Introduction
体内全身成分分析允许科学家以最可靠的方式研究细胞行为。当细胞细胞相互作用（接触和非接触依赖性）受到严重影响时，尤其是在神经系统中，膜电压变化驱动可激活细胞之间的通讯。理解由这些电信号编码的信息是了解神经系统在生理和疾病状态下工作的方式的关键。
为了研究大多数非侵入性生理条件下的细胞电学性质，最近开发出几种遗传编码电压指标1 。与前几代光电压传感器（主要是电压敏感染料） 2相反，GEVIs允许完整神经系统的体内分析，以及它们的表达可以限于特定的细胞类型或种群。
斑马鱼胚胎是体内 “底物”，可以利用GEVIs的巨大潜力。事实上，由于其光学透明度及其简化且进化上保守的神经系统，斑马鱼模型允许直接识别和操纵网络中的每个蜂窝组件。事实上，使用基于FRET的GEVI美人鱼3导致在肌萎缩性侧索硬化（ALS）斑马鱼模型中鉴定脊髓运动神经元行为的先兆症状变化4 。
以下体内协议描述了如何以神经元特异性方式监测表达美人鱼的完整斑马鱼胚胎中脊髓运动神经元的电学性质。此外，它展示了药理学诱导的chan具有这种电性质的ges可能与胚胎自发盘旋的频率的变化相关联，这种变化的运动活动表征斑马鱼在非常早期的发育阶段的运动行为。
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Protocol
pHuC_Mermaid质粒生成
注意：美人鱼是通过配对肠绒氨酸杆菌的电压感应域（VSD）开发的生物传感器（现在 Ciona robusta ） 5含有FRET配对荧光团Umi-Kinoko Green（mUKG：供体）的磷酸酶（Ci-VSP）的电压传感器和橙色发射荧光蛋白Kusabira Orange（mKOk：受体）的单体版本。对于该生物传感器，通过膜去极化诱导的VSD结构域的构象变化增加了供体和受体荧光蛋白的接近度，从而增加它们之间的能量转移（增加FRET比率） 3 。 VSD保证生物传感器在质膜上的有效定位。生物传感器（在脊髓中，信号在中间神经元和运动神经元中均可检测到）的神经元表达是通过克隆美人鱼操作en阅读框（ORF）在斑马鱼泛神经启动子HuC 6下 。
- 使用T3通用引物和Mermaid Sma I引物（5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA）通过聚合酶链反应（PCR）从pCS4 +美人鱼质粒3与Pfu（校正）DNA聚合酶通过聚合酶链反应（PCR）扩增Mermaid ORF，以在上游插入Sma I限制性位点的美人鱼ORF。
- 使用以下PCR混合物：0.5μLPfu DNA聚合酶，7.5μL特异性10×缓冲液，1μL10mM dNTPs，2.5μL二甲基亚砜（DMSO），0.5μL（50ng）质粒制备物和1 μL每个引物的20μM储备溶液，总体积为50μL。
- 在95℃下将PCR混合物加热15秒，在50℃下加注15秒，并在72℃下延长4分钟，总共35个循环。
- 凝胶纯化具体钝PCR产物使用商业凝胶纯化试剂盒，遵循制造商的方案。
- 根据制造商的方案将DNA片段克隆到pCMV-SC钝化载体中。
- 将Mermaid阳性质粒（命名为pCMV-SC_Mermaid）与Sma I限制酶线性化，用于以下插入HuC启动子。
- 设置限制反应如下：0.5μL（10U） SmaI限制酶，2μL试剂盒10x缓冲液和5μg总体积为20μL的质粒DNA。将反应在25℃下孵育1小时。
- 使用商业凝胶纯化试剂盒按照制造商的方案对消化的质粒进行凝胶纯化。
- 使用一对HuC特异性引物（HuCprom-forw1_SalI：5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA和HuCpro），以Pfu DNA聚合酶和斑马鱼基因组DNA为模板，PCR扩增HuC启动子（pHuC）m-rev1：5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG），跨越ATG上游的3,150-bp区域。
- 使用以下方案设置PCR混合物：将0.5μLPfu DNA聚合酶，7.5μL特异性10×缓冲液，1μL10mM dNTP，2.5μLDMSO，200ng基因组DNA和1μL20μM每个引物的储备溶液总体积为50μL。
- 在95℃下进行2分钟的初始步骤后，将PCR混合物在95℃加热15秒，在50℃下加热15秒，并在72℃下延长4分钟，总共35个循环。
- 按照制造商的方案，使用商业凝胶纯化试剂盒纯化特异性钝性PCR产物。
- 使用1μLT4 DNA连接酶和1μL10μL总体积的特异性10X缓冲液，将等摩尔量的纯化的pCMV-SC_Mermaid（步骤1.5）和pHuC DNA（步骤1.7）。将反应温育16小时4°C。
- 根据制造商的说明书，用5μL连接反应（步骤1.8）转化感受态细胞的等分试样。
- 选择pHuC阳性克隆（pHuC_Mermaid），启动子通过SalⅠ -EcoVR双重消化（ Sal I限制性位点插入到启动子片段的上游，而Eco RV限制性位点位于pCMV-SC质粒的多聚腺苷酸化区PolyA的下游）。
- 设置限制反应如下：将0.5μL（10U）的Sal I和Eco RV限制酶，2μLkit10X缓冲液和1μg的pHuC_Mermaid DNA，总体积为20μL。将反应在37℃下孵育1小时。将反应运行到琼脂糖凝胶上。
胚胎显微注射
- 转移受精的例如使用塑料移液器从野生型（AB株）或Sod1-G93R成年斑马鱼4获得的gs至10mm培养皿。
- 在冷（4℃）的鱼水中冲洗胚胎，并立即用200微克的pHuC_Mermaid质粒使用微量注射器（有关显微注射程序的全面和详细描述，参见参考文献7和8）将其微量注射到卵黄中。
- 使用塑料移液器将胚胎转移到培养皿中，并将它们在28℃的鱼水中孵育，直到达到所需的发育阶段（受精后20-24小时），进行以下分析。
3.自发尾线卷绕分析
注意：评估20-24 hpf胚胎中有或没有药物利鲁唑的自发尾丝卷曲行为。
- 将胚胎转移到装有含有0.2％DMSO（瑞利唑载体）的鱼水的90mm圆形培养皿中，并使用two具有尖锐技巧的珠宝商的镊子。孵育胚胎5分钟。
- 在使用安装在立体显微镜上的数码相机进行1分钟的录像时，可以在RT检测尾盘。以30帧/秒的时间分辨率获取时间序列。
- 通过计算每个时间单位的弯曲数（对侧和同侧）的数量来计算自发尾盘的频率。
- 为了评估药物利鲁唑的效果，轻轻地使用塑料巴斯德移液器将胚胎转移到装有含有5μM利鲁珠的鱼的新的90mm培养皿中。
- 孵育胚胎5分钟，然后记录1分钟的视频并执行如上所述的行为分析。
美人鱼生物传感器可视化在生物胚胎中的成像设置：同时检测供体和受体信号
- 将20 - 24 hpf胚胎装入1％低熔点琼脂糖的鱼水中37°C在一个35毫米玻璃底的成像盘。定位在他们身边的胚胎。等待琼脂糖在室温下固化。
- 将成像盘转移到安装在倒置显微镜上的反相共聚焦阶段。通过用488nm氩激光线激发mUKG并记录其在495和525nm之间的发射，用20X物镜（0.7数值孔径NA）来识别表达生物传感器的运动神经元。
- 对于FRET测量，使用488nm激光线激发FRET对的供体mUKG。同时使用在双向模式下以8,000Hz工作的谐振扫描器，由供体（495和525nm）发射的荧光和由mKOk受体发射的荧光（550和650nm之间的FRET通道）发射的荧光。如果可用，请使用473 nm激光。
注意：供体的激发效率将稍微降低（85％而不是93％，488 nm），但受体的交叉激发将也可以减少（从478 nm激光线到488 nm到17％的17％）。 - 为了减少光毒性和荧光团漂白，通过降低激光线的功率（在采集软件的光束路径窗口）来最小化样品的照度。
- 优化激励以匹配在实验开始时设置的增益和偏移参数，并在整个会话期间保持不变。要设置偏移量，请将图像的颜色更改为强度值（通过使用Q查找表），然后在关闭激光扫描时，转动偏移旋钮（智能偏移），使背景像素稍微强度高于零。使用相同的查找表，扫描时切换激光，转动增益旋钮（智能增益）以最大化信噪比，小心避免饱和像素。
- 使用打开的针孔（2个通风单元），获取16位图像，以提供足够的动态范围进行定量e分析。避免平均以提高采集速度并减少光漂白。
- 在软件采集窗口中，从下拉菜单中选择512 x 64像素（像素大小：605 nm）的图像字段大小。
- 从采集模式窗口中，从下拉菜单中选择xyt （时间流逝，单个xy平面），通过获取单个xy平面记录胚胎脊髓神经元电压的变化，设置采集参数，每30个记录一个图像ms 1分钟
- 为了评估利鲁唑给药对相同神经元膜去极化的影响，在加入含有5μM利鲁珠的鱼水后5分钟获得一个新的数据。
- 对于FRET分析，使用ImageJ宏Biosensor_FRET（表示单链FRET生物传感器。
- 评估t 1处的每个神经元的基底膜FRET比例为（（FRET平均值 - FRET背景）/（供体平均值 - 供体背景）），其中FRET和Don或平均强度是在获取的每个通道的细胞周围绘制的相同感兴趣区域（ROI）中计算的平均荧光强度，FRET和供体背景是在没有荧光样品的视场的ROI中计算的平均荧光强度。
注意：有关插件使用的详细分步说明， 请访问www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret网站。 - 使用图形软件比较不同实验范例之间的去极化的频率，幅度和持续时间。使用不配对的学生t检验比较两组，并将P <0.05时的平均值视为统计学差异。
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Representative Results
携带在pHuC泛神经元启动子控制下的基于FRET的美人鱼生物传感器编码序列的表达载体，其驱动仅在神经系统中的蛋白质的合成，通过显微注射递送到单细胞受精卵中为了获得瞬时转基因胚胎（ 图1 ， 左图）。掌握显微注射技术后，美人鱼阳性胚胎的百分比接近100％。其中，只有在质膜上仅表达适量的美人鱼生物传感器的胚胎被考虑用于FRET分析/图像采集。
自发盘旋，仅由全身收缩组成的运动反应，使尾部尖端头部10,10记录在20级-24 hpf在常规鱼类培养基（ 图1 ，中心面板和视频1 ），然后在5μM利鲁唑中孵育（ 视频2 ）。在药物利鲁唑引发的自发尾盘频率变化的统计分析报道在其他地方4 。
为了检测脊髓运动神经元电活动的改变是否是基于利拉唑引起的自发卷取频率的变化，以非侵入性方式研究了胚胎脊髓运动神经元中的膜电位，测量荧光强度美人鱼生物传感器的供体/受体FRET对的比例（FRET比： 图1 ，右图）。鉴定出表达生物传感器的主要脊髓运动神经元（ 图2A ），并记录其基础自发去极化活动（
图1：实验程序流程图。收集单细胞期胚胎，并立即用pHuC_Mermaid质粒显微注射以泛神经元方式表达美人鱼FRET电压生物传感器。在28-24℃下孵育20-24hpf，将单个胚胎在立体显微镜下转移，并且在鱼水中存在和不使用药物利鲁唑的自发尾盘活动被视频记录和分析。相同的胚胎经历体内 FRET分析，以测量运动神经元膜电位的变化。href =“http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55297/55297fig1large.jpg”target =“_ blank”>请点击此处查看此图的较大版本。
图2： 用于测量运动神经元膜电位变化的 体内 FRET分析。 （ A ）野生型斑马鱼胚胎与基于FRET的电压生物传感器美人鱼在脊髓神经元中的镶嵌表达。 （a）明场图像显示由黑匣子（sc：spinal cord; ms：myoseptum; m：myotome）识别的斑马鱼树干的面积。通过叠加在（a）检测到的荧光信号（b）上，生物传感器在初级脊髓运动神经元（PM）中的有效表达可以清楚地可视化。检测到供体（c）和FRET（d）通道用相应的绿色和品红色查找表（LUT）显示，在右侧。所有的胚胎都以颅尾方向安装。刻度棒=10μm。 （ B ）FRET比率图显示在相同的运动神经元中每0.03s计算的FRET比率。它显示细胞经历的基础自发去极化活动。对于美人鱼生物传感器，当膜电位增加时，FRET比例的增加。刻度棒=10μm。 （ C ）在1分钟记录期间，在Sod1-G93R斑马鱼胚胎的脊髓运动神经元中发生的自发平均FRET比率变化的代表性实例。利鲁唑给药降低了自发去极化的频率。 请点击此处查看此图的较大版本。
电影1：24-hpf野生型对照胚胎中的自发尾盘卷曲。代表记录显示在鱼水中孵育的24 hpf野生型对照胚胎中自发尾盘卷曲。 请点击此处查看此视频。 （右键单击下载。）
电影2：24-hpf野生型 利鲁唑治疗胚胎中的 自发尾盘 卷曲。代表记录显示在5μM利鲁唑（+ R）中孵育的24hpf野生型对照胚胎中自发尾盘卷曲。与对照相比，+ R胚胎在24 hpf时显示自发尾盘卷曲行为的频率显着降低。 请点击此处查看此视频。 （钻机点击下载。）
电影3：20 hpf的野生型斑马鱼胚胎脊髓中主要运动神经元的基底自发去极化活动。美人鱼生物传感器非常敏感，可以检测完整胚胎脊髓运动神经元膜电位的快速变化。 请点击此处查看此视频。 （右键单击下载。）
电影4：自发去极化活动与肌肉收缩相结合。在20 hpf的野生型斑马鱼胚胎脊髓中的次级运动神经元经历自发去极化。在这种情况下，极化与斑马鱼肌肉的收缩有关，在这个发育阶段组织在功能上同步的合胞体中。 请点击此处查看此视频。 （右键单击下载。）
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Discussion
这里提出的方案允许我们探讨斑马鱼胚胎脊髓运动神经元的电性质与自发卷取行为之间的关联，最早的定型运动活动，出现在17 hpf的胚胎发育，并持续到24 hpf 10 。
我们的方法为研究人员提供了研究完整胚胎神经系统的工具，充分保护了开发功能网络中细胞间相互作用的复杂性。斑马鱼胚胎的体内成像通过将其浸入低熔点琼脂糖中简单地固定来进行。通过使用生物传感器研究细胞膜电位的变化是该方法的主要优点之一。规范的电生理方法，其中神经元必须通过去除包络组织11进行物理访问，是程序可能会改变被检测细胞的电学性质。此外，基于FRET的生物传感器方法允许在不使用麻醉剂（ 即，三聚氰胺钠通道阻断剂）的情况下研究细胞电性质，避免与施用化学物质（ 即，这里的利鲁唑）相关的任何潜在的干扰，其中可能在实验计划中至关重要。这种方法使我们能够专注于自发尾丝圈的电活动和频率的调节，这种行为反应在大多数情况下防止没有施用麻醉剂的电生理记录。最后，GEVI的使用提供了最高的时间实验控制，因为它允许在特定的胚胎发育阶段进行工作。我们的成像/录制会议跨越了非常有限的时间窗口，使我们能够准确地比较不同胚胎的发育阶段。所有相反，传统的电生理记录通常以较大和较不精确的时间跨度进行。
然而，通过成像技术测量电压变化本质上是困难的，因为信号本身的性质可以在速度，频率以及膜电位变化的大小方面发生变化。理想的电压传感器应结合快速响应，高灵敏度和高光子发射。对于大多数基于FRET的GEVI，比例变化随着膜电压变化而变化，但是荧光比变化的幅度与去极化事件的持续时间紧密相关。最近，开发了新的GEVI和特征，从而可以选择与实验问题，模型和成像设备类型相关的最佳探针。
电压生物传感器是一体的膜蛋白。当转染培养细胞或表达时在活生物体中，质膜局部传感器的荧光在一定程度上将与其它细胞内区室中的传感器的荧光相关，其中蛋白质可能被错误定位或聚集，从而产生背景信号。在使用活体内的生物传感器之前，应在简化的实验模型（ 即转染细胞系或原代培养物）中监测每种构建体的表达水平和适当的膜定位。
在本实验装置中，该方案的另一潜在关键步骤可能由转基因程序的效率表示。如果需要，通过使用Tol2转座子系统12可以显着增加质粒阳性细胞的百分比。需要考虑的另一个关键方面是供体荧光团中荧光发射的损失和FRET信号的损失由于强烈的照明，在成像会话期间发生。应该通过最小化样品的照度来避免这种情况，从而降低所用激光线的功率。类似地，必须在每个记录会话开始时仔细地调整光电倍增管的增益和偏移，以获得所获取图像中的最佳信噪比，并避免饱和像素。所有这些参数可以根据检查的细胞的类型，生物传感器的特征和用于图像采集的仪器而变化（如近来描述的那样，也可以使用宽视场荧光显微镜）。然而，研究人员应该总是考虑在体内成像期间，噪声水平可能会干扰传感器的特定信号，而不是体外记录。最后，如果可用，使用不响应电压的突变型探针的控制测量将是一种方便的方法以评估系统特定噪声和/或伪像的水平。
斑马鱼胚胎的使用代表了这种方法的一个关键特征，这要归功于对遗传操作和微观调查的反应。事实上，这些特征使得瞬态发生和基于FRET的神经元电学性质分析是可行的。在我们看来，使用最适合的启动子和生物传感器组合，有可能有选择地分析任何感兴趣的细胞类型的电活动并且与胚胎表型平行。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 600389 | |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 | |
| Universal SmaI primer | Eurofins | ||
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 240228 | |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 | |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F | |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | ||
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
References
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