Summary
식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.
Abstract
Plasmodesmata (Pd)는 셀 연결 게이트웨이 통해 크고 작은 분자는 식물 세포 사이 수송으로 작동. 생물 고분자, 그러한 단백질의 셀 전송에 특정 대상 신호를 포함 하는 활성 메커니즘을 통해 대부분 발생 Pd 전송 작은 분자, 이온과 물, 등의 수 동적으로 발생 추정, 반면에 분자를 수송. 식별된 plasmodesmata (Pd) 지역화 신호 (PLSs)의 부족은 심각 하 게 단백질 분류의 이해 제한 경로에 관련 된 식물 셀 고분자 전송 및 통신. 다양 한 식물에서에서 Pd 통해 트래픽을 알려진 내 인 성 및 바이러스 성 단백질 3 PLSs 보고 되었습니다 데이트, 내 생 식물 단백질에서 그들의 모든. 따라서, 그것은 필요 하 고 생활에 직접 Pd 대상에 대 한 충분 한 기능 PLS 시퀀스를 식별 하는 안정적이 고 체계적인 실험 전략을 개발 하는 중요 한 식물 세포. 여기, 우리가 같은 전략 패러다임으로 담배 모자이크 바이러스 (TMV)의 셀 운동 단백질 (MP)를 사용 설명. 이러한 실험을 확인 하 고 첫 번째 특징 식물 바이러스 PLS, PLS 시퀀스 가장 Pd 대상 단백질의 발견에 대 한 적용할 수 있습니다.
Introduction
Plasmodesmata (Pd) 식물 개발 및 녹음 방송 요인에서 mRNA와 작은 RNA 분자에 이르기까지 morphogenesis의 키 레 귤 레이 터의 세포 수송을 위한 도관으로 작동 합니다. 또한,이 고분자 전송 용량 Pd의 활용 그들의 세포 확산에 대 한 대부분의 식물 바이러스에 의해 감염; 시 Pd를 통해 이동, 식물 바이러스 이동 단백질 (MPs), 특히 Pd1,2,3,4,,56 대상 되 나 특수 단백질 진화 , 7. Pd 전송의 분자 경로 대부분 이러한 경로에 수송된 단백질을 대상으로 특정 시퀀스와 밀접 하 게 상호는. 따라서, 이러한 Pd 지역화 신호 (PLSs)의 진단 해당 Pd 전송 통로의 있을 수 있습니다. 이것은 Pd 전송8, 비유 하 여 예를 들어 다른 핵 지 방화 신호 (NLS) 시퀀스9,10에 대 한 특정 될 수 있는 다른 핵 가져오기 경로. 개념적으로, NLSs와 PLSs 비 쪼갤 subcellular 타겟팅은 시퀀스를 필요 하 고 대상에 대 한 충분 한을 나타냅니다. 그러나, NLSs11, 달리 PLSs에 대 한 시퀀스 정보 심각 하 게 제한 됩니다. 특히, 단지 4 개의 단백질 시퀀스 Pd 대상에 관련 된 보고 되었습니다, 내 생 식물 단백질에서 파생 된 그들의 모든. 첫 번째 KN112 -13 의 식물 잎 표 피 안쪽 세포 층에서 이동 하는 녹음 방송 요인-와 그것의 녹 스 homologs14의 homeobox 도메인으로 표시 됩니다. 또한 두 번째 주제15전사 요소, Dof, 세포 매매 (그것)으로 상 상속 PLS를 포함에서입니다. 세 번째 순서 PDLP1 plasmodesmata 거주 유형 1 막 단백질에서 이며 막 횡단 도메인16로 표현 됩니다. 마지막으로, 네 번째 Pd 시퀀스를 대상으로 최근에 알려졌다 glycosylphosphatidylinositol (GPI)에 대 한-고정 된 단백질과 그것 glycosylphosphatidylinositol (GPI) 수정 신호17로 표시 됩니다.
흥미롭게도, 아주 최근까지, 아무 PLSs 바이러스 MPs에 대 한 보고 되었습니다. 이전 연구에서 식물 바이러스 MPs18,19, 하지만 아무 진정한 PLS, 즉, 최소한의 아미노산 시퀀스 필요 하 고 Pd 없는 화물 분자 (대상에 대 한 충분 한 상 상속 PLS 시퀀스의 존재 표시 예., CFP) 바이러스 MP에서 발견 되었습니다. 그러나이 단백질, 담배 모자이크 바이러스 (TMV), MP 중 하나는 Pd에 대 한 지역화 및 전송 되었습니다 시연된20하는 첫번째 이었다.
이 차이 해결 하기 위해 우리는 TMV MP PLS를 식별 하는 실험적인 전략을 개발 했다. 이 전략은 세 가지 개념을 기반으로 합니다. (i) 정의 PLS 최소한의 아미노산 시퀀스를 필요 하 고 Pd21대상 단백질에 대 한 충분 한로. (ii) 때문에 TMV MP Pd를 대상으로 먼저 하 고 다음 이러한 채널22를 통해 translocates, 우리는 이러한 두 활동을 분리 시에 타고 난 PLS, Pd를 대상으로, 대만 그리고 후속 전송 함수를 식별 목적. (iii) 우리는 구조적 또는 기능적 활동을 대상으로 하는 Pd에 대 한 중요 한 아미노산 잔류물에 대 한 확인 된 PLS를 분석. 이 방법을 사용 하 여, 우리에 아미노-타고 난 PLS 역할 TMV MP의 50-아미노 산 성 잔류물 시퀀스 구분 된. 이것은 단백질의 전체 길이 포화 TMV MP 파편의 시리즈를 생산, 그들의 carboxyl-테르미니 CFP와 태그와 뚜렷이 식물 조직에서 그들을 표현 하 여 이루어졌다. Pd 지역화 테스트 조각의 각 Pd 마커 단백질, PDCB1 (Pd callose 의무적인 단백질 1)23로 그들을 coexpressing에 의해 결정 되었다. 여전히 Pd로 하지만 Pd, 통과 하지 않았다 작은 조각 PLS를 표현 하기 위해 고려 되었다. 마지막으로,는 PLS 주요 아미노산 잔류물의 구조 또는 기능에 필요한 확인 하려면 알라닌 스캔 했다.
반면 여기 우리는 TMV MP PLS의 식별을 설명 하 여이 방법을 설명 하기 위해, 그것은 식물 병원 균에 의해 또는 스스로; 식물에 의해 인코딩 여부에 어떤 다른 Pd 대상 단백질에 PLSs를 채택 수 있습니다. 이 때문에 우리의 방법 Pd를 대상으로 그들의 능력에 관해서는 바이러스 MPs의 모든 고유 기능을 고려 하지 않습니다.
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Protocol
1. 식물 재료
- 식물의 선택
- 사용 하 여 관심, 즉, 하나는 내 인 성 단백질을 위한이 단백질을 인코딩합니다 또는 바이러스 성 단백질에 대 한 병원 체에 대 한 자연 호스트를 나타내는 단백질에 고유 식물 종. 또한, 선택 된 식물 종의 변이 유전자 변환의 선택한 방법에 순종 해야 합니다.
참고: 정기적으로 Nicotiana benthamiana, TMV에 대 한 좋은 호스트를 나타내고 있는 Agrobacterium 중재 하는 유전자 변형 기술, 즉, agroinfiltration에 의해 효율적으로 변환 됩니다 있는 고용 연구 (3 단계 참조). 명. benthamiana 또한 쉽게 성장 하는 식물과 큰 잎, 쉽게 Agrobacterium으로 주사 되 고 쉽게 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석. -
식물 성장
- 명. benthamiana 씨 높은 밀도에서 젖은 토양에서 식물. 20-25 ˚C ~ 75 µmol 광자 m-2의 -1 에서 빛의 아래 16 h와 어둠의 8 h에서 제어 환경 챔버에 그들을 유지. Euphyll의 직경에 0.5 cm를 도달 하면, 신중 하 게 더 큰 냄비에 묘를 전송 하 고 동일한 조건 하에서 동일한 약 실에서 성장을 계속 합니다.
- 그들은 4-8-잎 단계 때 큰 잎은 4-6 cm 직경; 4 주 이내에 성장 될 때까지 식물을 유지 이 시점에서 그들은 사용할 수 있습니다 agroinfiltration (3 단계 참조).
참고: 중요 한 것은, 사용 하지 마십시오 식물 꽃이 발달 단계에서 잎 아키텍처는 종종24,25, 때로는 일관성 없는 결과 이끌어 다르기 때문에 시작.
2. 식 벡터 건설
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식 시스템의 선택
- 식 시스템, 즉, 벡터 및 벡터 배달 방법을, 공부 하는 식물 종에 관심사의 단백질의 표현에 대 한 가장 적합 한 선택 하십시오.
참고: 때때로, 테스트 단백질/식물 종의 같은 특정 조합 수 있습니다 필요로 특정 벡터와 벡터 최적의 표현과 관심사의 단백질의 기능에 대 한 전달 방법. 그러나 가장 dicotyledonous 식물에 대 한, 표정 벡터와 배달 시스템으로 agroinfiltration 이진 플라스 미드를 선택 합니다.
- 식 시스템, 즉, 벡터 및 벡터 배달 방법을, 공부 하는 식물 종에 관심사의 단백질의 표현에 대 한 가장 적합 한 선택 하십시오.
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단백질 형광 태그
- 붙일 각 표현한 단백질의 subcellular 배포22, Pd 지역화를 포함 분석에 대 한 태그.
참고: 태그 autofluorescent 단백질, c f P, DsRed2, 등을 사용 합니다. CFP와 테스트 단백질 태그와 무료 DsRed2와 coexpress. C f P 기능 태그와 바이러스 없는 화물 분자. DsRed2 기능 과도 식의 전반적인 효율을 보정 하 고, 셀-자치, 처음 변형된 세포;을 식별 하는 때문에 이 후자의 기능은 잠재적으로 비-셀-자치 테스트 단백질의 셀 움직임을 평가할 때 중요 하다. 또한 세포 자치 이다는 Pd 표시 PDCB1와 함께 coexpression에 대 한 CFP와 DsRed2와 PDCB1 테스트 단백질 태그. - 엄지손가락의 규칙으로 표현 된 단백질의 carboxyl 종착역을 autofluorescent 태그 퓨즈. 그러나, 태그 전체 길이 테스트 단백질 전시 Pd 대상으로 손상 된 경우에 태그 단백질의 아미노 말단에 전송.
- 적당 한 공장 식 벡터에 시험 될 단백질의 코딩 시퀀스를 복제.
참고: 형광 태그를 허용 하는 많은 다른 식물 식 벡터 있습니다. 우리 pSAT 플라스 미드26 의 시리즈 또는 그들의 유도체27,28의 직접 제안된 autofluorescent 태그 (2.2.1 단계 참조) 모두 아미노산에서 프레임 시퀀스의 복제에 대 한 적당 한의 일부를 사용 하 여-그리고 carboxyl 터미널 방향입니다. - 각 식 카세트 Agrobacterium 이진 벡터에 전송 합니다.
참고: pSAT 기반 구조는 식물 조직, agroinfiltration에 직접 biolistic 납품을 위한 적합 한 변환 방법 (3 단계 참조), 여기 추천입니다에서는 T-DNA 사이 식 카세트 이진 파일의 테두리 벡터29.
참고: 모든 pSAT 벡터 있도록 설계 되었습니다 pPZP RCS2 multigene 식 이진 벡터26,30 같은 전송 드문 절단 nucleases AscI,-PpoI,-SceI, 난-CeuI를 사용 하 여 단일-단계 복제 하 여 PI PspI와 PI-TliI 26. 연구원 recombinatorial 복제, 활용 하는 것을 선호 예, 분리 lox 사이트31를 사용 하 여 pSAT 벡터 변종26,27고용 수 있습니다. - Coexpression, 두 식 카세트를 전송 예를 들어, 테스트 단백질-c f P DsRed2 또는 테스트 단백질-CFP 및 PDCB1 DsRed2 (참조 하십시오 단계 2.1), 동일한 pPZP RCS2 이진 벡터.
참고: 또는, 개별 이진 구조를 품고 Agrobacterium 문화 혼합 수 있습니다 함께 명. benthamiana 으로 침투에 대 한 (단계 3.1 참조).
- 붙일 각 표현한 단백질의 subcellular 배포22, Pd 지역화를 포함 분석에 대 한 태그.
3입니다. Agroinfiltration
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EHA105 또는 GV3101 설명된32로 준비 Agrobacterium tumefaciens 스트레인의 유능한 세포의 단계 2.2.5 100 µ L 문화에서 pPZP-RCS2-기반 플라스 미드의 1 µ g을 추가, 30 분 동안 얼음에 품 어, 1 분, 액체 질소에 플래시 동결 및 15 분 동안 28 ° C에 품 어.
- 다음, 유능한 세포 혼합물에 파운드 매체 (10 g/L tryptone, 5 g/L 효 모 추출 물, 및 10 g/L NaCl)의 1 mL을 추가 1 분에 3000 × g에서 셀 아래로 2 h. 회전 28 ° C에서 품 어, 다시 파운드의 0.2 mL에서 그들을 중지합니다 파운드 한 적절 한 항생제 (예, 100 mg/L spectinomycin와 pPZP-RSC2-기반 벡터26,3050 mg/L 리 팜 피신) 보충에 접시와. 개별 식민지 표시 될 때까지 48 h에 28 ° C에 성장 한다.
- 선택 하 고 신선한 파운드 한 접시에 여러 개별 식민지 접시 (단계 3.1 참조), 48 h, 28 ° C에서 성장 하 고 식민지 PCR33 특정 바이너리 구문의 존재를 확인 하 여 분석에 대 한 박테리아의 작은 금액을 취할.
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성장 (단계 3.1.1 참조) 적절 한 항생제로 보충 파운드 매체의 5 mL에 28 ° C에서 하룻밤 관심의 구조와 각 Agrobacterium 식민지. 3000 × g에서 세포를 원심 및 다시 OD600중단 = 0.5 agroinfiltration 버퍼 (10 m m MgCl2, 10 m m MES (pH 5.6), 150 µ M acetosyringone). 실 온에서 2 h에 품 어.
- 단백질 coexpression에 대 한 이진 플라스 미드 보다는 단일 multigene 식 플라스 미드의 혼합물을 사용 하는 경우 해당 셀 문화 침투 하기 전에 v/v를 1:1 비율로 섞는다. 다음 2 h 28 ° C에서 세포를 품 어.
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로드는 inoculum 1 mL 플라스틱 주사기와 완전히 성숙한 명. benthamiana 의 더 낮은 (abaxial) 표 피에 대 한 주사기 (바늘)의 노즐 단풍 누릅니다. Gloved 손가락으로 잎을 adaxial 얼굴34,35만요.
- 천천히 주입 하 여 침투 매체에서 Agrobacterium을 소개 합니다. 통계적 의미에 대 한 각 식물에 몇 잎에 침투.
참고: Note로 그들은 일관 된 표현 레벨을 양보 하지 오래 된 잎 사용 되지 않습니다. - 모든 잎 원래의접종 1.2 단계에에서 설명 된 대로 관찰까지 침투 공장을 유지 합니다.
- 천천히 주입 하 여 침투 매체에서 Agrobacterium을 소개 합니다. 통계적 의미에 대 한 각 식물에 몇 잎에 침투.
4. confocal 현미경 검사 법
- 블레이드를 사용 하 여 각 잎 정 맥 사이 조각으로 잘라 (에 따라 특정 테스트 단백질의 과도 한 표현의 효율성); 침투 후 24-48 h 각 조직 조각의 크기 조각을 현미경에 사용 되는 커버 유리 (22 m m x 40 m m)에 의해 완전히 덮여 되도록 해야 합니다.
- Abaxial 잎 표면 위로 향하도록 슬라이드 개체에서 잎 조각 장소 잎 조각에 물 한 방울 놓고 커버 글라스와 커버. 각 측에 테이프의 작은 조각 가진 덮개 유리를 고정 하 고
-
레이저 confocal 현미경 검사에서 agroinfiltrated 조직 관찰 하 고 결과 이미지를 기록 합니다.
- 첫째, 10 X 객관적 렌즈를 사용 하 여 신호, 셀을 식별 하 고 63 x 렌즈를 사용 하 여 더 상세한 관측을 위해.
- C f P, 그리고 543을 자극 하는 아르곤 이온 레이저에서 사용 된 458 nm 파장 nm DsRed2를 자극. 이미지 수집, 즉, 레이저 강도 및 광 전 증폭 관 관 (PMT) 설정, 실험에 대 한 모든 설정을 유지 합니다. 평균, 각 실험 조건에 대 한 100-120 셀을 검사 합니다.
5. 식별의 PLS
- Confocal 현미경 (4 단원)를 사용 하 여 테스트 단백질의 지 방화를 진단 합니다. 테스트 거친된 단백질 있다는 특성 주변 punctate 패턴25,36,,3738,39,40,41 colocalizes 있는지 확인 와 Pd 표식 PDCB123입니다. 이 테스트 단백질 대부분 PLS 시퀀스 포함 되어 있음을 나타냅니다.
- 확인 테스트 단백질의 PLS 활동의 점진적으로 작은 조각, autofluorescently, (예를 들어, c f P,)으로 그것의 열려있는 독서 구조 (ORF) (은행 승인 번호 BAF93925.1)를 분할 하는 후, 그들 각각의 태그 및 분석의 4 단계에서에서 설명한 대로 subcellular 지 방화입니다. 처음에, 각 세분화 조각에 대 한 100 아미노산 잔류물의 크기는 권장 됩니다.
- 더 세분화 PLS 활동 고 아직도 Pd 하 localizes 작은 조각까지 4 단계에에서 설명 된 대로 그들의 subcellular 지 방화를 확인 잘린된 조각, 즉 autofluorescent 태그 화물을 수송 하기에 충분 Pd을 식별 됩니다. 이 조각 PLS 시퀀스를 나타내는 추정 됩니다.
- 전체 길이 테스트 단백질에서 상 상속 PLS을 삭제, 즉 autofluorescent 태그를 putative PLS 없이 테스트 단백질의 나머지 부분을 융합 하 고 단계에 설명 된 대로 결과 돌연변이 단백질의 subcellular 지 방화를 결정 4. 못하면 부족 putative PLS이 돌연변이 단백질 Pd를 지역화 하이 확인 된 PLS는 하지만 충분 한 (참조 단계 5.3), 하지만 테스트 단백질의 Pd 수송을 위해 또한 필요 하는 것이 나타납니다.
- Agroinfiltrate 식 은닉 Agrobacterium 문화의 혼합 잎 c f P-태그 PLS 및 무료 DsRed2 (단계 3.3 참조)에 대 한 생성 합니다. 침투 조직 단계 4.3에서 동일한 설정을 사용 하 여 x 10의 렌즈와 confocal 현미경을 사용 하 여 관찰 합니다.
- 점수와 점수는 CFP 그 신호에 포함 된 인접 한 셀을 전시 운동 처음 침투 셀, CFP와 DsRed2 신호를 포함 하는 셀.
참고:이 단계는 잠재적인 셀 운동 능력;에 대 한 확인 된 PLS를 검사 이것은 (포함 대부분 식물 바이러스 MPs) Pd를 대상으로 하는 많은 단백질 또한 이웃 세포에 Pd를 통해 이동 하기 때문 에입니다. Agrobacterium 침투에 대 한 사용의 농도 다른 구조의 식 효율성에 각각 따라 다릅니다. Agroinfiltration에 대 한 보장 내용이 인접 한 셀을 떠나 단일 셀의 변화 (i), (ii) 식의 유사한 효율성을 달성 하는 셀 문화 희석을 사용 하 여 있는지 확인 합니다. 예를 들어 우리의 실험은 각각 0.01 및 c f P-태그 PLS 및 무료 DsRed2의 표현 위한 0.005의 OD600 활용합니다.
6. 키 PLS 잔류물 알라닌 스캔42 를 사용 하 여 식별
- 표준 PCR 프로토콜을 사용 하 여 설명 된 대로 원하는 돌연변이, 즉, 알라닌, 각 뇌관의 중앙 지역의 주위에 함께 대상 아미노산 잔류물의 대체를 포함 하도록 하는 뇌관의 쌍을 사용 하는 시퀀스를 코딩 PLS 증폭 21. 뇌관 디자인 및 사이트 지시 된 mutagenesis 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 사이트 감독 mutagenesis에 대 한.
- 모든 표준 DNA 정제 키트를 사용 하 여 결과 PCR 제품을 정화 하 고 37 ° C는 부모의 제거 하는 DpnI에 그들을 소화 (즉, 비 돌연변이) 갠 및 hemimethylated DNA. (얼음)에 실 온에서 5 분 동안 이것을 식혀. 그리고 혼합물을 대장균 유능한 세포43, 직접 변환 단계 3.2에 설명 된 대로 원하는 돌연변이 구문으로 식민지를 식별 합니다.
- 2.2.4 단계에서 설명한 대로 이진 벡터에 돌연변이 구조를 소개 하 고 3 단계에에서 설명 된 대로 agroinfiltration를 수행 5.1 4 단계에 설명 된 대로 Pd 대상으로 평가.
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Representative Results
충실 하 게 설명된 프로토콜에서 예상 결과 설명 하 고 식별 TMV MP PLS, 대표적인 데이터는 원 외. 에서 적응 21. 그림 1A 먼저 전장 TMV MP (1-268), TMV의 MP PLS (함유 단백질, 1-50의 처음 50 아미노산 잔류물), 표현 하는 주요 구조를 요약 하 고 V4A 파생 상품 검색의 알라닌 CFP (생성으로 융합 단계 2.2, 5.2 및 6에에서 설명 된) 그림 1B 요약 하 고 이러한 태그 단백질의 subcellular 지 방화를 수량화 하는 반면. 그림 1C 설명 특성 주변 punctate Pd 지역화 패턴 coexpressed Pd 마커, PDCB1-DsRed2에 관해서는 TMV MP에 대 한 CFP 위한 TMV MP PLS-CFP 뿐만 관찰 (단계 5.1 참조). 그림 2A Pd 대상 TMV MP-CFP의와 TMV MP PLS-CFP와 nucleocytoplasmic coexpressed 무료 DeRed2의 배포에 대 한 설명 (단계 5.1 참조). 마지막으로, 그림 2B Pd TMV MP와 TMV MP PLS 단일 알라닌 대체 V4A, 함께이 잔류물은 PLS 구조 또는 기능;에 대 한 중요 한 나타내는 타겟팅의 손실을 설명합니다 같은 세포 PDCB1는 아직도 Pd 하 localizes coexpressed Pd 마커 (6 단계 참조).
이러한 데이터 표시 단백질, 그들의 융해 autofluorescent 마커 화물 단백질, 조각과 Pd를 지역화 하는 기능에 대 한 테스트의 체계적인 생산의이 개념적으로 그리고 기술적으로 간단한 절차는 최소한의 단백질 순서를 식별할 수 있습니다. 필요 하 고 충분 한 대상, 즉, PLS Pd에 대 한. 이러한 지역화 데이터의 정확한 해석에 대 한 그것은 알려진된 Pd 단백질, 예를 들면, PDLP 또는 PDCB 가족16,23 또는 식물 중 하나 colocalization 실험을 수행 하는 중요 한 Pd44 정렬 바이러스 성 의원 . 물론,는 colocalization 모든 P 지역화 단백질 같은 Pd에 타겟이 될 수 있습니다 하지만 Pd 마커 단백질의 하나 이상으로 colocalization의 통계적으로 유의 한 정도 PLS 활동을 정의 하는 데 필요한 완료 될 필요가 없습니다.
그림 1: TMV MP의 pls. 주요 c f P-퓨전 구문 TMV MP pls. TMV MP 시퀀스, 녹색 상자;을 식별 하는 데 사용의 (A) 요약 C f P, 파란색 상자; P, 발기인; T, 터미네이터입니다. 왼쪽 숫자는 각 TMV MP 조각에 포함 된 아미노산 잔류물을 나타냅니다. (B) (A)에 표시 된 융해 단백질의 subcellular 지 방화의 요약. Pd 지역화 또는 nucleocytoplasmic 지역화는 각각 해당 subcellular 마커, PDCB1 DsRed2 및 무료 DsRed2의 지역화에 따라 하는 것을 결정 했다. 각 지역화 패턴을 전시 하는 셀의 백분율은 3 개의 독립적인 실험에 구조 당 100 표현 셀 점수에 따라 표시 됩니다. 데이터는 평균 ± 표준 오류 (SE). (C) Pd TMV MP-CFP, TMV MP PLS-c f P, Pd 마커 PDCB1-DsRed2의 타겟팅. C f P 신호는 파란색; DsRed2 신호는 자주색; plastid autofluorescence 필터링 했다. 이미지는 단일 confocal 섹션. 스케일 바 = 10 µ m. DIC, 미분 간섭 명암 현미경 사진. 이 수치는 원 외. 에서 적응 21. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Pd TMV MP, TMV MP PLS 및 그들의 알라닌 검색 돌연변이의 타겟팅. TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP, 및 nucleocytoplasmic 마커 DsRed2 (A) Subcellular 현지화. (B) 손실의 Pd TMV MP-CFP와 TMV MP PLS-CFP V4A 알라닌 검색 뮤턴트의 능력을 대상으로. Pd는 Pd 마커 PDCB1-DsRed2의 coexpression에 의해 구상 했다. C f P 신호는 파란색; DsRed2 신호는 자주색; plastid autofluorescence 필터링 했다. 이미지는 단일 confocal 섹션. 스케일 바 = 10 µ m. DIC, 미분 간섭 명암 현미경 사진. 이 수치는 원 외. 에서 적응 21. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 4 명의 코어 성분: 시퀀스를 필요 하 고 충분 한 Pd, 길이, 점차적으로 줄어드는 조각으로 관심사의 단백질의 체계적인 부문 융합는 테스트 대상에 대 한 식별의 개념 태그와 고분자 화물, 및 Pd 생활에 대상에 대 한 기능 분석 결과 제공 하는 autofluorescent 단백질 조각 공장 테스트 융해 단백질의 과도 식 다음 조직. Note Agrobacterium 중재 과도 식 시간, 즉, 몇 일, 유사한 연구15에서 자주 사용 하는 유전자 변형 식물의 생산에 필요한 개월에 비해 상대적으로 짧은 기간 내에 데이터를 생성 합니다.
Coexpression subcellular 지 방화 마커 관심사의 단백질의 예를 들어, PDCB1 또는 무료 DsRed2, 보통 수행 multigene 표정 벡터에서. 그러나, 단일 벡터에 여러 식 카세트의 전송 기술적으로 문제가 있는 경우에, coexpression 또한 수행할 수 있습니다 별도 바이너리 구문으로 각 카세트를 전송 하 고 해당 볼륨의 액체 문화를 결합 하 여는 agroinfiltration에 대 한 결과 Agrobacterium 변종입니다. 이 프로토콜 이용 과도 식, 하기 때문에 그들의 존재는 식 효율에 해로운 이진 벡터 안정적인 변화를 위한 선택 마커를 수행 하지 필요.
이 프로토콜은 단백질 표정에 대 한 최적화 된 및 대상 명. benthamiana;에 그러나, 그것은 다른 식물 종, 애기45,46, 의무가 Agrobacterium 여 유전자 변환을 포함 하 여 사용할 수 있습니다. 다른 식물 종, 또는 그렇지 않으면 원하는 경우,이 프로토콜 biolistic 배달41 과도 식 이진 벡터 식 카세트를 전송할 필요가 pSAT 기반 벡터에서 직접 활용을 적용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 중요 한 포인트 식물 재료의 일관 된 생리 및 발달 상태 이다. 특히, 모든 식물 전체 실험 내내 건강 해야 하며, agroinfiltration, N. benthamiana 식물 4 주 미만 수 있어야 합니다 오래 되 고 가장 큰 잎을 4-6 cm 직경에 되 고 4-8-잎 단계에서. 식물이 너무 젊은 경우, agroinfiltration의 효과 너무 심한, 표현과 태그 단백질의 지 방화에 방해가 될 것입니다. 다른 한편으로, 이전 식물은 종종 Pd24,25, 또한 Pd를 대상으로 패턴의 일관성에 영향을 미치는 변수 건축 전시.
아직도, 특히 변환 된 셀의 전체 식물의 생리 적 조건 변화, 때문 Pd는 각 실험에서 대상으로의 효율성 다소 다릅니다. 따라서, 셀의 비교적 큰 숫자를 분석 하는 것이 중요 하다 (> 100) 실험, 당 각 실험의 최소한 3 개의 생물 복제를 수행 하 고. 일반적으로, 우리 그것은 전시 하는 변형 된 세포의 70% 이상에서 Pd 지역화 하는 경우 활동을 대상으로 하는 Pd를 포함 테스트 조각 고려. 스튜던트 t-검정, 및 p-값에 의해 Pd 대상으로 각 조각, 예를 들면, Pd 특정 punctate 축적 패턴을 보여주는 변형 된 세포의 %의 효율에에서 차이 분석 해야 합니다 < 0.05 0.01, 해당 하는 보다 큰 95-99%의 통계적 확률입니다.
또 다른 중요 한 문제는 융합 분자에 형광 태그/화물의 위치입니다. 일부 Pd 대상 단백질 바인딩과 그물 (응급실), 또한 연관 그리고이 협회 가리지 아미노 터미널 시퀀스 해야 할 수도 있습니다. 이러한 경우, 아미노 터미널 융해, 관심의 단백질 조각의 carboxyl 종점 형광 태그의 아미노 말단에 융합은 예를 들어, c f P 또는 DsRed2, 사용 되어야 한다. 다음과 같은 경우에는 태그의이 기본 위치를 변경할 수 있습니다. (i) 해당 되는 경우 아미노 터미널 융해는 사용할 수- 즉, 그들은 하지 않습니다 의미 있는 subcellular 지 방화 패턴을 전시, 제대로 표현 된 또는 신뢰할 수 있는 탐지-에 대 한 충분 한 형광 신호를 생성 하지 않는 경우 관심의 단백질은 아미노 맨끝 신호 순서 또는 carboxyl 터미널 융해 시험된 단편의 아미노 말단 태그의 carboxyl 종착역에 융합은 포함 하지 않습니다, 그들은 시도 한다. (ii) carboxyl 터미널 융해 또한 사용 되어야 한다 신호 순서에 그것의 carboxyl-관심사의 단백질에 포함 되어 있는 경우. (iii) 관심사의 단백질은 모두 아미노산 및 carboxyl-터미널 신호 GPI 정박 단백질에서 찾아낸 그들과 같은 또는 아미노 맨끝 신호 펩 티 드를 포함 하는 경우 아직 터미널 아미노 융합은 사용할 수 없습니다, 경우 태그 배치 해야 내부적으로 ( 어느 하류 아미노 터미널 신호 또는 업스트림 carboxyl 터미널 신호). 우리의 이전 간행물47,48에 단백질의 내부 형광 태그에 대 한 몇 가지 유용한 절차를 설명 합니다.
현재, 거기는입니다 아무 알려진된 합의 PLS. 같은 (단계 5.2) 좋습니다, 처음 단백질 100-200 잔류물 긴 조각을 연속 ~로 분할. 이 만들어질 수 있다 다음 점차적으로 짧은 관찰된 Pd를 대상으로 활동 또는 그것의 부족에 따라. 단백질 (예를 들어, NLS, 신호 펩 티 드, 등)에 신호를 대상으로 다른 가능성을 염두 해야 합니다. 그러나, PLS 시퀀스와 같은 시퀀스의 잠재적인 중복 알려져으로, 이러한 단백질 영역 mutational이 분석에 포함 되어야 합니다.
지금까지,이 프로토콜 단백질 분자21단일 PLS를 식별 하기 위해 사용 되었다. 그러나, 단백질 수 있습니다 포함 될 하나 이상의 신호 순서; 실제로 여러 NLSs GATA 녹음 방송 요인49를 포함 하 여 많은 핵 단백질에 설명 되어 있다. 따라서, 분석할 때 테스트 단백질의 다른 조각을 대상으로 Pd에 대 한, 그 하나 이상의 같은 조각 식별 됩니다, 독립적으로 또는 공동 성으로 행동 할지도 모른다 여러 PLSs의 존재를 나타내는 가능 하다.
이 프로토콜의 주요 제한은, agroinfiltration, subcellular 지 방화의 시각화를 뚜렷이 다음 관심의 표현된 단백질은 잘 달성 표 피 세포와 상대적으로 좁은 성장 단계에서입니다. 필요한 경우 안정적으로 테스트 단백질 그들의 조직 및 세포 유형 대부분의 각을 표현 하는 유전자 변형 식물을 생산 하 여이 제한을 극복할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 바이러스 MPs 또는 변이 유전자 변환에 순종 하지 않은 식물 종에서 서만 작동 하는 다른 Pd 대상 단백질의 연구에 유용 하지 않을 것 이다.
우리 TMV MP의 PLS의 식별을 위해이 기술을 개발 하는 동안 다른 PLSs의 발견 식물 바이러스 MPs 또는 정도 또는 영구적으로 Pd을 지역화 식물 내 생 단백질에서 사용할 수 있습니다. 또한, 적절 한 subcellular 지 방화 마커47와 결합 하는 경우이 프로토콜의 단백질 식물의 많은 다른 대상 신호 식별을 위해 적당 하다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
공간 부족에 대 한 우리 대부분 검토 기사를 인용 하 고 우리는 그의 원래 일 인용 하지 되었다 우리의 동료에 게 사과. V.C. 실험실에서 작업을 V.C., NIH, NSF, USDA/NIFA, 시인, 그리고 BSF에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 그리고 S.G.L. 실험실 NIH와 S.G.L.에 부서의 식물 병리학과 식물-미생물 생물학에서 자금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
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