Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Burada açıklanan protokoller, araştırmacıların, hücrelerin bulunduğu ortamın bütünlüğünü değiştirmeden hücre iletişimini incelemelerine izin vermek için tasarlanmıştır. Spesifik olarak, omurilik nöronları gibi uyarılabilir hücrelerin elektriksel aktivitesini analiz etmek için geliştirilmiştir. Böyle bir senaryoda, omurga hücresinin bütünlüğünü korumak çok önemlidir, ancak ilgili sistemlerin anatomisini ve fizyolojik şeklini korumak da önemlidir. Gerçekten de, sinir sisteminin ve diğer karmaşık sistemlerin nasıl çalıştığının anlaşılması, sistemik bir yaklaşıma dayanmalıdır. Bu nedenle canlı zebra balığı embriyosu model sistem olarak seçilmiş ve embriyoların fizyolojik durumlarına müdahale edilmeden spinal nöron zarı voltaj değişiklikleri değerlendirilmiştir.
Burada, zebra balığı embriyolarının kullanımını FRET tabanlı bir biyosensörle birleştiren bir yaklaşım açıklanmaktadır. Zebra balığı embriyoları, çok basitleştirilmiş bir sinir sistemi ile karakterize edilir ve şeffaflıkları sayesinde görüntüleme uygulamaları için özellikle uygundur, bu da zebra balığı gelişimi sırasında plazma zarında floresan bazlı voltaj göstergelerinin kullanılmasına izin verir. Bu iki bileşen arasındaki sinerji, fizyolojik durumu bozmadan, bozulmamış canlı organizmalardaki hücrelerin elektriksel aktivitesini analiz etmeyi mümkün kılar. Son olarak, bu non-invaziv yaklaşım, diğer analizlerle (örneğin, burada gösterildiği gibi spontan hareket kayıtları) birlikte var olabilir.
Giriş
İn vivo sistemik bileşen analizi, bilim insanlarının hücresel davranışlarını en güvenilir biçimde araştırmalarını sağlar. İncelenen aktivite, membran voltajı değişikliklerinin uyarılabilir hücreler arasındaki iletişimi yönlendirdiği sinir sisteminde olduğu gibi, hücre-hücre etkileşimlerinden (temaslı ve temassız olmak üzere) büyük ölçüde etkilendiğinde, bu durum özellikle geçerlidir. Bu elektrik sinyalleri tarafından kodlanan bilginin anlaşılması, sinir sisteminin hem fizyolojik hem de hastalık hallerinde nasıl çalıştığı anlamanın anahtarıdır.
En invaziv olmayan fizyolojik koşullarda hücre elektriksel özelliklerini incelemek için....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. pHuC_Mermaid Plasmid Üretimi
NOT: Denizkızı, Ciona intestinalis'in voltaj algılama alanını (VSD) eşleştirerek geliştirilen bir biyosensördür (şimdi FRET partneri fluorophores Umi-Kinoko Green (mUKG: verici) ve turuncu-yayan floresan protein Kusabira Orange (mKOk: acceptor) monomerik versiyonu ile fosfataz (Ci-VSP) içeren 5 voltaj sensörü. Bu biyolojik sensör için, membranın depolarizasyonu ile uyarılan VSD alanının konformasyonel değişimleri, verici ve alıcı floresan proteinlerin yakınlığını arttırır, böylece aralarındaki enerji transferini arttırır (FRET Oranının arttırılması)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protein sentezini sadece sinir sisteminde yönlendiren pHuC pan-nöronal promotörün kontrolü altında FRET-esaslı Denizkızı biyosensör kodlama sekansını taşıyan bir ifade vektörü, tek hücreli döllenmiş yumurtalara bir mikroenjeksiyon vasıtasıyla Geçici transgenik embriyoların elde edilmesi için sipariş verme ( Şekil 1 , Sol panel). Mikroenjeksiyon tekniğini uyguladıktan sonra, Denizkızı pozitif embriyoların yüzdesi% 100'e yakıntı. Bunlardan FRET anali.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan protokol, zebrafish embriyo omurga motor nöronlarının elektriksel özellikleri ile embriyonik gelişimin yaklaşık 17 hpf'sinde görülen ve 24 hpf 10'a kadar uzanan ilk stereotipik motor aktivite olan spontan sarmal davranış arasındaki ilişkiyi keşfetmemizi sağladı.
Yaklaşımımız araştırmacılara, bozulmamış embriyoların sinir sistemini incelemek için geliştirilmiş bir işlevsel ağdaki hücreler arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığını tamamen koruyan b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, FRET görüntüleme analizine paha biçilmez desteği için Simona Rodighiero'ya teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Düşük Erime Noktalı Agaroz | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ DNA polimeraz | Agilent Technologies - Stratagene Ürünleri Bölümü | 600389 | |
| T3 Üniversal astar | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Jel ve PCR Temizleme sistemi | Promega | A9280 | |
| Universal SmaI astarı | Eurofins | ||
| StrataClone Memeli İfade Vektör Sistemi / pCMV-SC künt vektör | Agilent Technologies - Stratagene Ürünleri Bölümü | ||
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA ligaz | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm, cam tabanlı görüntüleme kabı ve nbsp; | Ibidi | 81151 | |
| forseps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Stereomikroskop | Leica Microsystems | M10 F | |
| Dijital kamera | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 yazılımı | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | ||
| Konfokal mikroskop (ters) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| ImageJ makro Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prizma 6.0c | GraphPad Yazılım, Inc |
Kaynaklar
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
