Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

त्वरित Atherosclerosis के खरगोश मॉडल: श्रोणि धमनी गुब्बारा चोट के एक Methodological परिप्रेक्ष्य

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/55295
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg
* These authors contributed equally

Summary

atherosclerosis के पशु मॉडल तंत्र को समझने के लिए और पट्टिका विकास या टूटना, औद्योगिक दुनिया में मौत का एक प्रमुख कारण को रोकने के लिए नए दृष्टिकोण की जांच करने के लिए आवश्यक हैं । इस प्रोटोकॉल गुब्बारा चोट और कोलेस्ट्रॉल अमीर आहार का एक संयोजन का उपयोग करता है खरगोश श्रोणि धमनी में atherosclerotic सजीले टुकड़े प्रेरित ।

Abstract

एक्यूट कोरोनरी सिंड्रोम कोरोनरी रोड़ा निम्नलिखित atherosclerotic पट्टिका विकास और टूटना के परिणामस्वरूप औद्योगिक दुनिया में मौत का प्रमुख कारण है । न्यूजीलैंड सफेद (NZW) खरगोश व्यापक रूप से atherosclerosis के अध्ययन के लिए एक पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । atherogenic आहार से तंग आने पर वे सहज घावों का विकास करते हैं; हालांकि, यह 4-8 महीने के लंबे समय की आवश्यकता है । आगे बढ़ाने और atherogenesis में तेजी लाने के लिए, atherogenic आहार और यांत्रिक endothelial चोट का एक संयोजन अक्सर कार्यरत है । खरगोशों में atherosclerotic सजीले टुकड़े के लिए प्रस्तुत प्रक्रिया एक गुब्बारा कैथेटर का उपयोग करता है NZW atherogenic आहार के साथ खिलाया खरगोशों की बाईं श्रोणि धमनी में endothelium को बाधित । इस तरह के यांत्रिक क्षति गुब्बारा कैथेटर की वजह से एक समय निर्भर फैशन में neointimal लिपिड संचय की शुरुआत भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला लाती है । Atherosclerotic पट्टिका निंनलिखित गुब्बारा चोट दिखाने के neointimal व्यापक लिपिड घुसपैठ, उच्च चिकनी मांसपेशी सेल सामग्री और macrophage व्युत्पन्न फोम कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ और अधिक मोटा होना । इस तकनीक को सरल, प्रतिलिपि है और श्रोणि धमनी के भीतर नियंत्रित लंबाई की पट्टिका का उत्पादन । पूरी प्रक्रिया 20-30 मिनट के भीतर पूरा हो गया है । प्रक्रिया कम मृत्यु दर के साथ सुरक्षित है और भी पर्याप्त intimal घावों को प्राप्त करने में उच्च सफलता प्रदान करता है । गुब्बारा कैथेटर की प्रक्रिया दो सप्ताह के भीतर atherosclerosis में धमनी की चोट के परिणाम प्रेरित । इस मॉडल रोग विकृति, नैदानिक इमेजिंग की जांच करने के लिए और नई चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

कमजोर atherosclerotic सजीले टुकड़े का टूटना एक औद्योगिक देशों में मौत के प्रमुख कारणों में से एक है1। हालांकि पिछले दशकों में अनुसंधान कई आणविक और सेलुलर पट्टिका प्रगति में शामिल तंत्र सामने आया है, निरंतर प्रयास अभी भी न केवल रोग प्रगति के जटिल तंत्र को जानने की जरूरत है, लेकिन यह भी नए चिकित्सीय परीक्षण के लिए दृष्टिकोण. कई पशु मॉडल atherosclerosis का अध्ययन करने का प्रस्ताव किया गया है । आनुवंशिक हेरफेर, कोलेस्ट्रॉल खिलाने या यांत्रिक endothelium चोट मानक रणनीतियों चूहों, खरगोश या minipigs सहित atherosclerosis के अधिकांश पशु मॉडल द्वारा साझा कर रहे हैं । इन के अलावा, NZW खरगोश कोलेस्ट्रॉल आहार के प्रति संवेदनशील होते हैं, जबकि सामान्य चूहों और चूहों आहार कोलेस्ट्रॉल2,3,4को अवशोषित नहीं करते । खरगोशों अनायास कोलेस्ट्रॉल रिच आहार5,6के साथ खिलाया जब कुछ रेशेदार घटक के साथ मैक्रोफेज में अमीर महाधमनी घावों का विकास । हालांकि, 4-8 महीने की लंबी तैयारी समय atherosclerotic plaquesby अकेले कोलेस्ट्रॉल आहार6खिलाने के लिए प्रेरित करने के लिए,7 प्रयोगात्मक सेटिंग्स के अधिकांश के लिए एक बड़ी खामी है । अपेक्षाकृत कम समय में घावों उत्प्रेरण के लिए खोज में, उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार और गुब्बारा चोट का एक संयोजन Baumgarter और घुड़साल8द्वारा विकसित किया गया है । इस तकनीक का समग्र लक्ष्य atherosclerotic फोम कोशिकाओं (मनुष्यों में वसायुक्त लकीर के समान) hypercholesterolemic खरगोशों में 2 सप्ताह के भीतर से बना सजीले टुकड़े को प्रेरित करने के लिए है । वर्तमान तकनीक एक गुब्बारा कैथेटर NZW hypercholesterolemic खरगोश की श्रोणि धमनी में उन्नत का उपयोग कर Baumgarter की विधि के आधार पर धमनी की दीवार की चोट की प्रक्रिया का वर्णन करता है ।

एक साथ एक कोलेस्ट्रॉल अमीर आहार के साथ, चोट प्रेरित de-endothelialization गुब्बारा के परिणामस्वरूप atherosclerosis को बढ़ावा मिलेगा । गुब्बारा चोट atherosclerotic घावों के गठन में तेजी लाता है, और वर्दी आकार और वितरण की पट्टिका का उत्पादन । Intimal अधिक मोटा होना समय की अवधि के दौरान बढ़ता है और Intimal सेल घुसपैठ चोट के बाद कुछ दिनों के भीतर शुरू होता है । पर्याप्त मैक्रोफेज के साथ फैटी धारियां गुब्बारा चोट के 7-10 दिनों के बाद प्रदर्शित करने के लिए शुरू और प्रकार के रूप में द्वितीय घाव अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन द्वारा वर्गीकरण के अनुसार प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । खरगोश में गुब्बारा चोट अक्सर महाधमनी में पट्टिका संरचना का अध्ययन करने के लिए किया जाता है । neointimal endothelium सेलुलर आसंजन अणु के उच्च स्तर को व्यक्त करता है । सजीले टुकड़े औसत दर्जे का विच्छेदन और adventitial परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैं । Atherosclerotic घावों लिपिड से बना रहे हैं, proliferating चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMCs), कोलेजन फाइबर और भड़काऊ कोशिकाओं है कि पुनर्जीवित endothelium के तहत जमा और प्रकृति में ज्यादातर प्रकार द्वितीय रहे हैं । खरगोश सजीले टुकड़े के टोपोलॉजिकल वितरण मानव aortas 9में रिपोर्ट के समान था,सिद्धांत रूप में10 , महाधमनी श्रोणि धमनियों की तुलना में आकार में बड़ा है और बड़ी लंबाई में पट्टिका का उत्पादन होगा । हालांकि, खरगोशों में atherosclerosis की साइट के रूप में श्रोणि धमनी का उपयोग करने का प्रमुख लाभ अपनी पहुंच है, मांसपेशियों की सामग्री में अपनी समानता मानव कोरोनरी धमनी के लिए11, वर्दी घाव विकास12, उच्च ऊतक कारक गतिविधि13 और लगातार पोत आयाम मानव कोरोनरी धमनी morphometric और angiographic अंतिमबिंदु के लिए व्यावसायिक रूप से निर्मित उपकरणों के मूल्यांकन की अनुमति के तुलनीय । आक्रामक और गैर इनवेसिव तरीके रहते जानवर में खरगोश श्रोणि धमनियों में पट्टिकाओं का विश्लेषण करने के लिए जांच की गई है । पिछले रिपोर्टों एक २.३५-tesla श्री प्रणाली के 14 की मदद से चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के उपयोग का वर्णन इसके अतिरिक्त, intravascular अल्ट्रासाउंड (IVUS) या ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) कैथेटर उपयुक्त छवि के लिए लागू किया जा सकता खरगोश श्रोणि धमनियों में atherosclerotic पट्टिकाएं । श्रोणि धमनी अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए सुलभ है जब एक उच्च संकल्प echography का उपयोग कर और महाधमनी भी इस तकनीक के साथ पता लगाया जा सकता है ।

पिछले एक दशक में, गुब्बारा चोट के इस खरगोश मॉडल को आगे पट्टिका प्रगति15और पट्टिका16प्रतिगमन के तंत्र को समझने में मदद मिली है । इसके अलावा, मॉडल जैसे statins, मानक antiplatelet एजेंटों, एंटीऑक्सीडेंट एजेंटों17,18 और दवा-eluting stents जैसे everolimus या के रूप में उपंयास चिकित्सीय एजेंटों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है zotarolimus-eluting स्टेंट19,20 पर neointimal रोगन । इस मॉडल के पास अवरक्त प्रतिदीप्ति इमेजिंग कैथेटर21के intravascular इमेजिंग की जांच करने के लिए भी इस्तेमाल किया गया है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_content" > इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल को गुआंगज़ौ पशु चिकित्सा कार्यालय, Fribourg और स्विस संघीय पशु चिकित्सा कार्यालय, स्विट्जरलैंड (FR 2015/58) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

< p class = "jove_content" > नोट: नर NZW खरगोशों के बीच वजनी २.८ से ३.२ किग्रा का उपयोग किया गया. जानवरों पारंपरिक स्थितियों (12 एच प्रकाश और अंधेरे चक्र, प्रदान की विज्ञापन libitum पानी और भोजन) के तहत घर में थे । गुब्बारा अनाच्छादन से पहले, पशु 1 सप्ताह के लिए आदत थे, जिसके दौरान वे सामांय चाउ आहार से तंग आ चुके थे । acclimatization के 1 सप्ताह के बाद, खरगोश उच्च वसा (८.६%), और २०५ मिलीग्राम/किलो कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त फैटी एसिड के साथ atherogenic आहार के लिए बंद किया गया (1%) पूरे अध्ययन अवधि के लिए आहार । बाईं श्रोणि धमनी में गुब्बारा चोट 1 सप्ताह के बाद आहार दीक्षा और जानवरों 2 सप्ताह या गुब्बारा चोट के 4 सप्ताह के बाद बलिदान किया गया था ।

< p class = "jove_title" > 1. पूर्व-ऑपरेटिव प्रक्रियाओं

  1. एक गिलास मनका नसबंदी या अन्य उपयुक्त साधन के साथ उपयोग करने से पहले सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों निष्फल ।
  2. तैयार है और गुब्बारा कैथेटर विधानसभा की जांच करें ।
    1. एक 1 मिलीलीटर luer लॉक सिरिंज को सामान्य खारा से भरे luer-लॉक भाग को गुब्बारा कैथेटर से अटैच कर देते हैं । ध्यान से फंस हवा के अभाव के लिए निगरानी । लीक की जांच करें और सिरिंज के सवार दबाकर उचित गुब्बारा मुद्रास्फीति को सुनिश्चित करें ।
  3. ने खरगोश को तौलना और thermopad को चालू कर ३७ & #176; ग.
  4. ०.३ मिलीग्राम/एमएल की एक एकाग्रता में एक buprenorphine समाधान का उपयोग करें । ०.०१ मिलीग्राम/kg के एक खुराक के साथ चमड़े के नीचे ।
  5. Anesthetize 10-15 मिनट के लिए एक प्रेरण कक्ष में 5% isoflurane और 5 एल/मिन ओ 2 के साथ खरगोश.
  6. जगह शल्य मंच पर रखा हीटिंग पैड पर anesthetized खरगोश । पैच और क्लिप प्लेस तापमान, श्वसन, और इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम.
    7. की निगरानी के लिए
  7. एक उपयुक्त संज्ञाहरण मशीन से जुड़े एक चेहरा मुखौटा के लिए खरगोश के थूथन संलग्न । isoflurane के साथ संज्ञाहरण बनाए रखने (२.५ L/मिन O 2 के साथ ४.०%) । उचित anesthetization की पुष्टि करें (मांसपेशी टोन और झूठ और pinnae सजगता के नुकसान की कमी से संकेत).
    8. कॉर्निया को सूखने से रोकने के लिए दोनों आंखों को
  8. नेत्र ऑइंटमेंट लागू करें । केवल निचले अंग उजागर के साथ एक बाँझ सर्जिकल शीट के साथ खरगोश कपड़ा ।
< p class = "jove_title" > 2. सर्जिकल प्रोटोकॉल

  1. पशु बाल कतरनी का उपयोग कर सिर्फ घुटने के जोड़ों के नीचे ventral क्षेत्र से बालों को हटा दें ।
  2. झाड़ू त्वचा को साफ करने और ढीले बालों को हटाने के लिए उपयुक्त संक्रमित के साथ क्षेत्र ।
  3. saphenous धमनी का पता लगाने और एक छोटी सी त्वचा के बारे में १.५ सेमी की लंबाई में एक स्केलपेल.
    4. का उपयोग कर चीरा
  4. ऊरु नस और ऊरु तंत्रिका को नुकसान पहुँचाए बिना छोटे घुमावदार संदंश के साथ saphenous धमनी का एक छोटा सा हिस्सा बेनकाब ।
  5. जगह दो ढीला संयुक्ताक्षर छोरों (5-0 रेशम) saphenous धमनी के नीचे और धमनी के बाहर के छोर की ओर एक संयुक्ताक्षर पाश टाई । श्रोणि धमनी से रक्त के प्रवाह को रोकने के लिए संयुक्ताक्षर के ऊपर एक microvascular दबाना रखें ।
  6. सामयिक papaverine की एक बूंद लागू करने के लिए धमनी को चौड़ा और vasospasm को रोकने के लिए ।
  7. बंधे संयुक्ताक्षर की मदद से saphenous धमनी को ऊपर उठाएं और एक 24 गेज सुई का उपयोग कर एक छोटा arteriotomy चीरा लगाएं ।
  8. ठीक संदंश के साथ चीरा फ्लैप तरक्की और धीरे से एक नस उठाओ या धमनी के लुमेन में एक मार्गदर्शक सुई डालें.
  9. saphenous धमनी में एक 2 फ्रेंच Fogarty धमनी embolectomy कैथेटर डालें । नस उठाओ और microvascular clamps निकालें ।
  10. श्रोणि विभाजन.
    11. ऊपर लगभग 2-5 सेमी की स्थिति के लिए इसी छठे निशान (20-25 सेमी) तक कैथेटर अग्रिम
  11. ०.१ मिलीलीटर सामांय खारा के साथ गुब्बारा फुलाना एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर या 6 एटीएम के नाममात्र दबाव में वर्णित के रूप में एक विनियमित मैनुअल फुलाना का उपयोग कर < सुप वर्ग = "xref" > 16 , < सुप वर्ग = "xref" > २२ .
  12. संदंश के साथ गुब्बारा कैथेटर पकड़ो और 6 सेमी द्वारा वापस खींचें arterytoward प्रविष्टि के बिंदु, जबकि कैथेटर घूर्णन श्रोणि के माध्यम से ।
  13. सिरिंज के सवार वापस खींच कर गुब्बारा खंडन.
  14. चरण २.१० से २.१३ तक तीन बार दोहराएं सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण endothelial अनाच्छादन.
  15. कैथेटर निकालें और तुरंत बस arteriotomy साइट के ऊपर संयुक्ताक्षर पाश टाई रक्तस्राव को रोकने के लिए ।
  16. घाव की परिधि के चारों ओर उपयुक्त एंटीसेप्टिक लागू करते हैं और रक्त के थक्के दूर झाड़ू । एक 5-0 टांका के साथ त्वचा चीरा बंद करें, और povidone-आयोडीन समाधान के साथ सर्जरी साइट को संक्रमित ।
  17. चरण २.१ करने के लिए २.१६ contralateral श्रोणि पर एक नया कैथेटर का उपयोग कर दोहराएँ ।
  18. झाड़ू आँखों से नेत्र मरहम.
< p class = "jove_title" > 3. पोस्ट को-ऑपरेटिव केयर

  1. sulfadoxine ४० मिलीग्राम/किलो और trimethoprim 8 मिलीग्राम/या किसी अंय उपयुक्त एंटीबायोटिक तुरंत शल्य प्रक्रिया के बाद ।
    2. संज्ञाहरण के दौरान
  2. -वसूली की अवधि, एक गर्मी एक साफ autoclaved पिंजरे में रखा पैड पर खरगोश रखो ।
  3. मॉनिटरिंग पैच और क्लिप्स निकालें ।
    4. वसूली के बाद
  4. , उनके घर पिंजरों के लिए खरगोश वापस । सुई buprenorphine ०.०५-०.१ मिलीग्राम/पोस्ट-ऑपरेटिव हर 6-12 एच के लिए ४८ एच. एक और दो सप्ताह या चार सप्ताह के लिए atherogenic आहार जारी रखें ।
< p class = "jove_title" > 4. ऊतक संचयन और पट्टिका संरचना का विश्लेषण

  1. दो सप्ताह के बाद (जल्दी पतली पट्टिका के लिए) या गुब्बारा चोट के तीन सप्ताह, anesthetize खरगोश एक समान तरीके से isoflurane का उपयोग कर के रूप में ऊपर वर्णित है ।
  2. वक्ष गुहा खोल और खरगोशों को euthanize कर intracardial exsanguination.
    3. < सुप class = "xref" > 23 में बताए अनुसार श्रोणि धमनियों को अलग
  3. ।
    1. संक्षेप में, पेट खोलो और retroperitoneum का पर्दाफाश । श्रोणि विभाजन की ओर महाधमनी को स्ट्रेस करें और इसे विभाजन के ऊपर बाँधें. ध्यान से आसपास के ऊतकों को हटाने के लिए बेनकाब और दोनों श्रोणि धमनियों को अलग ।
  4. दोनों श्रोणि धमनियों बाहर टुकड़े और उन्हें बर्फ में विसर्जित-कोल्ड फास्फेट बफर खारा. संदंश की मदद से थक्के निकालें । 4-6 खंडों में प्रत्येक श्रोणि धमनी को विभाजित करने के लिए धमनी में पट्टिका की मोटाई इस ।
  5. तुरंत एक इष्टतम काटने तापमान यौगिक, स्नैप-फ्रीज युक्त मोल्ड में धमनी क्षेत्रों एंबेड तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर और इसे रखने पर-७० & #176; C. तैयार 5 & #181; m थिक अनुभागों में वर्णित एक cryostat का उपयोग कर < सुप वर्ग = "xref" > 24 .
  6. प्रदर्शन प्रोटोकॉल, इम्यूनोफ्लोरेसेंस या immunohistochemical दाग के लिए morphometry, पट्टिका लिपिड और सेलुलर सामग्री के रूप में वर्णित < सुप class = "xref" > 10 , < सुप class = "xref" > 25 .
    नोट: संक्षेप में, फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) और permeabilize ०.२% ट्राइटन का उपयोग कर के साथ धमनी वर्गों कुल्ला । पंजाब के साथ वर्गों कुल्ला और 30 मिनट के लिए 2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ गैर विशिष्ट साइटों को ब्लॉक करें 1 ज के लिए वर्गों की मशीन ३७ & #176; C with ऐंटी & #945;-एसएम actin (1:200) या RAM11 एंटीबॉडी (1:200). पंजाबियों के साथ वर्गों कुल्ला और उंहें उचित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ३७ पर 30 मिनट के लिए मशीन & #176; C. पंजाबियों के साथ फिर से धो लें और नाभिक.
    7. का पता लगाने के लिए 10 मिनट के लिए Hoechst (5 & #181; g/mL) जोड़ें

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

श्रोणि धमनी की गुब्बारा चोट सफलतापूर्वक जटिलता के बिना प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 1) । कुल ऑपरेटिव समय केवल एक श्रोणि धमनी पर प्रदर्शन किया चोटों के लिए 20 से 30 मिनट से लेकर, और दोनों धमनियों पर चोटों के लिए ३५ करने के लिए ४५ मिनट. खरगोश गुब्बारा चोट के बाद 1 ज के भीतर बरामद किया । सभी जानवरों महत्वपूर्ण वजन घटाने के बिना स्वस्थ दिखाई दिया । कोई संक्रमण, शोफ या धमनी घनास्त्रता का सामना करना पड़ा । घाव क्षेत्र टांका स्थल पर कुछ हल्के फाइब्रोसिस के अलावा सामान्य था । atherogenic आहार खिलाने के 4 सप्ताह के बाद, खरगोश ४४ ± 18 मिमी के विटिलिगो का प्रदर्शन/

आंकड़े 2a, चित्रा 2E, और चित्रा 2I सही घायल श्रोणि धमनी दिखाने के लिए (गुब्बारा चोट के अधीन नहीं) एक सामांय उपस्थिति के साथ । दो सप्ताह में atherosclerotic पट्टिका के विकास के लिए अग्रणी पोत दीवार के संरचनात्मक परिवर्तन में गुब्बारा चोट और कोलेस्ट्रॉल dietresulted का एक संयोजन (चित्रा 2 और चित्रा 3) । घायल और गुब्बारा चोटिल श्रोणि धमनियों के लिए एक ही जानवर से अलग-थलग पड़ गए. प्रफलन संवहनी प्रतिक्रिया गुब्बारा चोट के रूप में एक ट्रिगर घटना के परिणामस्वरूप व्यापक लिपिड घुसपैठ (८.७ ± १.७% लिपिड क्षेत्र) (चित्रा 2 और चित्रा 3), चिकनी मांसपेशी सेल प्रवास और प्रसार (चित्रा 4), के रूप में अच्छी तरह से मैक्रोफेज की भर्ती के रूप में (चित्रा 4) intima में वृद्धि करने के लिए अग्रणी-मीडिया मोटाई अनुपात (१.५ ± ०.२), और पट्टिका क्षेत्र (०.८ ± ०.२ मिमी2) लुमेन क्षेत्र में एक सहवर्ती कमी के साथ (१.४ ± ०.२ मिमी2) (चित्रा 3) मनाया 2 सप्ताह के बाद गुब्बारा चोट । राम-11 एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है जिसे विशेष रूप से खरगोश मैक्रोफेज के कोशिका के खिलाफ निशाना बनाया जाता है । α-SM actin मांसपेशी actin को पहचानता है और रक्त वाहिकाओं में संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के साथ प्रतिक्रिया करता है । ये एंटीबॉडी पहले खरगोश के intimal घावों में macrophage और चिकनी मांसपेशी कोशिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इन परिवर्तनों को समय के साथ विकसित करने के लिए जारी रखा और intima/मीडिया मोटाई अनुपात (२.६ ± ०.२) और चमकदार संकुचन (०.७ ± ०.१ mm2) (चित्रा 2 और चित्रा 3) 4 सप्ताह के गुब्बारे चोट के बाद नोट किया गया था में एक और वृद्धि । इस तकनीक atherosclerotic सजीले टुकड़े के मजबूत विकास की ओर जाता है कि समय के साथ विकसित और 2 से 4 सप्ताह के बाद अध्ययन किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व पट्टिका प्रगति के बाद गुब्बारा चोट के समयरेखा चित्रण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: खरगोश श्रोणि धमनी में गुब्बारा चोट प्रेरित Atherosclerosis । मोवाट pentachrome के प्रतिनिधि छवियां (ए डी), Hematoxylin-Eosin (ई एच) और तेल लाल ओ (मैं-एल) संयुक्त राष्ट्र से दाग वर्गों (एक, ई, मैं), 2 सप्ताह के बाद गुब्बारा चोट (बी, एफ, जे) (एन = 5) और 4 सप्ताह के बाद गुब्बारा चोट (सी, जी,के) (एन = 3) atherogenic आहार खिलाया NZW खरगोशों के श्रोणि धमनी क्षेत्रों । डी, एच और एल के लिए स्केल बार १०० µm है । अंय छवियों के लिए स्केल बार = ५०० µm. छवि B में लेबल लुमेन, intima, IEL (आंतरिक लोचदार लेमिना) और मछली (बाहरी लोचदार लेमिना) है । मीडिया IEL और मछली के बीच का क्षेत्र है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: पट्टिका का Morphometric विश्लेषण. तितर बितर भूखंड से पता चलता है intima/मीडिया मोटाई अनुपात, पट्टिका क्षेत्र, लुमेन क्षेत्र और% तेल लाल हे सकारात्मक क्षेत्र श्रोणि धमनी वर्गों में संयुक्त राष्ट्र से घायल नियंत्रण, गुब्बारा घायल धमनी पर 2 (n = 5) और 4 सप्ताह (n = 3) । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया जाता है । * प & #60; ०.०५ बनाम अन-घायल धमनी, #p & #60; ०.०५ बनाम 4 सप्ताह के बाद गुब्बारा चोट । जवाबतलब का पता नहीं है । पट्टिका क्षेत्र IEL क्षेत्र से लुमेन क्षेत्र घटाई जबकि तेल लाल ओ सकारात्मक क्षेत्र कुल पार के अनुभागीय पोत दीवार क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है द्वारा गणना की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: पट्टिका संरचना का Immunohistochemical विश्लेषण. प्रतिनिधि छवियां दिखा α-चिकना मांसपेशी actin (लाल) (A-D) और macrophage (RAM 11) धनात्मक कोशिकाएं (लाल) (E-F) । सही पैनलों Hoechst (नीला) और elastin (हरा) के साथ संबंधित विलय छवियों को दिखाते हैं । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

खरगोश श्रोणि धमनी atherosclerosis मॉडल व्यापक रूप से atherosclerosis अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल के साथ खरगोश तेजी से ही कोलेस्ट्रॉल आहार के साथ विकसित सहज घावों की तुलना में अधिक गंभीर और उन्नत सजीले टुकड़े विकसित. महत्वपूर्ण बात, जानवरों की सर्जरी से जल्दी से ठीक हो ।

atherogenesis के लिए मुख्य उत्तेजना गुब्बारा कैथेटर कि endothelium घायल हो जाता है और पोत दीवार26चाहता है की वजह से यांत्रिक क्षति है । यह प्रक्रिया macrophage भर्ती और लिपिड संचय जब hypercholestorolemic आहार, संवहनी चिकनी मांसपेशी सेल प्रवास और प्रसार, बढ़ाया मैट्रिक्स के साथ जुड़े के साथ एक सूजन द्वारा विशेषता एक पुननिर्माण प्रतिक्रिया लाती है संश्लेषण, और एक समय निर्भर फैशन में एक इनवेसिव neointima की स्थापना15,16. गुब्बारा कैथेटर डालने प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है । सावधानी के लिए जबरदस्ती गुब्बारा डालने से बचने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए । परिधीय saphenous धमनी का उपयोग करने के लिए आम श्रोणि धमनी तक पहुंचने के लिए तकनीक सरल करता है । श्रोणि धमनी भी मन्या धमनी कट के माध्यम से पहुँचा जा सकता है के रूप में पहले से ही वर्णित27,28. हालांकि, मन्या धमनी के माध्यम से श्रोणि धमनी का आकलन शल्य चिकित्सा विशेषज्ञता और एक एंजियोग्राफी इकाई के रूप में अतिरिक्त उपकरणों की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता है. यह भी jugular नस घातक रक्तस्त्राव के लिए अग्रणी करने के लिए चोट की तरह प्रक्रिया से संबंधित जटिलताओं के साथ जुड़ा हुआ है29. papaverine जैसे सामयिक vasodilator का प्रयोग पोत को चौड़ा करने और गुब्बारा कैथेटर के खिलाफ धमनी की दीवार के प्रतिरोध को कम करने में मदद करता है30. मुद्रास्फीति का दबाव और गुब्बारा आकार सावधानी से विचार किया जाना चाहिए के रूप में इन neointimal गठन31पर एक सीधा संघ है । अधिक वांछित स्तर से एक उच्च डिग्री करने के लिए गुब्बारे का गुमान पोत दीवार का टूटना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह रक्त और मजबूत थक्का गठन दोनों लुमेन में और बाहरी सतह पर लीक में परिणाम हो सकता है26।

जानवरों 1 या 2 सप्ताह के लिए एक लिपिड अमीर आहार खिलाया जाना चाहिए पहले गुब्बारा चोट सुनिश्चित करने के लिए कि endothelial चोट एक hypercholesterolemic सेटिंग में होता है । यह जानवरों को नए आहार में ढालने में भी मदद करता है । हालांकि इस तकनीक को खरगोशों में उंनत पट्टिकाएं लाती है, सजीले टुकड़े की आकृति विज्ञान से अलग है कि मनुष्यों में मनाया । सहज मानव घावों एक बरकरार आंतरिक लोचदार परत के साथ उप endothelial क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं३२। यहां 4 सप्ताह तक किए गए अध्ययनों में कोई fibrotic कोर नहीं दिखाया गया । atherosclerotic घाव काफी macrophage घुसपैठ के साथ वसायुक्त लकीर के समान रहता है ।

atherogenesis6को समझने के लिए कई छोटे और बड़े जानवरों के मॉडल का इस्तेमाल किया गया है । गुब्बारा चोट खरगोश श्रोणि धमनी मॉडल नए चिकित्सीय एजेंटों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, उपंयास दवा वितरण प्रणाली, पट्टिका विकास और इमेजिंग10,३२,३३। एकल या एकाधिक गुब्बारा श्रोणि धमनी३४,३५, मन्या धमनी३६,३७, और महाधमनी10,३८में प्रदर्शन किया गया injurieshave. प्रस्तुत विधि के लाभ बड़ी पट्टिका मात्रा और मोटाई के रूप में मन्या धमनी के उपयोग की तुलना में विकास कर रहे हैं । इसके अलावा, contralateral श्रोणि एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और इसलिए अंतर पशु परिवर्तनशीलता29कम कर देता है । खरगोश श्रोणि धमनियों में गुब्बारा चोट सुरक्षित और आसानी से किया जा सकता है यहां वर्णित विधि का उपयोग कर । पट्टिका एक समय निर्भर फैशन में विकसित करता है और धमनी की लंबाई भर में समरूप है । अंय atherosclerotic खरगोश मॉडल भी इस तरह के वातानाबे heritable hyperlipidemic (WHHL) मॉडल, कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर की कमी के साथ एक आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडल के रूप में विकसित किया गया है । गुब्बारा चोट मॉडल भी WHLL खरगोश को एक निर्धारित साइट पर घावों का उत्पादन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

खरगोश श्रोणि धमनी और मानव कोरोनरी सजीले टुकड़े के बीच मतभेद हैं । दरअसल, उन्नत atherosclerotic घावों को विकसित करने के लिए और पट्टिका टूटना का एक मॉडल बनाने के लिए एक प्रयास में कई वैकल्पिक प्रक्रियाओं की स्थापना की गई है जैसे कि३९मनुष्यों में मनाया जाता है । उदाहरण के लिए, अस्थिर पट्टिका गठन कोलेस्ट्रॉल आहार को नष्ट करने से प्रेरित था खरगोश में 8 सप्ताह कि गुब्बारा चोट16से गुजरा । अंय संशोधित प्रक्रियाओं ऐसे रसेल सांप विष10 और बाद दोहराया गुब्बारा चोट के रूप में औषधीय ट्रिगर का प्रयोग करें पट्टिका टूटना, thrombogenesis और atherosclerotic में थक्का विकास के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए४० वाहिकाओं. है रसेल सांप विष है कि जमावट घनास्त्रता करने के लिए अग्रणी झरना सक्रिय करता है । दोहराया गुब्बारा चोट thrombin पीढ़ी में पट्टिका ऊतक कारक द्वारा परिणाम४०। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि खरगोश मॉडल सहित पशु मॉडलों के परिणाम पूरी तरह से मनुष्यों को एक्सट्रपलेशन नहीं हो सकता है । हालांकि, इन मॉडलों का आकलन करने और नए औषधीय हस्तक्षेप की प्रभावकारिता की तुलना के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है । एटियलजि, pathophysiology, और मानव atherosclerosis के उपचार पर ज्ञान को व्यापक बनाने के लिए विटिलिगो और पट्टिका संरचना की डिग्री के संबंध में सावधान extrapolations किया जाना चाहिए । यहां प्रस्तुत मॉडल पट्टिका विकास में शामिल तंत्र का अध्ययन करने में मदद करता है और नए विरोधी के प्रभाव की जांच-atherosclerotic पट्टिका स्थिरीकरण की दिशा में निर्देशित चिकित्सा/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट १५०२७१ ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
New Zealand White rabbits Charles River laboratories,France Cre:KBL(NZW)
Cholesterol rich diet Ssniff spezialdiäten Ssniff EF K High Fat and Cholesterol
Glass bead sterilizer-Germinator 500 VWR, Leicestershire, UK 101326-488
Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French Edwards Lifesciences, Switzerland 120602F For single use only
Luer Lock Syringe Becton, Dickinson and Company, USA 309628
Thermopad Type 226 Solis, Switzerland AG 397387
Buprenorphine- Temgesic Reckitt Benckiser AG, Switzerland 7.68042E+12
Isoflurane Piramal Critical Care, Inc, Bethlehem, PA 18017 2667-46-7
Anaesthesia machine-combi-vet Base Anesthesia System Rothacher Medical GmbH, Switzerland CV 30-301-A
Cardell touch veterinary vital signs monitor Midmark, Ohio, USA 8013-001
Ophthalmic ointment-Humigel Virbac, France
Animal hair clippers Aesculap AG, Germany GT420
Disinfectant-Betadine solution MundipharmaMedicalCompany, Switzerland 14671-1203
Dumont #7 Forceps FST Germany 11274-20
Medium and small microscissors Medline International Switzerland Sàrl UC4337
Microvascular clamps FST, Germany 18051-28
Papaverine ESCA chemicals, Switzerland RE 356 803
Vein Pick Harvard Apparatus, Cambridge, UK 72-4169 For single use only
Saline Laboratorium Dr. G. Bichsel AG, , Switzerland 1330055
Polysorb 5-0 suture Covidien AG, Switzerland UL 202 Monofilament
Sulfadoxine and Trimethoprim-Trimethazol Werner Stricker AG, Switzerland Swissmedic Nr. 50'361
Antiseptic- Octenisept Schülke & Mayr AG, Switzerland GTIN: 4032651214068
Phosphate Buffered Saline Roth 1058.1
Isobutanol-2-Methylbutane Sigma-Aldrich, Switzerland M32631-1L
Optimum Cutting Temperature compound-Tissue-Tek VWR Chemicals, Belgium 25608-930
Cryostat Leica, Glattbrugg, Switzerland Leica CM1860 UV
Glass slide- Superfrost Plus Thermo Scientific 4951PLUS4
Mayer's Haematoxylin Sigma-Aldrich, Switzerland MHS32-1L
Eosin 0.5% aq. Sigma-Aldrich, Switzerland HT110232-1L
Oil Red O Sigma-Aldrich, Switzerland O0625-25G
α-smooth muscle actin antibody Abcam, UK. ab7817
Macrophage Clone RAM11 antibody DAKO, Switzerland M063301
Hoechst Abcam, UK. ab145596
Goat polyclonal Secondary Antibody (Chromeo 546) Abcam, UK. ab60316
Alexa Fluor 488/547 Abcam, UK.
Glycergel Mounting Medium, Aqueous DAKO, Switzerland C056330
Hematoxylin for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland H3136-25G
Ferric chloride for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland 157740-100G
Iodine for Movat staining Sigma-Aldrich, Switzerland 207772-100G
Potassium iodide for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland 60400-100G-F
Alcian blue for Movat staining Sigma-Aldrich, Switzerland A5268-10G
Strong Ammonia for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland 320145-500ML
Brilliant crocein MOO for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland 210757-50G
Acid Fuchsin for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland F8129-50G
Sodium Thiosulfate for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland 72049-250G
Phosphotungstic acid for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland 79690-100G
Crocin for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland 17304-5G
EUKITT for Movat pentachrome staining Sigma-Aldrich, Switzerland 03989-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131, e29-e322 (2015).
  2. Boone, L. R., Brooks, P. A., Niesen, M. I., Ness, G. C. Mechanism of resistance to dietary cholesterol. J Lipids. 2011, 101242 (2011).
  3. Kapourchali, F. R., et al. Animal models of atherosclerosis. World J Clin Cases. 2, 126-132 (2014).
  4. Carter, C. P., Howles, P. N., Hui, D. Y. Genetic variation in cholesterol absorption efficiency among inbred strains of mice. J Nutr. 127, 1344-1348 (1997).
  5. Kolodgie, F. D., et al. Hypercholesterolemia in the rabbit induced by feeding graded amounts of low-level cholesterol. Methodological considerations regarding individual variability in response to dietary cholesterol and development of lesion type. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16, 1454-1464 (1996).
  6. Singh, V., Tiwari, R. L., Dikshit, M., Barthwal, M. K. Models to study atherosclerosis: a mechanistic insight. Curr Vasc Pharmacol. 7, 75-109 (2009).
  7. Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J. Experimental atherosclerosis in rabbits. Arq Bras Cardiol. 95, 272-278 (2010).
  8. Baumgartner, H. R., Studer, A. [Effects of vascular catheterization in normo- and hypercholesteremic rabbits]. Pathol Microbiol (Basel). 29, 393-405 (1966).
  9. Tanaka, H., et al. Sustained activation of vascular cells and leukocytes in the rabbit aorta after balloon injury. Circulation. 88, 1788-1803 (1993).
  10. Phinikaridou, A., Hallock, K. J., Qiao, Y., Hamilton, J. A. A robust rabbit model of human atherosclerosis and atherothrombosis. J Lipid Res. 50, 787-797 (2009).
  11. Nakazawa, G., et al. Drug-eluting stent safety: findings from preclinical studies. Expert Rev Cardiovasc Ther. 6, 1379-1391 (2008).
  12. Aikawa, M., et al. Lipid lowering by diet reduces matrix metalloproteinase activity and increases collagen content of rabbit atheroma: a potential mechanism of lesion stabilization. Circulation. 97, 2433-2444 (1998).
  13. Jeanpierre, E., et al. Dietary lipid lowering modifies plaque phenotype in rabbit atheroma after angioplasty: a potential role of tissue factor. Circulation. 108, 1740-1745 (2003).
  14. Durand, E., et al. Magnetic resonance imaging of ruptured plaques in the rabbit with ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxide. J Vasc Res. 44, 119-128 (2007).
  15. Stadius, M. L., et al. Time course and cellular characteristics of the iliac artery response to acute balloon injury. An angiographic, morphometric, and immunocytochemical analysis in the cholesterol-fed New Zealand white rabbit. Arterioscler Thromb. 12, 1267-1273 (1992).
  16. Khanna, V., et al. Cholesterol diet withdrawal leads to an initial plaque instability and subsequent regression of accelerated iliac artery atherosclerosis in rabbits. PLoS One. 8, e77037 (2013).
  17. Zou, J., et al. Effect of resveratrol on intimal hyperplasia after endothelial denudation in an experimental rabbit model. Life Sci. 68, 153-163 (2000).
  18. Li, M., Zhang, Y., Ren, H., Zhang, Y., Zhu, X. Effect of clopidogrel on the inflammatory progression of early atherosclerosis in rabbits model. Atherosclerosis. 194, 348-356 (2007).
  19. Nakazawa, G., et al. Evaluation of polymer-based comparator drug-eluting stents using a rabbit model of iliac artery atherosclerosis. Circ Cardiovasc Interv. 4, 38-46 (2011).
  20. Van Dyck, C. J., et al. Resolute and Xience V polymer-based drug-eluting stents compared in an atherosclerotic rabbit double injury model. Catheter Cardiovasc Interv. 81, E259-E268 (2013).
  21. Abran, M., et al. Validating a bimodal intravascular ultrasound (IVUS) and near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for atherosclerotic plaque detection in rabbits. Biomed Opt Express. 6, 3989-3999 (2015).
  22. Kanamasa, K., et al. Recombinant tissue plasminogen activator prevents intimal hyperplasia after balloon angioplasty in hypercholesterolemic rabbits. Jpn Circ J. 60, 889-894 (1996).
  23. Pai, M., et al. Inhibition of in-stent restenosis in rabbit iliac arteries with photodynamic therapy. Eur J Vasc Endovasc Surg. 30, 573-581 (2005).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
  25. Chaytor, A. T., Bakker, L. M., Edwards, D. H., Griffith, T. M. Connexin-mimetic peptides dissociate electrotonic EDHF-type signalling via myoendothelial and smooth muscle gap junctions in the rabbit iliac artery. Br J Pharmacol. 144, 108-114 (2005).
  26. Zhang, W., Trebak, M. Vascular balloon injury and intraluminal administration in rat carotid artery. J Vis Exp. (94), (2014).
  27. Maillard, L., et al. Effect of percutaneous adenovirus-mediated Gax gene delivery to the arterial wall in double-injured atheromatous stented rabbit iliac arteries. Gene Ther. 7, 1353-1361 (2000).
  28. Sharif, F., et al. Gene-eluting stents: adenovirus-mediated delivery of eNOS to the blood vessel wall accelerates re-endothelialization and inhibits restenosis. Mol Ther. 16, 1674-1680 (2008).
  29. Lee, J. M., et al. Development of a rabbit model for a preclinical comparison of coronary stent types in-vivo. Korean Circ J. 43, 713-722 (2013).
  30. Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods Mol Med. 139, 1-30 (2007).
  31. Asada, Y., et al. Effects of inflation pressure of balloon catheter on vascular injuries and subsequent development of intimal hyperplasia in rabbit aorta. Atherosclerosis. 121, 45-53 (1996).
  32. Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J. Experimental atherosclerosis in rabbits. Arq Bras Cardiol. 95, 272-278 (2010).
  33. Waksman, R., et al. PhotoPoint photodynamic therapy promotes stabilization of atherosclerotic plaques and inhibits plaque progression. J Am Coll Cardiol. 52, 1024-1032 (2008).
  34. Fernandez-Parra, R., et al. Pharmacokinetic Study of Paclitaxel Concentration after Drug-Eluting Balloon Angioplasty in the Iliac Artery of Healthy and Atherosclerotic Rabbit Models. J Vasc Interv Radiol. 26, 1380-1387 (2015).
  35. Dussault, S., Dhahri, W., Desjarlais, M., Mathieu, R., Rivard, A. Elsibucol inhibits atherosclerosis following arterial injury: multifunctional effects on cholesterol levels, oxidative stress and inflammation. Atherosclerosis. 237, 194-199 (2014).
  36. Manderson, J. A., Mosse, P. R., Safstrom, J. A., Young, S. B., Campbell, G. R. Balloon catheter injury to rabbit carotid artery. I. Changes in smooth muscle phenotype. Arteriosclerosis. 9, 289-298 (1989).
  37. Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
  38. Fulcher, J., Patel, S., Nicholls, S. J., Bao, S., Celermajer, D. Optical coherence tomography for serial in vivo imaging of aortic plaque in the rabbit: a preliminary experience. Open Heart. 2, e000314 (2015).
  39. Abela, O. G., et al. Plaque Rupture and Thrombosis: the Value of the Atherosclerotic Rabbit Model in Defining the Mechanism. Curr Atheroscler Rep. 18, 29 (2016).
  40. Yamashita, A., Asada, Y. A rabbit model of thrombosis on atherosclerotic lesions. J Biomed Biotechnol. 2011, 424929 (2011).

Tags

चिकित्सा अंक १२८ Atherosclerosis खरगोश श्रोणि धमनी कैथेटर गुब्बारा चोट Endothelium पट्टिका
त्वरित Atherosclerosis के खरगोश मॉडल: श्रोणि धमनी गुब्बारा चोट के एक Methodological परिप्रेक्ष्य
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jain, M., Frobert, A., Valentin, J., … More

Jain, M., Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Giraud, M. N. The Rabbit Model of Accelerated Atherosclerosis: A Methodological Perspective of the Iliac Artery Balloon Injury. J. Vis. Exp. (128), e55295, doi:10.3791/55295 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter