Introduction
生体内の全身成分分析により、科学者は最も信頼性の高い方法で細胞の行動を調べることができます。膜電圧の変化が興奮性細胞間の伝達を促進する神経系のように、精査中の活性が細胞 - 細胞相互作用（接触および非接触依存）によって大きく影響を受ける場合、これは特に当てはまります。これらの電気信号によってコード化された情報の理解は、神経系が生理学的状態および疾患状態の両方で働く方法を理解するための鍵である。
最も非侵襲性の生理学的条件における細胞の電気的特性を研究するために、いくつかの遺伝的にコード化された電圧指示薬が最近開発されている1 。以前の世代の光電圧センサ（主に電圧感受性色素） 2とは対照的に、GEVIはインタクトな神経系の生体内解析を可能にし 、それらの発現は、特定の細胞型または集団に限定することができる。
ゼブラフィッシュの胚は、GEVIに起因する大きな潜在的可能性を利用するための生体内の 「基質」です。実際、ゼブラフィッシュモデルは、その光学的明瞭性と簡略化され、進化的に保存された神経系のおかげで、ネットワーク内のすべての細胞成分を簡単に同定し、操作することができます。実際、FRETに基づくGEVI Mermaid 3の採用により、筋萎縮性側索硬化症（ALS） 4のゼブラフィッシュモデルにおける脊髄運動ニューロン挙動の予兆的な変化が同定された4 。
以下のin vivoプロトコルは、ニューロン特異的様式でマーメイドを発現する完全なゼブラフィッシュ胚における脊髄運動ニューロンの電気的特性をどのように監視するかを記載する。また、どのように薬理学的に誘発されたchanこのような電気的性質の変化は、発達の非常に初期の段階でゼブラフィッシュの運動挙動を特徴付けるステレオタイプの運動活動である、胚性の自発的な巻き取りの頻度の変化に関連し得る。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. pHuC_Mermaidプラスミドの生成
注：マーメイドは、 Ciona intestinalisの電圧感知ドメイン（VSD）をペアにして開発されたバイオセンサーです FRETパートナーフルオロフォアUmi-Kinoko Green（mUKG：ドナー）およびオレンジ発光蛍光タンパク質Kusabira Orange（mKOk：アクセプター）の単量体バージョンを用いて、ホスファターゼ（Ci-VSP）を含むCiona robusta ） 5電圧センサー。このバイオセンサーでは、膜脱分極によって誘導されるVSDドメインの構造変化が、ドナーおよびアクセプター蛍光タンパク質の近接を増加させるため、それらの間のエネルギー移動を増加させる（FRET比を増加させる） 3 。 VSDは、原形質膜におけるバイオセンサーの効率的な局在を保証する。バイオセンサーの神経細胞の発現（脊髄において、シグナルは、介在ニューロンおよび運動ニューロンの両方において検出可能である）は、マーメイドオペレーションをクローニングすることによって達成されるゼブラフィッシュ汎 - 神経系プロモーターHuC 6の下で、フレームリーディングフレーム（ORF）にクローニングした。
- 上流のSmaI制限酵素部位を挿入するために、T3ユニバーサルプライマーおよびマーメイドSmaIプライマー（5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA）を用いて、Pfu（プルーフリーディング）DNAポリメラーゼを用いて、マーセイドORFをpCS4 +マーメイドプラスミド3からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅する。マーメイドORFの
- 以下のPCR混合物を使用する：0.5μLのPfu DNAポリメラーゼ、7.5μLの特定の10倍緩衝液、1μLの10mM dNTP、2.5μLのジメチルスルホキシド（DMSO）、0.5μL（50ng）のプラスミド調製物、および1 50μLの全容量中の各プライマーの20μMストック溶液μL。
- 95℃で15秒間PCR混合物を加熱し、50℃で15秒間プライミングし、72℃で4分間、合計35サイクル伸長する。
- 特定の鈍器をゲル精製するPCR産物を、市販のゲル精製キットを使用して、製造者のプロトコールに従って精製した。
- 製造業者のプロトコールに従って、DNA断片をpCMV-SC平滑末端ベクターにクローニングする。
- HuCプロモーターの以下の挿入のために、マーメイド陽性プラスミド（pCMV-SC_Mermaidと名付けた）をSmaI制限酵素で線状化する。
- 以下のように制限反応を設定する： Sma I制限酵素0.5μL（10U）、キット10x緩衝液2μLおよびプラスミドDNA5μgを総容量20μLで加える。反応液を25℃で1時間インキュベートする。
- 製造業者のプロトコールに従い、市販のゲル精製キットを用いて消化したプラスミドをゲル精製する。
- 1対のHuC特異的プライマー（HuCprom-forw1_SalI：5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCAおよびHuCpro）を用いて、鋳型としてPfu DNAポリメラーゼおよびゼブラフィッシュゲノムDNAを用いてHuCプロモーター（pHuC）をPCR増幅する。m-rev1：5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG）およびATGの3,150bp上流領域にわたる。
- 以下のスキームを使用してPCR混合物をセットアップする：0.5μLのPfu DNAポリメラーゼ、7.5μLの特定の10倍緩衝液、1μLの10mM dNTP、2.5μLのDMSO、200ngのゲノムDNA、および1μLの20μM各プライマーのストック溶液を全量50μLで加える。
- 95℃で2分間の初期段階の後、95℃で15秒間PCR混合物を加熱し、50℃で15秒間プライミングし、72℃で4分間、合計35サイクル伸長する。
- 製造業者のプロトコールに従い、市販のゲル精製キットを用いて特異的な鈍化PCR産物をゲル精製する。
- 1μLのT4 DNAリガーゼおよび1μLの特定の10X緩衝液を用いて、等容積の精製したpCMV-SC_Mermaid（ステップ1.5）およびpHuC DNA（ステップ1.7）を総容量10μLでライゲーションする。反応を16時間インキュベートする。4℃。
- コンピテント細胞のアリコートを、ライゲーション反応（ステップ1.8）5μLで、製造者の指示に従って形質転換する。
- Sal I- Eco RV二重消化により適切な向きに挿入されたプロモーターを有するpHuC陽性クローン（pHuC_Mermaid）を選択する（ SalI制限部位は、ステップ1.6においてプロモーター断片の上流に挿入されているが、 Eco RV制限部位pCMV-SCプラスミドのポリアデニル化領域、ポリAの下流に位置する）。
- 以下のように制限反応を設定する： SalIおよびEco RV制限酵素0.5μL（10U）、キット10X緩衝液2μL、およびpHuC_Mermaid DNA1μgを総容量20μLで調製する。反応液を37℃で1時間インキュベートする。アガロースゲル上で反応を実行する。
2.胚マイクロインジェクション
- 受精したものを移す野生型（AB株）またはSod1-G93R成人ゼブラフィッシュ4から得られたgsをプラスチックピペットを用いて10mmペトリ皿に移した。
- 冷たい（4℃）魚の水で胚を洗い流し、マイクロインジェクターを用いて200μgのpHuC_Mermaidプラスミドで卵黄にマイクロインジェクションします（マイクロインジェクション手順の全体的および詳細な説明については参考文献7および8を参照）。
- プラスチックピペットを使用して、胚をペトリ皿に移し、以下の分析のために所望の発生段階（20-24時間の受精後、hpf）に達するまで28℃で魚の水中でそれらをインキュベートする。
3.自発的テールコイルリング解析
注：20-24 hpfの胚で、薬物リルゾールの有無にかかわらず、自発的な尾巻作用を評価する。
- 胚を、0.2％DMSOを含有する魚の水で満たした90mm丸型ペトリ皿（リルゾール賦形剤）に移し、手動で脱蝋する。o鋭い先端を持つ宝石商の鉗子。胚を5分間インキュベートする。
- 実体顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラを使用して1分間のビデオ録画中にRTで尾巻を検出する。 30フレーム/秒の時間分解能で時系列を取得する。
- 時間単位あたりの屈曲の数（対側および同側の両方）を数えることによって、自発的な尾巻コイルの頻度を計算する。
- 薬物リルゾールの効果を評価するために、穏やかにプラスチックパスツールピペットを使用して、胚を5μMリルゾールを含む魚の水で満たされた新しい90mmペトリ皿に移す。
- 胚を5分間インキュベートしてから、1分間のビデオを記録し、上記のように行動分析を行う。
4.生きた胚におけるマーメイドバイオセンサーの可視化のためのイメージングセットアップ：ドナーシグナルとアクセプターシグナルの同時検出
- 魚水中の1％低融点アガロースに20〜24 hpfの胚をマウントする。35mmガラス底のイメージングディッシュ内で37℃。胚を両側に向けます。アガロースが室温で凝固するまで待つ。
- イメージングディッシュを、倒立顕微鏡に取り付けられた倒立共焦点のステージに移す。 488 nmアルゴンレーザーラインでmUKGを励起し、その発光を495〜525 nmの間で記録することによって、20X対物レンズ（0.7開口数、NA）でバイオセンサーを発現する運動ニューロンを同定する。
- FRET測定のために、FRETペアのドナーであるmUKGを488 nmレーザーラインで励起します。双方向モードで8,000Hzで動作する共鳴スキャナで、ドナーから放出された蛍光（495〜525nm）とmKOkアクセプター（550〜650nm、FRETチャネル）によって放出された蛍光とを同時に検出する。可能であれば、473 nmレーザーを使用してください。
注：ドナーの励起効率はわずかに低下する（488nmで93％の代わりに85％）が、アクセプタの交差励起は（473nmレーザーラインでは488nmで17％から9％に減少する）。 - 光毒性および蛍光色素漂白を低減するためには、（収集ソフトウェアのビーム経路ウィンドウ上の）レーザーラインの出力を減少させることによって、試料の照射を最小化する。
- 実験の始めに設定され、セッション中一定に保たれるゲインとオフセットのパラメータを一致させるために、励起を最適化します。オフセットを設定するには、イメージの色を（Qルックアップテーブルを使用して）強度値に変更し、レーザーオフでスキャンしながら、オフセットノブ（スマートオフセット）を回して、背景ピクセルの強度がわずかになるようにしますゼロより高い。同じルックアップテーブルを使用して、スキャン中にレーザーをオンにすると、飽和ピクセルを避けるように注意しながら、ゲインノブ（スマートゲイン）を回して信号対ノイズ比を最大にします。
- 開いたピンホール（2エアリーユニット）を使用して、16ビット画像を取得して定量化に十分なダイナミックレンジを提供しますeを分析する。平均化を避けて取得速度を上げ、光退色を最小限に抑えます。
- ソフトウェア取得ウィンドウで、ドロップダウンメニューから512 x 64ピクセル（ピクセルサイズ：605 nm）のイメージフィールドサイズを選択します。
- 取得モードウィンドウから、ドロップダウンメニューからxyt （単一のxy平面上の時間経過）を選択し、単一のxy平面を取得し、取得パラメータを設定して1つの画像を30ごとに記録することによって、胚の脊髄ニューロン電圧の変化を記録するmsで1分間。
- 同じニューロンにおける膜脱分極に対するリルゾールの投与の効果を評価するために、5μMのリルゾールを含有する魚の水を添加して5分後に新しいデータセットを取得する。
- FRET分析のために、ImageJマクロBiosensor_FRET（一本鎖FRETバイオセンサーを発現する）を使用する。
- （（FRET平均FRETバックグラウンド）/（ドナー平均 - ドナーバックグラウンド））として、各ニューロンの基底膜FRET比をt 1で評価する。ここで、FRETおよびドンまたは平均強度は、取得された各チャネルについて細胞周囲に描かれた同じ関心領域（ROI）で計算された平均蛍光強度であり、ドナーバックグラウンドは、蛍光サンプルなしの視野のROIで計算された平均蛍光強度である。
注記：プラグインの使用方法の詳細な説明は、 www.medc.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fretウェブサイトを参照してください。 - グラフ化ソフトウェアを使用して、異なる実験パラダイム間の脱分極の頻度、振幅および持続時間を比較する。ペアのないスチューデントのt検定を用いて2つの群を比較し、P <0.05のときに平均値を統計的に異なると考える。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRETに基づくマーメイドバイオセンサーコード配列を有する発現ベクターは、pHuC汎ニューロンプロモーターの制御下で、神経系においてのみタンパク質の合成を駆動し、単一細胞の受精卵に、マイクロインジェクションによって送達された一過性のトランスジェニック胚を得るために（ 図1 、 左パネル）。マイクロインジェクション技術を習得した後、マーメイド陽性胚の割合は100％に近かった。これらの中で、原形質膜で適切な量のマーメイドバイオセンサーを発現する胚のみがFRET分析/画像取得のために考慮された。
自発的巻上げ、尾の先端を頭部9,10 にもたらす全身収縮のみからなる運動応答を、20日の段階で記録した通常の魚培地（ 図1 、中央パネルおよびビデオ1 ）中で-24hpf、5μMリルゾール（ ビデオ2 ）でインキュベーションした。薬物リルゾールが誘発した自発的尾部コイル巻きの頻度の変化の統計的分析は、他の場所で報告されている4 。
脊髄運動ニューロンの電気的活動の変化がリルゾール誘発性の自発的巻き取り頻度の変化に基づいているかどうかを試験するために、胚脊髄運動ニューロンにおける膜電位を非侵襲的に研究し、蛍光強度マーメイドバイオセンサーのドナー/アクセプターFRET対の比（FRET比： 図1 、右パネル）。バイオセンサーを発現する一次脊髄運動ニューロンを同定し（ 図2A ）、それらの基底自発的脱分極活性を記録した（ 図2A ）
図1：実験手順のフローチャート。単一細胞期の胚を回収し、直ちにpHuC_Mermaidプラスミドでマイクロインジェクションして、マーメイドFRET-電圧バイオセンサーをパン - ニューロン様式で発現させる。 28℃で20-24hpfのインキュベーションで、単一の胚を実体顕微鏡下で移し、魚の水に存在する薬物リルゾールの有無にかかわらず、それらの自発的な尾巻活性をビデオ記録し、分析する。運動ニューロン膜電位の変化を測定するために、同じ胚をin vivo FRET分析にかけます。href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55297/55297fig1large.jpg" target = "_ blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2： 運動ニューロン膜電位の変化を測定するための インビボ FRET分析。 （ A ）脊髄ニューロンにおけるFRETベースの電圧バイオセンサーマーメイドのモザイク表現を伴う野生型ゼブラフィッシュ胚。 （a）明視野画像は、ブラックボックス（sc：脊髄; ms：myoseptum; m：myotome）によって同定されたゼブラフィッシュ幹の領域を示す。 （a）上に検出された蛍光シグナル（b）を重ね合わせることにより、一次脊髄運動ニューロン（PM）におけるバイオセンサーの効率的な発現を明確に視覚化することができる。検出されたドナー（c）およびFRET（d）チャネルは、それぞれ緑色およびマゼンタルックアップテーブル（LUT）で示され、右側にあります。全ての胚は頭蓋 - 尾方向に取り付けられている。スケールバー=10μm。 （ B ）FRET比マップは、同じ運動ニューロンにおいて0.03秒ごとに計算されたFRET比を表示する。これは、細胞が受ける基礎的な自発的脱分極活性を示す。マーメイドバイオセンサーの場合、膜電位が上昇するとFRET比の増加が起こる。スケールバー=10μm。 （ C ）1分の記録中にSod1-G93Rゼブラフィッシュ胚の脊髄運動ニューロンに発生する自発的平均FRET比変化の代表例。リルゾール投与は、自発的脱分極の頻度を減少させる。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
映画1：24時間hpf野生型コントロール胚における自発テイルコイリング。魚の水中でインキュベートした24hpf野生型対照胚における自発的な尾巻を示す代表的な記録。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）
ムービー2：24時間hpf野生型 リルゾール処理胚 における自発テールコイル 。 5μMのリルゾール（+ R）でインキュベートした24hpf野生型対照胚における自発的尾巻を示す代表的な記録。対照と比較して、+ R胚は、24hpfでの自発的尾巻作用の頻度の有意な減少を示した。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （リグダウンロードするにはht-クリックしてください。）
ムービー3：野生型ゼブラフィッシュ胎児の脊髄における一次運動ニューロンの基底自発脱分極活性20 hpf。マーメイドバイオセンサーは非常に敏感で、インタクトな胚の脊髄における運動ニューロン膜電位の急速な変化を検出することができる。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）
映画4：自然脱分極活性が筋肉収縮に結びついている 20hpfの野生型ゼブラフィッシュ胚の脊髄における二次運動ニューロンは、自発的脱分極を受ける。この場合、各de分極は、この発達段階で機能的に同期したシンシチウムで組織されたゼブラフィッシュ筋肉の収縮に関連する。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコールは、ゼブラフィッシュ胚脊髄運動ニューロンの電気的特性と、胚発生の約17hpfに現れ、24hpfまで持続する最も初期のステレオタイプ運動活性である自発的巻き取り行動との間の関連性を探索することを可能にした10 。
私たちのアプローチは、開発中の機能ネットワークにおける細胞間の相互作用の複雑さを完全に保ちながら、インタクトな胚の神経系を研究するツールを研究者に提供します。ゼブラフィッシュ胚のインビボイメージングは、低融点アガロース中に浸漬することによってそれらを単に固定化することによって実施されている。バイオセンサーの使用による細胞膜電位の変化の研究は、この方法の主な利点の1つである。エンベロープ組織11を除去することによってニューロンに物理的にアクセスしなければならないカノニカル電気生理学的アプローチは、検査中の細胞の電気的特性を変える可能性がある。さらに、FRETベースのバイオセンサーアプローチは、麻酔薬（ すなわち、ナトリウムチャンネルブロッカーであるTricaine）を使用することなく細胞の電気特性の研究を可能にし、化学薬品の投与に伴う潜在的な妨害（ すなわち、ここでのリルゾール）を回避する。実験計画では重要であるかもしれない。この方法は、麻酔薬の投与を伴わない電気生理学的記録を妨げる行動反応である、自発的な尾巻コイルの電気的活動および頻度の調節に焦点を当てることを可能にした。最後に、GEVIの雇用は、特定の胚発達段階での作業を可能にするため、最も時間的な実験管理を提供する。私たちの画像/記録セッションは非常に限られた時間枠にわたっており、異なる胚の発達段階をリアルタイムで正確に比較することができました。すべて逆に、従来の電気生理学的記録は、通常、より大きくより正確でない時間間隔で行われる。
しかしながら、信号電位の変化の速度、周波数及び大きさにおいて変化し得る信号そのものの性質のために、撮像技術による電圧変化の測定は本質的に困難である。理想的な電圧センサは、高速応答性、高感度、高光子放射を組み合わせる必要があります。ほとんどのFRETベースのGEVIでは、比率変化は膜電圧変動の関数として変化するが、蛍光比変化の振幅は脱分極事象の持続時間と密接に関連している。最近、新しいGEVIが開発され、特徴づけられ、実験的問題、モデル、イメージング装置のタイプに関連して最良のプローブを選択することが可能になる。
電圧バイオセンサーは内在性膜タンパク質である。培養細胞にトランスフェクトされた場合、または発現された場合細胞膜局在化センサーの蛍光は、タンパク質が誤って局在化または凝集して、バックグラウンドシグナルを生成する他の細胞内区画におけるセンサーの蛍光とある程度関連するであろう。生物におけるバイオセンサーを使用する前に、各構築物の発現レベルおよび適切な膜局在を、簡略化した実験モデル（ すなわち、細胞株または初代培養物をトランスフェクトする）においてモニターすべきである。
本実験装置において、プロトコルの別の潜在的に重要なステップは、遺伝子導入手順の効率によって表され得る。必要であれば、Tol2トランスポゾンシステム12を用いることにより、プラスミド陽性細胞の割合を大幅に増加させることができる。検討する必要があるさらに重大な側面は、ドナーフルオロフォアにおける蛍光発光の損失およびFRETシグナルにおける損失である強い照度のために撮像セッション中に発生する。これは、サンプルの照明を最小限に抑え、使用されるレーザーラインのパワーを低減することによって避けるべきです。同様に、光電子増倍管のゲインとオフセットは、取得した画像で最良の信号対雑音比を達成し、飽和ピクセルを避けるために、記録セッションの開始時に注意深く調整する必要があります。これらのパラメータはすべて、検査された細胞のタイプ、バイオセンサーの特性、および画像取得に使用される機器（最近記載されているように、広視野蛍光顕微鏡も使用することができる）に依存して変化し得る。しかし、研究者は、インビボイメージング中に 、ノイズレベルがインビトロ記録よりもセンサーの特異的シグナルを妨害する可能性が常にあると考えるべきである。最後に、利用可能であれば、電圧に反応しない突然変異プローブを用いた対照測定が便利な方法であろうシステム固有のノイズおよび/またはアーチファクトのレベルを評価する。
ゼブラフィッシュ胚の使用は、遺伝子操作および顕微鏡検査に対する応答性のおかげで、このアプローチの重要な特徴である。実際に、これらの特徴は一時的な遺伝子導入を行い、神経電気特性のFRETに基づく分析が実現可能である。私たちの意見では、最も適したプロモーターとバイオセンサーの組み合わせでは、関心のある任意の細胞タイプの電気的活性を選択的に分析し、そのような活性を胚表現型と並行させることが潜在的に可能である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 600389 | |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 | |
| Universal SmaI primer | Eurofins | ||
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 240228 | |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 | |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F | |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | ||
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
References
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515 (2016).
- Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879 (2015).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
- Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566 (2016).
