Summary
Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.
Abstract
Plasmodesmata (Pd) ağ geçitleri üzerinden bitki hücreleri arasında küçük ve büyük moleküllerin taşınmaktadır olarak işlev hücre hücre bağlantılardır. PD taşıma ile küçük moleküllerin, iyonlar ve su, pasif gerçekleşmesi için kabul edilir ise, biyolojik oluştururlar, böyle proteinler, hücre hücre aktarımı büyük olasılıkla belirli hedefleme sinyalleri içerir etkin bir mekanizma yoluyla oluşur molekül nakletti. Tanımlanan plasmodesmata (Pd) yerelleştirme sinyalleri (PLSs) kıtlığı ciddi protein sıralama anlayış kısıtladı yollar dahil bitki hücre hücre makromoleküllerin ulaşım ve iletişim. Bitki zenginliği endojen ve viral proteinler Pd, trafikten bilinen sadece üç PLSs bildirilmiştir bugüne kadar hepsi endojen bitki proteinleri. Böylece, gerekli ve Pd hedefleme, doğrudan yaşam için yeterli olan fonksiyonel bir PLS sırasını, tanımlamak için güvenilir ve sistematik deneysel bir strateji geliştirmek önemlidir bitki hücreleri. Burada, biz bir paradigma olarak Tütün mozaik virüsü (TMV) hücre hücre hareketi protein (MP) kullanarak böyle bir strateji tanımlarlar. Bu deneyler, tespit ve ilk karakterize viral PLS dikmek, en Pd hedeflenmiş proteinler serilerinde PLS keşfi için adapte edilebilir.
Introduction
Plasmodesmata (Pd) anahtar düzenleyiciler bitki gelişme ve mRNA ve küçük RNA molekülleri transkripsiyon faktörleri kadar morfogenez, hücreler arası taşıma için kanalların görevi. Ayrıca, polis bu makromoleküllerin taşıma kapasitesi onların hücreler arası forma için çoğu bitki virüsler tarafından enfeksiyon sırasında kullanılmaktadır; PD taşımak için bitki virüs hareketi proteinler (MPs), özellikle Pd1,2,3,4,5,6 için hedef olarak adlandırdığı özel proteinler geliştiğini , 7. Pd taşıma moleküler yollar büyük olasılıkla bu yolları taşınan proteinler hedef belirli serileri ile yakından bağlantılı. Böylece, bu Pd yerelleştirme sinyaller (PLSs) tanımlaması karşılık gelen Pd taşıma yolu tanı olabilir. Örneğin, farklı nükleer yerelleştirme sinyal (NLS) dizileri9,10için belirli olabilir farklı nükleer alma yolları için Pd taşıma8, kıyasen olacaktır. Kavramsal olarak, NLSs ve PLSs gerekli ve yeterli hedefleme için yarilabilir hücre altı hedefleme sıraları temsil eder. Ancak, NLSs11farklı olarak, PLSs sıra vukuf ciddi sınırlıdır. Özellikle, sadece dört protein sequences Pd hedefleme dahil, hepsiyle endojen bitki proteinleri türetilmiş bildirilmiştir. İlki KN112 -iç hücre katmanlardan bitki yaprak13 epidermis için hamle bir transkripsiyon faktörü-ve onun KNOX homologs14homeobox etki alanı tarafından temsil edilir. İkincisi de bir transkripsiyon faktörü, hücreler arası (BT) ticareti olarak açıklanan bir sözde PLS içerir Dof motifi15uzaklıktadır. PDLP1 plasmodesmata yerleşik tip 1 membran protein üçüncü dizisidir ve bir transmembran etki alanı16tarafından temsil edilir. Son olarak, sıra hedefleme dördüncü Pd son zamanlarda glycosylphosphatidylinositol (GPI) rapor edilmiştir-bağlantılı protein ve glycosylphosphatidylinositol (GPI) değişiklik sinyali17tarafından temsil edilir.
İlginçtir, çok yakın zamana kadar hiçbir PLSs bildirilmiştir için viral MPs. Önceki çalışmalarda sözde PLS serilerinde bitki viral MPs18,19ama hiçbir gerçek PLS Yani, gerekli ve yeterli Pd bir ilişkisiz kargo molekül () hedefleme için en az amino asit dizisi varlığı belirtilen örn., CFP) viral bir MP olduğu belirlendi. Henüz bu proteinler, Tütün mozaik virüsü (TMV), MP için hangi Pd Yerelleştirme ve taşıma gösterdiği20olmuştur ilk biriydi.
Bu boşluğu adrese TMV MP PLS tanımlamak için deneysel bir stratejisi geliştirdi. Bu strateji üç kavramlar üzerine dayanıyordu. (i) biz PLS gerekli ve yeterli protein Pd21' e hedefleme için en az amino asit dizisi olarak tanımlanır. (ii) çünkü TMV MP Öncelikle Pd hedefleyen ve bu kanalları22translocates, biz bu iki etkinlikler uncoupling ve iyi niyetli PLS, hangi görev sonraki taşıma için değil de yalnızca Pd hedefleme için tanımlama amaçlı. (iii) biz etkinlik, yapısal veya fonksiyonel olarak hedefleme onun Pd amino asit kalıntıları eklenmesi önemli için tanımlanan PLS analiz edildi. Bu yaklaşımı kullanarak, bir 50-amino asit kalıntı sıra amino-terminus iyi niyetli PLS davranır TMV MP, belirlendi. Bu protein tüm uzunluğu doymuş TMV MP parçaları bir dizi üreten, onların karboksil termini CFP ile etiketleme ve geçici onları bitki dokularda ifade tarafından yapıldı. PD yerelleştirme her test parçaları bir Pd marker protein, PDCB1 (Pd callose bağlayıcı protein 1)23coexpressing tarafından tespit edilmiştir. PLS temsil etmek için hala merkeze lokalize ama polisi, dizinlere değil en küçük parçası olarak kabul edildi. Son olarak, PLS alanin onun yapısı ve/veya işlev için gerekli anahtar amino asit kalıntıları belirlemek için taranan.
Oysa burada TMV MP PLS tanımlaması açıklayarak bu yaklaşım göstermek, o herhangi bir diğer Pd hedeflenmiş proteinler arasında PLSs keşfetmek için bitki patojenleri veya bitkiler kendileri ile kodlanmış olup olmadığını istihdam edilebilir; Bunun nedeni bizim yöntem viral MPs onların yetenek-e doğru hedef açısından herhangi bir benzersiz özelliklerinin avantajlarından merkeze almaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bitki materyali
- Bitki türlerinin seçimi
- Faiz, Yani, hangi endojen proteinler için bu protein kodlar ya da patojen viral proteinler için doğal konağını temsil eden bir protein için yerli bitki türü kullanın. Buna ek olarak, seçilen bitki türleri için geçici genetik dönüşüm yöntemi seçilen mükellef olması gerekir.
Not: Çalışmalar düzenli olarak TMV için iyi bir ev sahibi gösteren ve verimli bir şekilde genetik dönüşümü Agrobacterium aracılı tekniği, Yani, agroinfiltration tarafından dönüştürülür Nicotiana benthamiana, istihdam (bkz. Adım 3). İ. benthamiana bitkiler de kolayca yetişir ve kolayca Agrobacterium tarafından aşılamaya ve kolayca confocal mikroskobu tarafından analiz büyük yaprakları vardır. -
Bitki büyüme
- İ. benthamiana tohumları yüksek yoğunluklu, ıslak toprak bitki. 20-25 ˚C altında 16 h ~ 75 µmol fotonlar m-2 s-1 , ışık ve karanlığın 8 h kontrollü ortam odasında kalsın. Euphyll çapı 0.5 cm ulaştıktan sonra dikkatle için daha büyük tencere fide aktarmak ve büyüme aynı koşullar altında aynı odasında devam etmek.
- Onlar ne zaman en büyük 4-6 cm çapında yapraklar 4 hafta içinde 4-8-yaprak Sahne Alanı'na büyümek kadar bitkiler korumak; Şu anda, onlar agroinfiltration için kullanılabilir (bkz. Adım 3).
Not: gelişimsel bu aşamada yaprak mimari kez24,25bazen tutarsız sonuçlar için önde gelen, değişir çünkü çiçek başladılar da önemlisi, hiçbir zaman bitkiler kullanın.
2. ifade vektör İnşaat
-
İfade sistem seçimi
- En iyi maiyet-protein okudu bitki türleri ilgi ifade ifade sistemi, Yani, vektörel çizimler ve vektör Teslimat yöntemi, seçin.
Not: Bazen, böyle belirli kombinasyonları test protein/bitki türlerinin gerektiren belirli vektörel çizimler ve Teslimat yöntemi en iyi ifade ve faiz protein fonksiyonu için vektör. En çenekli bitkiler için ikili plazmid olarak ifade vektörel çizimler ve dağıtım sistemi olarak agroinfiltration ancak, seçin.
- En iyi maiyet-protein okudu bitki türleri ilgi ifade ifade sistemi, Yani, vektörel çizimler ve vektör Teslimat yöntemi, seçin.
-
Protein flüoresan etiketleme
- Fluorescently Pd yerelleştirme dahil olmak üzere onun hücre altı dağıtım22, analiz için ifade her protein etiketleyin.
Not: autofluorescent proteinleri CFP ve DsRed2, gibi Etiketler istihdam. CFP ile test edilmiş protein etiketli ve ücretsiz bir DsRed2 ile coexpress. CFP işlevleri hem etiketi hem bir virüs ilgisi olmayan kargo molekül olarak. DsRed2 işlevleri geçici ifade genel verimliliğini kalibre ve hücre-başlangıçta dönüştürülmüş hücre; tanımlamak için özerk, çünkü Bu ikinci işlev potansiyel olarak olmayan-cep-özerk test edilmiş proteinlerin hücre hücre hareketi değerlendirirken önemlidir. Aynı zamanda hücre özerk, PDCB1, Pd marker ile coexpression için test edilmiş protein CFP ve DsRed2 ile PDCB1 ile etiketleyin. - Kural olarak autofluorescent etiketi ifade protein karboksil terminus için sigorta. Ancak, Pd hedefleme öğesini tam uzunlukta test protein sergiler tehlikeye etiketi amino-terminus için protein aktarın.
- Uygun bitki ifade vektör test edilecek proteinlerin kodlama dizileri klon.
Not: Sitemizde floresan etiketleme sağlayan birçok farklı bitki ifade vektörel çizimler. PSAT plazmid26 bir dizi veya bir bölümü, çerçeve ile (bkz. Adım 2.2.1) önerilen autofluorescent Etiketler amino hem de doğrudan ilgi dizi klonlama için uygun olan onların türevleri27,28, kullandığımız- ve karboksil-terminal yönler. - Her ifade kaset Agrobacterium ikili vektör aktarın.
Not: pSAT tabanlı yapıları bitki doku, agroinfiltration, içine doğrudan biolistic teslimat için uygun olmakla birlikte burada (bkz. Adım 3), önerilen dönüşüm yöntemi olan gerektirir T-DNA arasında bulunan olmasını ifade kaset 29kenarlıklarının rengini bir ikili vektör.
Not: Tüm pSAT vektörel çizimler devrin pPZP RCS2 multigene ifade ikili vektör26,30 bir tek adım kullanarak nadir kesme nükleaz AscI, -PpoI, -SCEI, CeuI, klonlama tarafından izin vermek için tasarlanmıştır PI-PspI ve PI-TliI 26. Contegra lox siteleri31, kullanarak recombinatorial klonlama, kullanmak için tercih eden araştırmacılar örneğin, pSAT vektör türevleri26,27istihdam. - Coexpression, her iki ifade kaset transferi, örneğin, test protein-CFP ve DsRed2 veya test protein-CFP ve PDCB1-DsRed2 (bkz: adım 2.1), aynı pPZP-RCS2 ikili vektör için.
Not: Alternatif olarak, bireysel ikili yapılarını barındıran Agrobacterium kültürlerin birlikte infiltrasyon i. benthamiana içine için karışık olabilir (bkz. Adım 3.1).
- Fluorescently Pd yerelleştirme dahil olmak üzere onun hücre altı dağıtım22, analiz için ifade her protein etiketleyin.
3. Agroinfiltration
-
PPZP-RCS2-esaslı plazmid 1 µg adım 2.2.5-100 µL kültür Agrobacterium tumefaciens yük EHA105 veya GV3101 açıklanan32hazırlanan yetkili hücre eklemek, 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya, 1 dk, sıvı azot flaş-donma ve 15 dakika 28 ° C'de kuluçkaya.
- Sonra 1 mL LB orta (10 g/L tryptone, 5 g/L Maya özü ve 10 g/M NaCl) yetkili hücre karışıma ekleyin ve 28 ° c 2 h Spin 3000 × g 1 dk. için hücreleri aşağı için kuluçkaya, onları yeniden 0.2 mL LB askıya alma ve onları LB agar (örneğin, 100 mg/L Spektinomisin ve 50 mg/L Rifampisin pPZP-RSC2-esaslı vektörel çizimler26,30için) uygun antibiyotiklerle birlikte üzerinde plakası. Bireysel kolonileri görünür hale gelene kadar 48 h 28 ° C'de büyümek.
- Almak ve bir taze LB agar plaka üzerine bireysel sömürgeler plakası (bkz. Adım 3.1), 48 h 28 ° C'de büyümek ve belirli ikili yapıları varlığını doğrulamak için koloni PCR33 tarafından bakteri analiz için küçük bir miktar almak.
-
Her Agrobacterium koloni gecede 28 ° C'de ilgi 5 mL LB orta (bkz. Adım 3.1.1) uygun antibiyotiklerle birlikte yapı ile büyümek. 3000 × g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve onları yeniden OD600için askıya agroinfiltration arabellek (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6), 150 µM acetosyringone) 0.5 =. Oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
- Bir tek multigene ifade plazmid yerine ikili plazmid karışımı protein coexpression için kullanılıyorsa, infiltrasyon önce 1:1 v/v oranında karşılık gelen hücre kültürleri karıştırın. Sonra hücreleri 28 ° c 2 h için kuluçkaya.
-
İnoculum 1 mL plastik şırınga ve basın karşı tam olgun i. benthamiana alt (abaxial) epidermis şırınga (iğne) meme yaprakları yükleyin. Eldivenli bir parmak ile yaprak adaxial yüz34,35üzerinde tutun.
- Agrobacterium infiltrasyon ortamda yavaş iğne ile tanıtmak. İstatistiksel anlamlılık için birkaç her bitki yapraklarda sızmak.
: Not tutarlı ifade düzeyleri verir gibi en eski yaprakları kullanılır. - Bütün yaprakları içinde in situaşılamak. İnfiltre bitki gözlem kadar adım 1.2 ile açıklandığı gibi korumak.
- Agrobacterium infiltrasyon ortamda yavaş iğne ile tanıtmak. İstatistiksel anlamlılık için birkaç her bitki yapraklarda sızmak.
4. confocal mikroskobu
- Her yaprak damarları arasında parçalara kesmek için bir bıçak kullanın 24-48 h sonra infiltrasyon (bağlı olarak geçici ifade belirli test protein verimlilik); Öyle ki dilim kapak mikroskopi için kullanılan cam (22 mm x 40 mm) tarafından tamamen kapsadığı her doku dilimin boyutu olmalıdır.
- Nesne üzerinde yaprak dilimleri, karşı karşıya abaxial yaprak yüzeyi ile slayt yer yaprak dilim üzerinde bir damla su koyun ve cam ile kapsar. Küçük parçalar halinde her tarafında kaset ile kapak cam hareketsiz.
-
Bir lazer confocal mikroskobu tarama altındaki agroinfiltrated dokuları gözlemlemek ve elde edilen görüntüleri.
- İlk olarak, 10 X objektif lens hücreleri sinyal ile tanımlamak için kullanın ve 63 x objektif lens daha detaylı gözlemler için kullanın.
- Kullanım 458 nm dalga boyları üzerinden CFP ve 543 heyecanlandırmak için bir argon iyon lazer DsRed2 heyecanlandırmak için nm. Resim alma, Yani, lazer yoğunluğu ve deneyler arasında photomultiplier tüp (PMT) ayarları için tüm ayarlarını korur. Ortalama olarak, 100-120 hücreleri deneysel her koşul için inceleyin.
5. tanımlaması PLS
- Yerelleştirme confocal mikroskop (Bölüm 4) kullanarak test protein teşhis. Test protein karakteristik periferik punctate desen25,36,37,38,39,40,41 vardır ve colocalizes kontrol edin Pd işaretçisiyle PDCB123. Bu test protein olasılıkla PLS dizileri içerdiğini gösterir.
- Sonra onun açık okuma çerçevesi (ORF) (genbank katılım numarası BAF93925.1) giderek daha alt bölümlere ayırma test protein, PLS aktivitesinin onay daha küçük parçaları, autofluorescently, (örneğin, CFP,) her biri etiket ve analiz onların 4. adımda açıklandığı gibi hücre altı yerelleştirme. Başlangıçta, boyutu 100 amino asit kalıntıları eklenmesi Kentler her parça için önerilir.
- Daha fazla PLS etkinlik ve hala merkeze yerelleştirir en küçük parçası kadar adım 4'te açıklandığı gibi onların hücre altı yerelleştirme kontrol kesilmiş parçaları alt bölümlere ayırma, Yani autofluorescent etiket kargo taşımacılığı için yeterli PD için tanımlanır. Bu parçada PLS sırasını göstermek için olduğu tahmin edilmektedir.
- Sözde PLS tam uzunlukta test protein, Yani sigorta sözde PLS olmadan test proteinin kalan kısmını autofluorescent etiketi silin ve ortaya çıkan mutant proteinin hücre altı yerelleştirme adımda anlatıldığı gibi belirlemek 4. sözde PLS yoksun bu mutant proteinin merkeze yerelleştirmek başarısız olursa, bu tespit PLS sadece yeterli (bkz. Adım 5.3), ama aynı zamanda test protein Pd taşıtlar için gerekli olmadığını belirtir.
- Agroinfiltrate (bkz. Adım 3.3) CFP öğesini PLS ve ücretsiz DsRed2 için yaprakları ifade yataklık Agrobacterium kültürlerin karışımı ile inşa. 10 adım 4,3 olduğu gibi aynı ayarları kullanarak x objektif lens ile confocal mikroskop kullanarak infiltre doku gözlemlemek.
- Başlangıçta infiltre hücreler olarak CFP ve DsRed2 sinyalleri içerir ve bu sinyalin CFP içeren bitişik hücreleri bu sergi hareketin skor hücreleri puan.
Not: Bu adımı potansiyel hücre hücre hareket kabiliyetini için tanımlanan PLS inceler; Pd (dahil olmak üzere çoğu viral MPs bitki) hedef birçok protein taşımak da Pd ile komşu hücrelere olmasıdır. İnfiltrasyon için kullanılan Agrobacterium konsantrasyonu sırasıyla farklı yapıları ifade verimliliği üzerinde bağlıdır. Agroinfiltration için (i) tek hücre, bitişik hücreleri dönüştürülmemiş bırakarak dönüştürme sağlar, (ii) ifade benzer verimliliği elde hücre kültür seyreltme kullandığınızdan emin olun. Örneğin, bizim deneyler OD600 0,01 ve 0.005 CFP öğesini PLS ve ücretsiz DsRed2, ifade için sırasıyla kullanmaktadır.
6. anahtar PLS42 alanin tarama kullanarak artıkları tanımlaması
- Sıra astar istenen mutasyon, Yani, ikame alanin, her astar Merkezi bölgenin etrafında ile hedef amino asit kalıntısı açıklandığı gibi içerecek şekilde tasarlanmış bir çift istihdam kodlama PLS yükseltmek için standart PCR iletişim kurallarını kullanır 21. Astar tasarım ve kullanım sitesi yönetmen mutagenesis kit site yönettiği mutagenesis üretici yönergelerine göre için yürütmek.
- Herhangi bir standart DNA arıtma kiti kullanılarak elde edilen PCR ürünleri arındırmak ve ebeveyn ortadan kaldırmak için DpnI ile 37 ° C'de sindirir (Yani, mutasyona uğramış olmayan) metillenmiş ve hemimethylated DNA'sı. Bu (değil on Ice) oda sıcaklığında 5 min için sakin olun. Daha sonra karışımı doğrudan E. coli yetkili hücreleri43dönüştürmek ve koloniler istenen mutant yapıları ile adım 3.2 açıklandığı gibi tanımlar.
- 2.2.4. adımda açıklandığı gibi ikili vektör mutant yapıları tanıtmak, adım 3'te açıklandığı gibi agroinfiltration yapmak ve adımları 4 ve 5. 1 açıklandığı gibi Pd hedefleme değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sadakatle açıklanan kurallarından beklenen sonuçlar göstermek ve TMV MP PLS tanımlamak, temsilcisi verileri Yuan ve ark. adapte olmuşlardır 21. şekil 1A ilk özetleyen önemli yapılar tam uzunlukta TMV MP (1-268), TMV MP PLS (oluşan ilk 50 amino asit kalıntıları protein 1-50), ifade ve onun alanin V4A türevleri tarama erimiş (olarak üretilen CFP için açıklanan adımları 2.2, 5.2 ve 6) şekil 1B özetleyen ve etiketli bu proteinler hücre altı lokalizasyonu quantifies oysa. Şekil 1 c TMV MP-CFP için ve için TMV MP PLS-CFP de coexpressed Pd işaretçiyi gelince, PDCB1-DsRed2 gözlenen karakteristik periferik punctate Pd yerelleştirme desen gösterir (bkz. Adım 5.1). Şekil 2A gösterir Pd TMV MP-CFP ve coexpressed ücretsiz DeRed2 TMV MP PLS-CFP ve nucleocytoplasmic dağıtımı için hedefleme (bkz. Adım 5.1). Son olarak, şekil 2B hem TMV MP ve TMV MP bu kalıntı PLS yapısı ve fonksiyonu için önemli olduğunu belirten PLS ile bir tek alanin ikame V4A, Pd hedefleme kaybı gösterir; aynı PDCB1 hala yerelleştirir merkeze coexpressed Pd marker hücreleri (bkz. Adım 6).
Bu kavramsal olarak ve teknik olarak basit bir prosedür protein parçaları, bir autofluorescent işaret-kargo protein füzyon ve yetenek merkeze yerelleştirmek test sistematik üretiminin en az protein sıra tanımlayabilirsiniz bu veri göster gerekli ve Pd hedefleme, Yani, PLS için yeterli. Bu yerelleştirme veriler doğru yorumlanması için bilinen bir Pd protein, örneğin, PDLP veya PDCB aile üyeleri16,23 veya bir bitki ile colocalization deneyler gerçekleştirmek için önemlidir Pd44 sıralamak viral MPs . Belli ki, colocalization gibi tüm P yerelleştirme proteinler aynı merkeze hedefleyebilir, ancak en az bir Pd marker proteinlerin colocalization istatistiksel olarak anlamlı bir ölçüde PLS etkinliği tanımlamak için gerekli olan tam, olmak zorunda değil.
Şekil 1: TMV MP kimliği PLS. (A)Özeti TMV MP PLS. TMV MP dizileri, yeşil kutuları tanımlamak için kullanılan ana CFP-fusion oluşturur; CFP, mavi kutu; P, organizatörü; T, Sonlandırıcı. Soldaki sayıları her TMV MP parçasının içinde yer amino asit kalıntıları olduğunu gösterir. (B) (A) gösterilen füzyon proteinlerin hücre altı yerelleştirme özetini. PD yerelleştirme veya nucleocytoplasmic yerelleştirme karşılık gelen hücre altı işaretleri, PDCB1-DsRed2 ve ücretsiz DsRed2, yerelleştirme sırasıyla göre tespit edilmiştir. Her yerelleştirme desen sergilenmesi hücre yüzdesi yapı üç bağımsız deneylerde başına 100 ifade hücre puanlama üzerinde gösterilir. Ortalama ± standart hataları (SE) verilerdir. (C) Pd TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP ve Pd marker PDCB1-DsRed2 hedefleme. CFP sinyal mavidir; DsRed2 sinyal mor olduğunu; Plastit autofluorescence filtre. Tek confocal bölümleri görüntülerdir. Ölçek çubukları 10 µm. DIC, fark girişim kontrast test =. Bu rakam Yuan ve ark. adapte 21. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: TMV MP, TMV MP PLS ve onların alanin tarama mutantlar Pd hedefleme. (A)hücre altı yerelleştirme TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP ve nucleocytoplasmic işaret DsRed2. (B) kaybı, yetenek V4A alanin tarama mutant TMV MP-CFP ve TMV MP PLS-CFP hedefleme Pd. PD Pd işaret PDCB1-DsRed2 coexpression tarafından görüntülenmiştir. CFP sinyal mavidir; DsRed2 sinyal mor olduğunu; Plastit autofluorescence filtre. Tek confocal bölümleri görüntülerdir. Ölçek çubukları 10 µm. DIC, fark girişim kontrast test =. Bu rakam Yuan ve ark. adapte 21. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralının dört çekirdek bileşenlerinin vardır: gerekli ve yeterli test eritme merkeze sistematik lige uzunluğu, giderek azalır parçaları ilgi proteinin hedefleme için bir dizi tanımlama kavramı Hem etiketi hem makromoleküllerin kargo ve Pd yaşayan hedefleme için fonksiyonel tahlil olarak hizmet veren bir autofluorescent protein parçaları test füzyon proteinlerin geçici ifade aşağıdaki dokular bitki. Not geçici ifade Agrobacterium aracılı zaman, Yani, birkaç gün, sık sık benzer çalışmalar15dakika içinde kullanılan transgenik bitkilerin üretimi için gerekli ay ile karşılaştırıldığında göreceli olarak kısa bir süre içinde veri oluşturur.
Coexpression protein hücre altı yerelleştirme işaretçileri olan ilgi, örneğin, PDCB1 veya ücretsiz DsRed2, genellikle bir multigene ifade vektör gerçekleştirilir. Tek bir vektör içine birkaç ifade kaset transferi teknik olarak sorunlu ise, ancak, coexpression da her kaset ayrı bir ikili yapı aktarılması ve eşdeğer miktarda sıvı kültürleri birleştirerek gerçekleştirilebilir agroinfiltration için elde edilen Agrobacterium suşları. Bu protokolü geçici ifade kullanır çünkü varlıklarını ifade verimliliği için zararlı olmasa da ikili vektör seçim işaretleri istikrarlı dönüşüm, taşımak.
Bu protein ifade için optimize edilmiş ve i. benthamianahedefleme protokoldür; Ancak, Arabidopsis45,46, mükellef tarafından Agrobacterium genetik dönüşümü için de dahil olmak üzere diğer bitki türlerinde kullanılabilir. Diğer bitki türü için veya aksi takdirde istenirse, bu iletişim kuralını biolistic teslim41 ifade kaset için ikili vektörel çizimler aktarmak için ihtiyaç kaçınarak doğrudan pSAT tabanlı vektörel çizimler, geçici ifade için kullanmak için adapte edilebilir.
Kritik nokta bu protokolündeki bitki materyali tutarlı fizyolojik ve gelişimsel durumdur. Özellikle, tüm bitkiler tüm deney boyunca sağlıklı olması gerekir, ve, agroinfiltration için i. benthamiana bitkiler 4-hafta değerinden küçük olması gerekir eski ve 4-6 cm çapında olmak en büyük yaprak ile 4-8-yaprak aşamada. Eğer bitkiler çok genç, agroinfiltration etkileri çok ağır, ifade yerelleştirme tagged proteinlerin çalışmasına mani olacak. Öte yandan, büyük bitkiler kez Pd24,25Pd hedefleme desenleri tutarlılığını da etkileyen, değişken mimari sergi.
Yine de, fizyolojik şartlarda bitki bir bütün olarak ve onun dönüştürülmüş hücrelerin özellikle değişen nedeniyle, Pd her deneyde hedefleme verimliliğini biraz farklı olabilir. Böylece, hücreleri nispeten çok sayıda analiz etmek önemlidir (> 100) deney, başına ve her denemenin en az üç biyolojik çoğaltır gerçekleştirin. Genellikle, en az % 70 Pd yerelleştirme dönüştürülmüş hücrelerin sergiler, etkinlik, hedefleme Pd içermesi için test edilmiş bir parça göz önünde bulundurun. Her parça, örneğin, yüzde Pd özgü punctate birikimi desen gösterilen dönüştürülmüş hücrelerin verimliliğini hedefleyen Pd farklılıkları Öğrenci t-Testi ve p-değerleri tarafından analiz < 0,05-0,01, karşılık gelen istatistiksel olasılık % 95-99 daha fazla.
Füzyon molekül floresan etiket/kargo konumunu başka bir önemli konudur. Bazı Pd hedeflenmiş proteinler de endoplazmik retikulum (ER) ile ilişkilendirmek ve bu Derneği engelsiz amino-terminal sıra gerektirebilir. Bu gibi durumlarda, karboksil-terminus ilgi protein parçasının amino-terminus için floresan etiketinin eritilmiş olan amino-terminal füzyon, örneğin, CFP veya DsRed2, kullanılmalıdır. Bu varsayılan yerleşim etiketinin aşağıdaki durumlarda değiştirilebilir. (i) Eğer amino-terminal füzyon kullanılamadığına – Yani, onlar yapmak değil anlamlı hücre altı yerelleştirme Desen Sergisi, kötü ifade edilir veya floresan sinyal için güvenilir algılama – yeterli oluşturmaz ve eğer protein ilgi yok amino-terminal sinyal dizileri veya karboksil-terminal füzyon amino-terminus test parçasının etiketi karboksil-terminus eritilmiş olan içermemesi, onlar denenmesi gerektiğini. (ii) sinyal dizileri, karboksil terminus adlı protein ilgi içeriyorsa, karboksil-terminal füzyon de kullanılmalıdır. (III) faiz protein GPI bağlantılı proteinler arasında bulunanlar gibi her iki amino - ve karboksil-terminal sinyali veya bir amino-terminal sinyal peptid içeriyorsa, henüz onun amino-terminal füzyon kullanılamaz varsa, etiketin dahili olarak, yer almalıdır) ya aşağı amino-terminal sinyal veya karboksil-terminal sinyal ters yönde). Bizim daha önceki yayınları47,48yılında iç floresan proteinlerin etiketleme için yararlı bazı yordamlar açıklanmıştır.
Şu anda, hiçbir bilinen fikir birliği sıra PLS için vardır. Bu nedenle (Adım 5.2), başlangıçta protein bitişik ~100-200 kalıntı uzunluğundaki parçaları ayırmaktan tavsiye ediyoruz. Bunlar daha sonra giderek daha kısa yapılabilir gözlenen Pd hedefleme aktivite veya bunların eksikliği dayalı. Bir diğer potansiyel sinyalleri (örneğin, NLS, sinyal peptidler, vb) protein mevcut hedefleme dikkatli olmalıdır. Ancak, böyle dizileri PLS serileri ile potansiyel çakışma bilinmeyen olduğu gibi bu protein bölgeler mutational bu çözümlemeye dahil edilmelidir.
Şimdiye kadar bu iletişim kuralı bir protein molekülü21içinde tek bir PLS tanımlamak için kullanıldı. Büyük olasılıkla, ancak, bir protein birden fazla sinyal sıra içerebilir; birden çok NLSs gerçekten de GATA transkripsiyon faktörleri49da dahil olmak üzere birçok nükleer protein nitelendirdiler. Böylece, farklı parçaları test protein hedefleme Pd için analiz ederken, birden böyle parçası, bağımsız olarak ya da sinerjik hareket birden fazla PLSs varlığını gösteren belirtilir ki mümkündür.
Ana bu protokolü geçici agroinfiltration, görsel olarak hücre altı yerelleştirme aşağıdaki ilgi ifade proteinlerin en iyi elde edilir epidermal hücrelerin ve nispeten dar büyüme aşamasında, kısıtlamasıdır. Gerektiğinde, bu sınırlama stabil her onların doku ve hücre tiplerinin çoğunda test edilmiş proteinlerin hızlı transgenik bitkiler üreterek üstesinden gelebilir. Ayrıca, bu iletişim kuralını viral MPs veya geçici genetik dönüşümü için mükellef değildir bitki türlerinde işlev diğer Pd hedeflenmiş proteinler çalışmaları için yararlı olmaz.
Bu teknik bir PLS TMV MP tanımlanması için geliştirdiğimiz iken, PLSs keşif herhangi bir diğer bitki için viral MPs veya merkeze, geçici veya kalıcı olarak yerelleştirmek bitki endojen proteinlerde kullanılabilir. Ayrıca, uygun hücre altı yerelleştirme işaretleri47ile birlikte, bu protokol proteinler tesislerinde ilgi içinde birçok hedefleme sinyalleri tanımlanması için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.
Acknowledgments
Yeterli yer olmaması, çoğunlukla gözden makaleler gösterdi ve meslektaşlarımıza orijinal eserleri değil gösterildi özür dileriz. V.C. laboratuvar çalışmalarında V.C. NIH, NSF, USDA/NIFA, Ozan ve BSF hibe tarafından desteklenmektedir ve S.G.L. laboratuvar NIH ve bitki patoloji bölümleri ve bitki-mikrop Biyoloji fonlarından için S.G.L. tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
References
- Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
- Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
- Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H.
- Jackson, D.
- Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
- Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
- Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
- Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
- Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
- Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
- Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
- Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
- Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
- Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
- Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
- Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
- Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
- Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
- Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
- Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
- Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
- Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
- Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
- Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
- Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
- Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
- Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
- Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
- Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
- Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
- Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
- Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
- Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).
