ve (Şekil 2B) eriyene kadar her 15 sn karıştırın. DİKKAT! Fly gıda kolayca kaynar.
- Yavaş yavaş ml her odanın (Şekil 2B) içine yiyecek erimiş 1 ~ aktarmak için körelmiş 1000 mcL pipet (Şekil 2C) kullanın.
- Gıda alanını tamamen (Şekil 2F) monte edilmeden önce, 10 dakika (Şekil 2E) + 4 ° C'de yeniden katılaşmasına imkan verin.
- 4 ° C'de tamamlanan deneyler için arena (Bakınız Bölüm 4) ya da mağaza kullanın.
- 4 ° C ve yeniden de artık yiyecek saklamak.
3. Davranış Tahliller için Virgin Females hazırlanması
NOT: - standart yöntemler kullanılarak toplamak zordur (tam davranış arenada 160 ~ 120) 2-D tokluk deneyleri bakire kadın sinekler çok sayıda kullanın. Bu bölümde kur deneyleri 25, 29 yılında başarıyla kullanılmaktadır Y kromozomu 28, hs-sakladı transgen kullanarak alternatif bir yaklaşım anlatılmaktadır. Beyaz gözlü bakire kadın oluşturmak için kullanılan stok genotip w1118 (X) / hs-hid (Y) vardır; + / + + / + (Bloomington stok numarası 24638).
- Kapak kez 20 yeni bir şişe içine uçar - pupa% 50 eclosed var (örneğin Şekil 3A) ve yeterli erkek (5 - 10) vardır stok yaymak için.
- Isı yeterince (Şekil 3B) erkekleri öldürmek için hs-HID aktive 1 saat için 37 ° C sıcak su banyosunda orijinal şişe şok. ısı şokundan sonra, sadece kadın bu şişelerden Eclose ve böylece kadar bakire kalırtahlilleri.
NOT: (su hattı için Şekil 3A bakınız) şişenin tüm tarafların eşit ısıtılır emin olun. 1 saat tüm erkekleri euthanize için yeterli değilse, en fazla 2 saat süreyle bu süreyi uzatmak. - Onlar 25, 29 cinsel alıcı olacak kadar yaşlı olduğundan emin olmak için deneyler önce en az 3 gün toplanan kadın izole edin.
NOT: Y-kromozomu-az erkekler bazen bu stoktan ortaya çıkar. Bu erkekler beyaz gözleri var ve onlar hs-sakladı transgen içermemesi nedeniyle ısı şoku etkilenmez. Onlar, 31 kadın 30 reseptiviteyi azaltmak olamaz, bu nedenle sperm üretmek ve olamaz.
4. Gösteri ve 2-D Tokluk Tahliller Puanlama
NOT: erkek yaşı ile çiftleşme sürücü değişiklikleri gibi uçar kontrol etmek önemlidir. Bu protokol 3 olan erkek kullanır - 4 d eski 25
- Istenen sıcaklığa (örn 23 ° standart C RT deneyler) ve nem (>% 30) ile kuluçka ayarlayın. inkübatör bir bardak su bırakarak nem kontrolü olmadan kuvöz için yeterlidir.
- sıcaklık dengelenmesi için ve deney sırasında odalarına yoğunlaşmayı önlemek için ~ için inkübatör 30 dakika bir 2-B tokluk tahlil arena yerleştirin. döner kapıları açık pozisyonda olmalıdır.
- Arena (Şekil 4) her odasına 20 bakire kadın - 15 aspire bir sinek aspiratör 32 kullanın.
NOT: Bu kadın ve erkekler deneyi ile aynı günde anestezi değildir önemlidir. Bizim tecrübelerimize göre, bunu yaparken kadın reseptivitede ve erkek çiftleşme davranışı etkileyebilir. - Her odasına aspire 1 erkek.
- 4.5 saat için standart tüketici kamera (Şekil 5) ve filmin altında inkübatörde yüklenen arena yerleştirin.
- Her erkek başlar sinek ve her çiftleşme (yani çiftleşmeye) sona erdiğinde belirterek videoları puan. Bu adım zaman alıcı ilk başta olabilir. Uygulama ile, bir 5x hızında veya daha yüksek video skor olabilir.
NOT: sinekler ~ 23 ° C (yüksek sıcaklıklarda kısa süreli) 29 de ~ 20 dakika dostum bu yana, her biri çiftleşme ilk 15 dakika boyunca gözden geçirebilir. - Tüm çiftleşme kez yaptıktan sonra, her sinek için çiftleşmelerin sayısını toplamı (temsilci Sonuçları bakınız).
- Bir ethogram oluşturmak için sağlanan kodu kullanın. kod, talimatlar ve örnek veriler için ek Malzeme 2'ye bakınız.
- Onları çıkarmadan önce sinekler uyutmak için CO 2 veya soğuk sıcaklık kullanın.
5. 2-D Satiety Tahliller tokluk Ters Thermogenetic Manipülasyon kullanma
NOT: tanımlanmış nöronal nüfusun thermogenetic stimülasyon tokluk üstesinden olup olmadığını Bu protokol testleri. deneysel flies nöronların (UAS-TrpA1) tanımlanmış toplumlarda ısıya duyarlı katyon kanalı TrpA1 ifade eder. Aşağıdaki adımlar, eşleşen tahrik 25 teşvik ettiği gösterilmiştir dopaminerjik nöronlar (TH-Gal4), uyarılması için de geçerlidir. Bu adımlar, eşleşen tahrik teşvik eden başka popülasyonları keşfetmek için diğer nöronal sürücülerle bağlantılı olarak kullanılabilir.
- Thermogenetically inkübatör sıcaklık artışı, tok sinekler birleşme davranışa yol açma (örneğin, 23 ° C ila 28.5 ° C) tam bir 4.5 saat 2-B doyma deney tamamlandıktan sonra.
- Inkübatör istenen sıcaklığa ulaştıktan sonra, ısı uyarımı devam ve 1 saat (Temsilcisi Sonuçlar bakınız) çiftleşmesi (yani. Çiftleştirerek) erkeklerin puan.
Not: hala Robu üretirken nöronların fazla stimüle olmasına engel uygun koşulları gidermek için gerekli olan şekilde uyarım sıcaklık ve uzunluk genotipine bağlı olarak değişiklik gösterebilirst fenotip.
6. tokluk hissini doğrulayın Kur yapma ve hareket Kullanma
NOT: Bu bölümde 2-D tokluk deneylerinin sonuçlarını doğrulamak için kullanılabilecek 3 isteğe bağlı yöntemler açıklanır. Her tahlil için gerekli değildir.
- tokluk doğrulamak için kur deneyleri kullanın.
- Aspire bir erkek ve bir kur arenada 32 odaların her birine bir bakire kadın.
- Bir standart tüketici video kamera kullanılarak 20 dakika ~ için sinekler filmi.
- Kur 25 ölçmek için kur endeksi (CI) Skoru; Bu kur davranışı gerçekleştirmek geçirdi (vb aşağıdaki şarkı.) zaman ve 5 dk penceresi üzerinde (yani çiftleşmeye) çiftleşme bölümüdür. Bu pencere kur davranışı ilk örneği başlar. Bir erkek sinek ilk 15 dakika içinde kur başlamazsa, onun CI tamamen tok sinek CI b olmalıdır oysa 0. Naif WT sinekler, 0.9 den CI büyük göstermesi gerekir ise0.2 elow. Diğer kur önlemler, 33 23 düşünülebilir.
- 2-D tokluk deneyleri Puanlama kur
- 2-B tokluk deneyinin bir zaman süresi (örneğin, ad, H) üzerinde bir erkek sinek kur harcadığı süreyi puan. Kur ritüel her türlü adımı (vb takiben şarkı) gerçekleştiren erkek olarak tanımlanır. Bölüm 6.1.3 aksine, bu adım erkek çiftleşme harcadığı zamanı içermez.
- Erkek aynı dönemde (yani copulating değil) çiftleşme değil, toplam zaman yukarıdaki kur süresini bölün. (- 20 dakika 60 dakika) = 0,375 erkek ilk saat içinde 20 dakika süre ile, 15 dakika boyunca kortları ve arkadaşları hedefi, örneğin, bu oran 15 dakika / olup. oran Temsilcisi Sonuçlar "kur zaman nonmating bir Kesir" olarak gösterilir.
- tükenme değerlendirmek için hareket testi kullanılarak
- Kısmen 32- arayaTüm parçaları ancak kontrast levha ile bölme arena.
- Bir kur arenada 32 odaların her birine aspire bir erkek sinek (hiçbir kadın sinekler).
- Bir standart tüketici video kamera kullanılarak 10 dakika ~ için sinekler filmi.
- ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html) 'de MTrack2 eklentisi ile sinekler izleyin.
2-D Satiety Testi sonra Çiftleşme Drive kurtarma 7.
- Bölüm 4'te açıklandığı gibi 2-D tokluk tahlil gerçekleştirin, ancak erkek testin sonunda dışarı uçar aspire.
- gün istenen sayıda, 23 ° C'de bir erkek sinekler izole edin.
- Kurtarılan erkek ile bir 2-B tokluk tahlil gerçekleştirin ve sadece 1 saat (Temsilcisi Sonuçlar bakınız) onların çiftleşmesi (yani çiftleştirerek) puan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila eşleşen tahrik karakterize etmek için, 3 günlük bir WT Canton-S erkek 2-B doyma deneyi ile test edildi. tahlil (4.5 saat) boyunca, erkekler 4.8 ± 0.3 ortalama arkadaşı kez (ortalama, SEM ± standart hata demek). Eşleştirmesi, ilk 2 saat boyunca (% 78) (Şekil 6A, 6B) 'de daha çok başlatmak ve deneyi (Şekil 6A, 6B) ilerledikçe sıklığı azalır. Bu azalma çiftleşme ortakları eksikliği (% 74 kadın tahlil boyunca unmated kalır) ya da fiziksel yorgunluk (Şekil 6F) bağlı değildir. Aksine, bu etkinin muhtemelen 2.0 ± 0.7% 42,6 ±% 8.0 (ortalama ± SEM) (1 st h) dan, tahlil sırasında erkeğin kur bir azalma ile açıklanabilir (ortalama ± SEM) nonmating zaman (son saat) (Şekil 6C). Kur bu azalma da görülmektedir erkek Yeni dişilerle kur deneylerinde test edildiğinde (Şekil 6D, 6E) (Şekil 6G, 6H) izole edilmiştir. Bu sonuçlar, erkek sinekler dahili tutulan çiftleşme sürücü 2-D tokluk deneyinde tok olabilir ve zamanla kurtarmak olduğunu göstermektedir.
2-B doyma deneyi de kolayca Drosophila nöral manipülasyonlar ile bir araya getirilebilir. Biz son zamanlarda dopaminerjik nöronların thermogenetic uyarılması tok erkek çiftleşme sürücü 25 sinekler tersine bildirdi. 2-B doygunluk deneyleri kullanarak, tokluk, deney sonunda dopaminerjik stimülasyon (TH> TrpA1, 28.5 ° C), hem kur (Şekil 7A, Şekil 7C, kırmızı) ve çiftleşmeye (Şekil 7A, kırmızı 7B) artmış olduğunu görüyoruz. Ters etkileri ebeveyn denetimi genotipleri (- 7C, siyah ve gri Şekil 7A) ile gözlenmez. Bu sonuçların tamamı piyasadaki çalışmada ile tutarlıdır25 ve yardımcı deneyleri (kur ve hareket) ile birlikte 2-B tokluk deneyi, eşleşen tahrik moleküler ve nöronal bileşenleri incelemek için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir.
Şekil 1. Tasarımı ve Montajı Davranış Arenas. (2-B doyma deneyleri için kullanılan), 8 bölmeli Arena parmak fındık ve altıgen vida (A) ile bir arada tutulan 6 tabakadan oluşur. (Kur deneyleri için kullanılan) bir 32 odalı arena benzer üretilmiş, ancak gıda duvarı olmayan (katman 4). Arena parça lazer kesici ile kesilir ve tabakalar 8-bölme ve 32-bölme (C) (B) olarak numaralandırılmıştır. Monte 8 bölmeli arenalar (D) (önden görünüm) ve (E) (numaralı katmanları ile yan görünümü) gösterilmiştir. Benzer bir şekilde bir araya monte edilmiş 32 bölmeli alanları (F, Hiçbir sinek yiyecek kur deneyleri için arenada olduğundan G), ancak Katman 4 (gıda duvar) (G) göz ardı edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Gıda ile 2-B Satiety Tahliller hazırlanması. Standart Drosophila, yiyecek, içecek (A), bir mikro-dalga ile güvenli bir kavanoza yerleştirilir. (B) eriyene kadar gıda mikro dalgada. Bir körleşmiş pipet ucu (C ok) kısmen monte davranış arenada (D) odalarına yiyecek aktarmak için kullanılır. Gıda tamamen monte davranışsal arena (F) daha önce 4 ° C'de (S) yeniden katılaştırılır.pg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: w1118 (X) / hs-hid (Y) Stok gelen Yaratma Virgin Kadın. Onların opaqueness (A) işaret ettiği gibi pupa% 80 uneclosed olan - 50 iken sinek şişe ısı şok olmalıdır. Ilave görüntü uneclosed (üstte) örnekleri ve eclosed (alt) pupa (A) gösterir. Şişeler aşağı tartılır ve şişe tıpa alt bile ısıtma (B) sağlamak için sadece yukarıdaki su seviyesi ile 1 saat boyunca 37 ° C sıcak su banyosu içinde batık. Su hattı için (A) siyah ok bakın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Yükleme Bir Davranış Arenaya Sinekler. Yavaşça aspire ve 15 tutun - aspiratör (A) 20 kadın. Pipet dönen kapı (B) açmak için kullanılır, ve sinekler yavaşça odasına (C) salınır. Dönen kapı (D) kapatmak için aspiratör kullanın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Sahne ve 2-B Satiety Testi kaydedilmesi. (A) (a) bir standart tüketici kamera istenen sıcaklığa ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde tahlil kaydetmek için kullanılır. inkübatör sağlamak için su (B) 'nin bir şişeyi ve nem dedektörü (c) içerenUygun nem seviyesi (>% 30). Hazırlanan 2-D tokluk tahlil kameranızın (B) altında çekilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Doygunluk ve Fy Çiftleşme Drive Kurtarma. 2-B tokluk tahlilde erkek sinekler deneyi (A, B), ilk 2 saat sık çiftleşme, ancak deney ilerledikçe kendi kur (C) ve çiftleşmesi (B) azalır. Erkek 0 saat, ya da 1 saat veya 4.5 saat (D, E) olan bir 2-D doyma deneyi tamamladıktan sonra, yeni dişilerle bir kur tahlilinde transfer edildiğinde kur davranış progresif azalma sağlanır. Kırmızı oklar turuncu ar ise, kur ve çiftleşme davranışları sergileyen erkeklere işaretsatır olmayan çiftleşme olmayan flört sinekler (A, D) işaret eder. Erkek önce ve 2-D tokluk deneyi (F) sonra lokomotor aktivite eşdeğer seviyelerini göstermek gibi cinsel davranışlarda azalma, fiziksel bitkinlik bir sonucu değildir. Erkekler yavaş yavaş kadın izolasyonuna 3 gün boyunca kendi çiftleşme (G) ve kur (H) düzeyleri kurtarmak. Bu şekilde, *** p <0.001, ** p <0.01, t-testi (C, F) ve Tukey post-testi (E, G, H) ile tek yönlü ANOVA için önemli değil ns. Tüm deneyler için, her durum için 16 - n = 15. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: Thermogenetic Tokluk Male geri çevrilmesi Sinekler. Standart 2-D tokluk deneyinde olduğu gibi, erkekler bir deney boyunca çiftleşmelerin azalma, ancak dopaminerjik nöronların thermogenetic uyarılması göstermektedir (TH> TrpA1, kırmızı) genotipleri (siyah ve gri), ancak ebeveyn-kontrol, tok erkeklerde (A) sürücüyü çiftleşme geri getiriyor. X-ekseni (A) bozulduğunda Resim çiftleşme puanlanır. Eşleşen tahrik tersine dönmesi geçme numaraları (B) veya kur (Cı) kullanılarak ölçülebilir. (B) ve (C) 'de X-ekseni sayılar (A)' da zaman bakın. Turuncu arka plan rengi thermogenetic uyarımı gösterir (A - C). Bu şekilde, *** p <0.001, Bonferroni post-testi (B, C) ile iki yönlü ANOVA genotip ve sıcaklık arasındaki etkileşimleri için önemli değil ns. Her genotip için N = 8 (B, C). Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir..jove.com / files / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yan Malzeme 1. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Yan Malzeme 2. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Motivasyonel devletler, tok muhafaza ve 34 elde edilebilir. Biz hızlı ve sağlam sinek sürücüyü çiftleşme bu tüm yönleriyle ölçen bir 2-B tokluk test sunuyoruz. Bu deney, bir motive davranış moleküler ve devre elemanlarını okumak için gelişmiş uçucu genetik manipülasyonlar kullanılması olasılığını yaratır.
tokluk tahlil erkeğin yeteneği başarıyla mahkemeye ve çiftleşmek ve uygun zamanda çiftleştirerek sonlandırmak için kullanır. az hyposexual sinekler mahkeme, düşük kur sinekler mutlaka hyposexual olmamasına rağmen; onlar, örneğin, sorun tanıma veya kadın 35 izleme olabilir. Bu nedenle, tokluk tahlil test hiperseksualite, naif vahşi tip erkeklerin tokluk tahlil sh 1. hiperseksualite yaklaşan kur endeksleri gösteriyor çünkü güvenilir bir standart kur deneyinde gözlenen edilemez bir fenotip için en uygunyaşına göre kabul edilebilir ould erkek deneyimimiz, eski erkek burada kullanılan 3-gün eski erkek biraz daha sık çiftleşme eğilimi.
Bu motivasyon yatan bileşenler araştırmak için bu sistemde kullanılabilir nörogenetik manipülasyonlar örneklemek için dopaminerjik nöronların thermogenetic uyarılması kullanılır. Ayrıca, araştırmacılar da 2-B tokluk tahlil boyunca thermogenetic uyarımı kullanabilir ve tokluğu ulaşmak için yavaş hypersexual erkekler için arayın. Tabii ki, doyma deneyleri, aynı zamanda 38 optogenetics, nöronal susturma araçları 36, 37 ile birleştirilebilir, genetik mutasyonlar 39, 40, 41, RNAi 28, 42, 43, 44, vb demonte
tokluk tahlil ekonomik ve ölçeklenebilir. Her arena malzemelerin ~ 10 ABD dolar değerinde için üretilen (artı lazer kesme maliyetleri, varsa) ve Karton kapaklı bir kitap daha az yer kaplar edilebilir. Video Puanlama da nispeten basit bir iştir. 8 erkek ~ 1.5 saat uçar ile eğitimli deneyci bir 4.5 saat Video puanı. Normal sinekler çiftleşme sürücü çok düşük seviyelerde gösterdiğinizde daha yüksek verimli tarama, bir, sadece son 2 saat puanı. Bu ~ 20 dk süren çiftleşmelerin çoğunluğu çekeceği Alternatif olarak, bir, tayinidir her 30 dakikada bir kontrol nokta olabilir.
Biz bu sistemi yaygın adapte olacak ve motivasyon sırlarını için güçlü bir sistem olarak Drosophila ortaya çıkmasına katkıda umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K12 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/8 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K42 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 3/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8560K219 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/32 inch black delrin | McMaster-Carr | 8575K132 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| Hex screws, 1 inch long (50x) | McMaster-Carr | 92314A115 | Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas. |
| Thumb nuts (25x) | McMaster-Carr | 92741A100 | Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr). |
| Camcorder | Canon | Vixia HF R700 | Can be replaced by any consumer comcorder. |
References
- Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. The spatial relations of genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).
- Hall, J. C. Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).
- Luo, L. Rho GTPases in neuronal morphogenesis. Nature reviews. Neuroscience. 1 (3), 173-180 (2000).
- Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity. Cell. 101 (6), 671-684 (2000).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis. Cell. 75 (5), 827-830 (1993).
- Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121 (5), 795-807 (2005).
- Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior. Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).
- Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila. Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).
- Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster. Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).
- Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour. Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).
- Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain. Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).
- Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E. Sexual dimorphism in the fly brain. Current biology. 20 (18), 1589-1601 (2010).
- Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila. Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).
- Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice. eLife. 4, e11188 (2015).
- von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. Neuronal control of Drosophila courtship song. Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).
- Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila. eLife. 4, e08477 (2015).
- Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila. Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).
- Kohatsu, S., Yamamoto, D. Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state. Nature Communications. 6, 6457 (2015).
- Fan, P., Manoli, D. S., et al. Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species. Cell. 154 (1), 89-102 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate. Current Biology. 17, 599-605 (2007).
- Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).
- Pan, Y., Baker, B. S. Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila. Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).
- Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive. Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).
- Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism. The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).
- Sacks, O. W. Awakenings. , Vintage Books. New York. (1999).
- Dietzl, G., Chen, D., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
- Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila. Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).
- Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).
- Cook, R., Cook, A. The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet. Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).
- Toates, F. M. Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).
- Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994).
- Simpson, J. H. Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain. Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).
- Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
- Spradling, A. C., Stern, D., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).
- Parks, A. L., Cook, K. R., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).
- Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).
- Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
- Ni, J. Q., Zhou, R., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature. 8 (5), 405-407 (2011).
