Summary
Nous décrivons des méthodes simples pour étudier la régulation du transporteur de la sérotonine intestinale fonction (SERT) et d' expression en utilisant un modèle in vitro de cellules de culture de cellules Caco-2 cultivées en 3D et un modèle ex vivo de l' intestin de souris. Ces méthodes sont applicables à l'étude d'autres transporteurs épithéliaux.
Abstract
L'épithélium intestinal a des fonctions de transport et de barrières importantes qui jouent un rôle clé dans les fonctions physiologiques normales de l'organisme tout en assurant une barrière à particules étrangères. transports épithéliale avec facultés affaiblies (ions, nutriments, ou des médicaments) a été associé à de nombreuses maladies et peut avoir des conséquences qui vont au-delà des fonctions physiologiques normales des transporteurs, comme en influençant l'intégrité épithéliale et le microbiome intestinal. Comprendre la fonction et la régulation des protéines de transport est essentiel pour le développement d'interventions thérapeutiques améliorées. Le plus grand défi dans l'étude du transport épithélial développe un système modèle approprié qui récapitule les caractéristiques importantes des cellules épithéliales intestinales indigènes. Plusieurs modèles de culture in vitro de cellules, telles que les cellules Caco-2, T-84 et des cellules HT-29-Cl.19A sont généralement utilisés dans la recherche sur le transport epithelial. Ces lignées cellulaires représentent une approche réductionniste à la modélisation de l'epithelium et ont été utilisés dans de nombreuses études mécanistiques, y compris l'examen des interactions épithélium-microbienne. Cependant, les monocouches de cellules ne reflètent pas précisément les interactions cellule-cellule et le micro - environnement in vivo. Les cellules cultivées en 3D ont montré que modèles prometteurs pour les études médicaments de perméabilité. Nous montrons que les cellules Caco-2 en 3D peuvent être utilisées pour étudier les transporteurs épithéliaux. Il est également important que les études de cellules Caco-2 sont complétées par d'autres modèles pour exclure des effets spécifiques de cellules et de prendre en compte la complexité de l'intestin natif. Plusieurs méthodes ont déjà été utilisés pour évaluer la fonctionnalité des transporteurs, tels que le sac évasé et l'absorption dans les cellules épithéliales isolées ou isolées dans des vésicules de membrane plasmique. Prenant en considération les défis dans le domaine par rapport aux modèles et à la mesure de la fonction de transport, nous démontrons ici un protocole de croître cellules Caco-2 en 3D et décrire l'utilisation d'une chambre de Ussing commeapproche efficace pour mesurer le transport de la sérotonine, comme dans les épithéliums intestinales polarisées intactes.
Introduction
L'épithélium intestinal est équipé de diverses protéines de transport (canaux, les ATPases, les co-transporteurs et les échangeurs) qui réalisent de nombreuses fonctions allant de l'absorption des nutriments, des electrolytes, des médicaments et à la sécrétion de fluide et des ions dans la lumière. protéines de transport génèrent des gradients électrochimiques qui permettent le mouvement des ions ou des molécules d'une manière vectorielle. Ceci est réalisé par les distributions asymétriques des systèmes de transport dans les membranes apicales et basolatérales des cellules epitheliales polarisées. En outre, les jonctions serrées, qui longe les cellules épithéliales adjacentes, jouent un rôle important dans ce processus en servant de barrière à la diffusion intramembranaire des composants entre les domaines de la membrane apicale et basolatérale. Des systèmes appropriés de modèles imitant ces traits caractéristiques de l'intestin natif (c. -à -polarité, la différenciation et l' intégrité des jonctions serrées) sont essentielles pour l'étude de la functionalité des systèmes de transport épithéliales.
En ce qui concerne les modèles, les lignes typiques de cellules utilisées actuellement dans la recherche de transport épithéliales intestinales sont Caco-2, un modèle de complètement différenciées, absorbantes petites cellules épithéliales intestinales; et les cellules T84 ou HT-29 sous - clones, les modèles de grandes cellules épithéliales intestinales cryptiques dérivés 1. Classiquement, ces lignées cellulaires sont cultivées sous forme de monocouches dans des surfaces en plastique ou dans des inserts Transwell revêtus. Trans et des inserts de culture cellulaire dans une certaine mesure proche de l'environnement in vivo en permettant aux cellules polarisées pour alimenter basolatéral. Toutefois, une limitation dans les systèmes de culture 2D classiques est que les cellules sont obligées de s'adapter à une surface artificielle, plate et rigide. Ainsi, la complexité physiologique de l'épithélium natif ne se reflète pas avec précision dans un système 2D. Cette limitation a été résolu par des procédés pour cultiver des cellules en 3D dans un micro-environnement spécifique, comme gélatineux mixtur protéiquee, contenant une variété de composants de matrice extracellulaire 2, 3. Néanmoins, les cultures in vitro ne peuvent pas simuler la complexité de l'épithélium intestinal, qui comporte plusieurs types de cellules et de l' architecture spécifique à la région dans l'intestin. Ainsi, les études utilisant des modèles de culture cellulaire nécessitent une validation supplémentaire dans l'intestin d'origine. Utilisation de la culture in vitro de cellules 3D et intestinale de la souris muqueuse, nous décrivons ici les méthodes simples pour étudier la régulation du transporteur de la sérotonine intestinale (de SLC6A4, SERT).
Le transporteur SERT régule la disponibilité extracellulaire d'une hormone importante et neurotransmetteur 5-hydroxytryptamine (5-HT), en transportant rapidement à travers un Na + / Cl - Procédé -dépendante. SERT est une cible connue d'anti-dépresseurs et a récemment émergé comme une nouvelle cible thérapeutique des troubles gastro-intestinaux, tels que la diarrhée et une inflammation intestinale.Méthodes pour étudier l'absorption de 5-HT dans les cellules épithéliales de l'intestin ont été décrites précédemment. Par exemple, les cellules Caco-2 cultivées sur des supports en plastique ou des inserts perméables se sont révélés présenter une fluoxétine sensible 3 H-5-HT absorption dans les deux domaines apicaux et basolatéraux 4. La mesure de la fonction SERT en isolé Brush Border vésicules membranaires (BBMV) préparé à partir de donneurs d'organes humains l' intestin grêle a également été décrite par nous 5. 3 H-5-HT dans l' absorption BBVMs humains a été démontré que la fluoxetine sensible et Na + / Cl - dépendante, et elle présentait une cinétique de saturation avec un K m de 5 300 nm. Utilisant des méthodes similaires, nous avons également mesuré précédemment fonction SERT en 3 H-5-HT absorption dans la souris BBMV intestinale 6. Cependant, la préparation de vésicules de membrane plasmique pur nécessite une grande quantité de la muqueuse tissulaire. D'autres procédés, tels que le radiogvisualisation raphic de 3 sites d'absorption H-5-HT, ont également été montré précédemment dans Guinée porc et de rat petits intestins 7.
La chambre Ussing fournit un système plus physiologique pour mesurer le transport des ions, des nutriments et des médicaments dans divers tissus épithéliaux. Le principal avantage de la technique de la chambre de Ussing est qu'il permet la mesure précise des paramètres électriques et de transport des intacte, l'épithélium intestinal polarisé. En outre, pour réduire au minimum l'influence du système neuromusculaire intrinsèque, décapage séromusculaire de la muqueuse intestinale peut être effectuée pour étudier la régulation des transporteurs dans l'épithélium 8.
Nous démontrons que cellules Caco-2 cultivées en 3D sur la protéine gélatineuse forment une lumière creuse exprimant des marqueurs apical et basolatéral distincts. Ces cellules présentent une expression plus élevée de SERT que 2D cellules Caco-2. Méthodes pour cultiver des cellules 3D et peimmunocoloration rform ou de l'ARN et de protéines d'extraction sont décrits. En outre, nous décrivons les méthodes pour étudier le fonctionnement du SERT et la régulation par le TGF-β1, une cytokine pléiotropique, dans une petite muqueuse intestinale en utilisant une technique de la chambre de Ussing.
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Protocol
1. Etude de Intestinal Transpalette dans un système de culture 3D de Caco-2: Growing 3D Caco-2 Culture cellulaire sur une protéine mélange gélatineux
- le facteur de croissance réduit décongeler mélange de protéines gélatineux sur de la glace pendant 8 h (ou O / N) à 4 ° C. Une fois décongelé, faire 1 ml ou 500 aliquotes uL pour utilisation ou conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Le jour de la culture, prérefroidir les plaques de culture (pour l'ARN et de protéines d'extraction) ou diapositives chambré (pour immunocoloration) sur la glace. Ajouter 30 pi de mélange de protéines gélatineuse à chaque puits d'une lame de huit puits chambré-verre (ou 120 pi par puits d'une plaque à 6 puits) et répartir uniformément. Prenez soin de ne pas générer des bulles d'air pendant le processus.
- Placez les diapositives / plaques à l'intérieur d'un incubateur de culture de cellules à 37 ° C pendant 15 - 30 min et laisser le mélange de protéines gélatineuse se solidifier.
- Tandis que le mélange de protéines est gélatineux solidification, trypsiniser un ballon confluente de cellules Caco-2.
- Comptez le nombrede cellules et de spin eux à 500 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min. Remettre en suspension le culot de cellules en 3D Caco-2 Support selon les besoins.
- Ensemencer les diapositives de la chambre de verre à 4000 cellules par puits (pour les plaques, 20 000 par puits). Permettre aux cellules de se développer dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 à 37 ° C. Changer le milieu tous les 3 - 4 d.
2. immunofluorescence pour épithéliale Transpalette en 3D cellules Caco-2: Jour 1
- Aspirer le milieu et fixer les cellules avec 400 ul de 2% de paraformaldehyde (PFA) (dans du PBS avec le pH ajusté à 8,5 avec du NaOH) pendant 30 min à température ambiante.
NOTE: solution PFA ne doit pas être stocké pendant plus de 1 semaine à 4 ° C, et une solution fraîchement préparée peut être utilisée. ATTENTION: PFA est hautement toxique et cancérigène potentiel. Toujours manipuler avec précaution dans une hotte chimique et en utilisant un équipement de protection individuelle. - Rincer les puits deux fois avec 1 x PBS et stocker les diapositives à 4 ° C dans du PBS (400 ul /bien). Une fois fixé, les stocker à 4 ° C pendant une semaine.
- Réchauffez les diapositives de chambre à RT (cela va durcir le lit de mélange de protéines gélatineuse et de le rendre facile à aspirée pendant les étapes de lavage).
- Perméabiliser les cellules avec 0,5% de Triton dans du PBS pendant plus de 15 min.
- Préparer un tampon PBS-glycine (NaCl 130, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO 4, et mM Glycine 100). Rincer 3x avec PBS 1x-glycine pendant 10 minutes chacun à RT.
- Préparer un tampon d'immunofluorescence (IF): NaCl 130, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de NaH 2 PO 4 mM , Glycine 100, 7,7 mM de NaN3, 0,1% de BSA, 0,2% de Triton X-100 et 0,05% de Tween-20 .
- Laver 3x dans IF tampon pendant 10 minutes chacun à RT. Bloquer dans 5% normal sérum de chèvre (NGS) dans un tampon. Laisser incuber avec l'anticorps primaire dilué dans IF + 1% de sérum de chèvre, 200 ul / puits, pendant 1 - 2 h à température ambiante. Laver avec une solution tampon IF 3x pendant 10 minutes chacun.
- Laisser incuber avec un anticorps anti secondairecorps (1: 200) dilué dans IF + 1% NGS, 200 pl / puits, pendant 1 h à température ambiante.
- Laver avec un tampon IF trois fois pendant 10 minutes chacun. Gardez les diapositives dans l'obscurité de cette étape sur. Soulever les chambres de plastique des lames de verre en plaçant la lame de la chambre dans un support noir et blanc glissant avec un dispositif de levage à travers le support jusqu'à ce que ses contacts de bord, le bord des puits. Tirez doucement sur les chambres (le support et lifter devraient venir avec les diapositives de la culture).
- Monter avec le milieu anti-fade lente et laisser sécher pendant 10 min à température ambiante.
- Une fois complètement séché, sceller les lames avec le vernis à ongles et de l'image eux avec la microscopie confocale. Stocker les lames à 4 ° C pendant deux semaines, ou à -20 ° C pendant plusieurs mois.
3. ARN et d'extraction des protéines 3D cellules Caco-2
- Traiter les cellules cultivées sur le mélange de protéines gélatineux pour les 12 - 14 jours avec un agent d'essai, tels que TGF β1 (10 ng / ml, 1 h).
- Après le traitement, laver les cellules avec 1x PBS. Maintenir les cellules sur la glace pendant 30 minutes pour liquéfier le mélange protéique gélatineuse.
- Laver les puits avec réfrigérés PBS et recueillir les cellules dans des tubes de centrifugation individuels. Recueillir les cellules par centrifugation à basse vitesse à 500 g et 4 ° C pendant 10 min. Extraire l'ARN en utilisant des procédures standard et utiliser en temps réel RT-PCR.
- Pour l'extraction des protéines, la lyse des cellules en utilisant 1 x tampon de lyse cellulaire additionné d'un inhibiteur de protéase de cocktail 1x. Après addition d'un tampon de lyse cellulaire au culot, lyser les cellules par sonication et éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 7500 x g et 4 ° C pendant 10 min.
4. Mesure de la 5-HT Uptake dans Souris iléon Utilisant une Chambre Ussing: Intestinal Préparation et séromusculaire Stripping
- Après l'euthanasie, disséquer les souris et enlever les petits intestins (après l'estomac et avant le caecum). Diviser le petit intestin en trois parties. Jeter le tiers médian, utilisez le tiers proximalcomme jéjunum, et utiliser le tiers distal comme iléon. Évitez de tirer l'intestin de son attachement mésentérique pour éviter d'endommager l'épithélium. Gardez la coupe de tissu froid en le couvrant avec du bicarbonate de Krebs-Ringer glacée (KBR) tampon.
- Ouvrez l'intestin en utilisant longitudinalement ciseaux. Incuber sections intestinales fraîchement excisées dans de la glace-froid, le gazage KBR contenant 1 uM indométacine pendant 10 min avant la séromusculaire stripping.
- Goupiller la section intestinale (~ 1 cm de longueur) de la muqueuse vers le bas sur une plaque contenant 7% d'agarose ou d'un élastomère de silicone durcie (0,5 cm d'épaisseur).
- Dépouiller les couches séromusculaire sous un stéréomicroscope de dissection avec éclairage de fond. Couper la couche séromusculaire utilisant une lame plume de scalpel. Utiliser une pince fine pour obtenir le bord de la couche le long de l'axe longitudinal de l'intestin.
REMARQUE: Au cours de la procédure de décapage, l'éclairage bas de la stéréomicroscope permet d'identifier et d'éviter les zones avec les plaques de Peyeres. - Après l'achèvement de l'entraînement à séromusculaire, monter la muqueuse avec précaution sur les broches d'un demi-chambre de Ussing. Pendant tout le processus, prendre soin de tenir le tissu muqueux dépouillé par les bords pour éviter de le déchirer.
5. équilibration et le traitement des tissus
- Préparer une solution de Kreb: NaCl 115, 25 mM NaHCO3, 2,4 mM de K 2 HPO 4, 1,2 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgCl2 et 0,4 mM de KH 2 PO 4 à pH 7,4, gazés avec 95% O 2/5% CO 2 à 37 ° C. Ajouter 10 mM de glucose dans le bain de séreuse pour servir de substrat énergétique et de mannitol à 10 mM au bain de la muqueuse pour maintenir l'équilibre osmotique.
REMARQUE: La solution de Kreb est complétée par de l'acide L-ascorbique (100 pM) et de la pargyline (100 uM, un inhibiteur de la monoamine oxydase) afin d'empêcher la dégradation intracellulaire de 5-HT. - Insérez le curseur dans la chambre pour exposer à la fois la apicale (luminale) siet de la (séreuse) côté basolatéral du tissu à la solution de Kreb.
- Après une période d'équilibration de 10 minutes, le tissu iléal prétraiter avec fluoxetine (10 uM) pendant 30 min sur le côté apical J ms (flux muqueux à séreux).
- Traiter le tissu avec le TGF-β1 (10 ng / mL) pendant 1 h sur le côté basolatéral puis incuber avec 3 [H] -5-HT (20 nM) pendant 30 min sur le côté apical.
6. Quantification de muqueux à séreuse Flux (J ms) et 3 [H] -5-HT Accumulation dans le tissu
- Collecter des aliquotes de 0,75 ml à partir du réservoir séreuse ( un total de 5 ml) pour mesurer la radioactivité dans un compteur à scintillation liquide et pour calculer la muqueuse à la séreuse (J ms) Taux de flux; fluoxétine sensible flux représente SERT-médiée 3 [H] -5-HT absorption.
- Pour éviter les différences de pression hydrostatique à travers la muqueuse pendant une période de flux, prélever des échantillons du côté séreux et reles placer avec des volumes identiques de milieu de bain.
NOTE: Le calcul de flux pour corriger la dilution de l'échantillon final (4,25 ml / 5 ml = 0,85). - Pour la quantification de 3 [H] -5-HT accumulée dans le tissu, démonter la muqueuse du curseur, laver une fois avec un tampon KRB glacée, et le placer dans des tubes de culture en verre.
- Incuber la muqueuse dans 0,5 ml de KOH à 10% pendant une nuit à 37 ° C. Mesurer la radioactivité dans 150 ul de parties aliquotes des lysats (en triple exemplaire) à l'aide d'un compteur à scintillation liquide.
- Utilisez aliquotes (3-5 pi) des lysats pour mesurer la concentration de protéines en utilisant la méthode de Bradford.
REMARQUE: 10 ml de milieu d'incubation contenant la sérotonine radioactif est utilisé comme étalon. 5-HT dans le tissu retenu est exprimée en pmol / mg de protéine / min.
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Representative Results
Immunocoloration en 3D Caco-2 kystes est représenté sur la figure 1. Une image représentative d'un plan XY montrant lumen bien délimitées dans le kyste 3D colorés avec phalloidin actine est représenté sur la figure 1A. Le côté tourné vers la lumière représente le côté apical. Les cellules épithéliales en culture dans un résultat de l'environnement 3D dans un phénotype épithélial robuste. Différents Caco-2 kystes le jour 12, lorsque l' actine et SERT ont été co-colorées, sont présentés dans la figure 1B. Dans cette représentation d'un plan XY (différent du plan représenté sur la figure 1A), le SERT coloration est visible, principalement dans la membrane luminale, ainsi que des sous-apicale coloration. La figure 2 montre que les taux de protéine SERT sont plus élevés dans les kystes 3D par rapport aux cellules Caco-2 cultivées en monocouches sur le 12 ème jour postplating. Ces données suggèrent que la culture 3D de cellules Caco-2 peut déclencher des événements de signalisation qui miment native épithéliums et entraîner une augmentation de l'expression du SERT. La figure 3A représente la vue d' ensemble et le fonctionnement d'un système de chambres d' Ussing et montre l'intestin grêle , monté dans les broches de l'ouverture. Cette technique permet l'évaluation de l'activité des transporteurs épithéliaux dans l'intestin d'origine. L'avantage de l'approche de la chambre Ussing est la capacité d'évaluer la fonction des transporteurs exprimés sur la luminal (muqueuse) ou basolatérale (séreuse) côté. La figure 4 met en évidence augmenté de 5-HT J ms flux (A) et une accumulation accrue de 5-HT dans la muqueuse iléale (B) en réponse au TGF-β. Etant donné que le TGF-β1 a augmenté le déplacement de la 5-HT radiomarquée à partir de la muqueuse à côté séreux, comme représenté par les ms J, ces données indiquent une augmentation de l' absorption de 5-HT à partir de la membrane luminale des cellules épithéliales iléales. Cela est en outre évident d'après une augmentation de l'accumulation de 5-HT radiomarquée dans la cellule, quiest sensible à l'inhibition par la fluoxétine, ce qui reflète l'activité SERT exprimée sur la membrane luminale.
Figure 1: Caco-2 cultivées sur une protéine mélange gélatineux à 12 d Affichage Distinct Lumen. Rouge: actine. Pour l'immunocoloration de Caco-2 cultivées en 3D kystes, les cellules ont été cultivées dans une glissière 8 puits chambré et colorées avec de la phalloïdine (A), comme décrit précédemment par Debnath et al. 9. Immunocoloration pour la 3D Caco-2 de la culture (B), les kystes ont été fixées dans 2% de PFA pendant 30 min, traitée avec du PBS-glycine et perméabilisées avec 0,5% de Triton-X-100 pendant 15 min à température ambiante. Après le blocage, les kystes ont été incubées dans un anticorps SERT (1: 100) pendant une nuit à 4 ° C. Ils ont ensuite été lavées et incubées avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents (1: 200) et phalloïdine (1: 200)pendant 45 min à température ambiante. Enfin, ils ont été montés dans antifade contenant DAPI. Les images ont été capturées en utilisant un microscope confocal. Barre d'échelle: 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: expression des protéines dans le SERT Caco-2 cellules cultivées en 2D et 3D. Des lysats de cellules Caco-2 cultivées sur un support plastique et Caco-2 3D sphères ont été résolues par SDS-PAGE, transférés sur des membranes de nitrocellulose et analysés avec l'anticorps SERT et GAPDH. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
![figure 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Figure 3: (A) La chambre Ussing et "slider" avec les broches et l' ouverture montrant un petit intestin de souris monté. Curseur zone d'ouverture = 0,30 cm 2. Le curseur s'insère dans les deux moitiés de la chambre de Ussing, qui sont compartimentés. Les paramètres électriques tels que la tension de potentiel trans - épithéliale (V t) est mesurée par un potentiomètre et des électrodes (typiquement calomel demi-cellules ou Ag-AgCl sont reliés par des ponts de sel à chaque moitié de chambre). Les ponts salins sont composés d'agar - agar fondu à 3% dans le tampon physiologique (par exemple KBr) utilisé pour le bain de la muqueuse pour éviter les altérations de la composition ionique des solutions. (B) Représentation schématique du principe de la chambre de Ussing. La muqueuse intestinale dénudée a été montée dans les deux moitiés de la chambre de Ussing séparant les muqueuses et séreuses chambres. traceur radioactif a été ajouté à la muqueuse side; l'absorption a été mesurée comme la quantité de radioactivité incorporée par le tissu, normalisée par rapport à la teneur totale en protéines. Le flux a été évaluée en mesurant la radioactivité dans la chambre séreuse sur une période de temps. Les électrodes indiquées dans le schéma permettent la surveillance simultanée des paramètres électriques, y compris le courant, la tension et la résistance. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Mesure de la Fonction SERT en Ileal Muqueuse Stripped de la couche séromusculaire. Ex vivo les effets du traitement TGF-β1 à court terme sur la fonction SERT dans l'iléon de souris, démontré par la mesure du 3 [H] -5-HT absorption et 3 [H] -5-HT fluidifie utilisant lechambre Ussing. Traitement TGF-β1 (10 ng / mL, 1 h) sur le côté basolatéral a augmenté de façon significative la fonction de SERT, comme en témoigne l'augmentation de Na + -sensible muqueuse à séreuse-flux (J ms) (A) et 3 [H] - 5-HT absorption (B). traitement par la fluoxétine du tissu iléal a inhibé l'absorption de 5-HT TGF-β1 stimulée. l'absorption de la fluoxétine sensible a été augmentée de 2,5 fois par le TGF-β1 par rapport au témoin. Les résultats sont représentés comme la moyenne ± SEM. Un test de ANOVA à sens unique de Tukey a été utilisé pour l'analyse statistique. Calcul de J ms flux: [(CPM e - CPM s) x facteur de dilution] / [(. V std x conc du substrat) CPM std / xtxa]. CPM e: nombre de coups par minute à la fin de la mesure de flux; CPM s: coups par min au début de la mesure de flux; CPM std: coups par min de la norme (prise à partir du réservoir de la muqueuse); V std: le volume of std CPM; t: temps de flux dans h; A: surface de l'ouverture (0,3 cm2). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Complètement différenciées monocouches Caco-2 cellules ont été largement utilisés en tant que monocouches epitheliales polarisées pour étudier le transport intestinal 10, 11, 12, 13, 14, 15. Cependant, pour imiter l'organisation physiologique des cellules épithéliales de l'intestin, il y a eu un intérêt considérable dans le développement d'une culture de cellules Caco-2 en 3D. Un certain nombre de modèles 3D de culture cellulaire pour les cellules épithéliales de l' intestin ont été récemment mis au point qui imitent cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire native (ECM) interactions avec une plus grande pertinence physiologique que les systèmes 2D 16. Ainsi, les hydrogels naturels à base d' ECM contenant des composants communs (tels que la laminine, le collagène IV, et le sulfate protéoglycane d' héparine) sont largement utilisés pour la production de cultures de cellules 3D 16.
Le protocole décrit ici démontre la pertinence de 3D cellules Caco-2 cultivées en mélange de protéines gélatineux (un hydrogel naturel à base ECM extrait de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) des tumeurs de souris) pour la recherche de transport épithélial. Dans les 10 jours, les cellules commencent à se former une lumière creuse entourée par une couche de cellules et de montrer la polarité, avec des domaines apical et basolatéral distincts. La densité cellulaire au moment de l'ensemencement d'un mélange de protéines gélatineux est critique pour la formation de kystes réguliers avec la lumière centrale. Pour les expériences de coloration, nous avons ajouté 4.000 cellules / puits d'une lame (bien surface: 0,7 cm 2) 8-chambre. Ensemencement des cellules à un résultat de plus haute densité dans les sphères irrégulières. Les 3D Caco-2 kystes à 10 - 12 jours montrent la polarité et une plus grande différenciation que 2D cellules Caco-2 cultivées sur transwell 17 (observations non publiées). Nous avons montré une augmentation marquée de l'expression de l'ARNm du SERT et des protéines comme compARED à monocouches 2D complètement différenciées. En outre, l' utilisation de ces méthodes, nous avons montré que le TGF-TGF-β1 augmente les niveaux de SERT de surface, comme le montre la coloration immunofluorescente 15.
Fait intéressant, des études récentes ont démontré que la 3D cellules Caco-2 sont plus sensibles aux stimuli physiopathologiques en raison de la présence de composants de signalisation critiques, tels que le récepteur TNF 2 et MyD88, et représentent un meilleur modèle que le système 2D classique 17. Cependant, un problème qui limite l'utilisation de la 3D Caco-2 dans la recherche de transport épithélial est le manque de différents types de cellules et de la complexité que l'on trouve dans l'intestin d'origine. À cet égard, organites intestinales (également connu sous le nom enteroids / colonoids) d'origine humaine ou de la souris représentent un modèle state-of-the-art contenant tous les types d'épithélium natif de cellules différentes pour étudier le transport des ions, des nutriments, ou des médicaments. Par rapport aux organites, biendifférenciée 3D Caco-2 kystes représentent un type de cellules épithéliales (c. -à -entérocytes absorbants) et sont certainement approprié pour des études portant sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent les transporteurs intestinaux. En effet, les cellules Caco-2 en 3D sont faciles à manipuler, sont rentables, et sont faciles à manipuler, par exemple pour les transfections d'ADN de plasmide et ARNsi. Une autre limitation de 3D cellules Caco-2 dans la recherche de transport épithélial est la difficulté d'accès à la lumière. Les agents qui se lient à des récepteurs membranaires luminal ou à des agents infectieux qui ont accès à l'épithélium du côté luminal peuvent être difficiles à étudier dans ce système. Cette limitation peut être surmontée par micro - injection des agents dans la lumière, comme cela a été fait précédemment dans le cas de la culture organoïde intestinale humaine des infections à C. difficile 18. Il est toutefois important que les études in vitro dans des modèles de culture cellulaire sont validés dans la i nativentestine en utilisant in vivo ou ex vivo approches.
Au cours des dernières décennies, la chambre de Ussing a grandement contribué à la reconnaissance des propriétés fonctionnelles ou réglementaires de nombreux transporteurs épithéliales 19. Ici, nous montrons la pertinence de l'approche de la chambre Ussing pour mesurer 5-HT flux et 5-HT absorption chez la souris muqueuse intestinale dépourvue de la couche séromusculaire 15. Traitement du TGF-β1 de la muqueuse de l' iléon du côté basolatéral (10 ng / ml, 1 h) a augmenté de manière significative la fonction du SERT, comme le prouve l' augmentation de Na + -sensible muqueuse à séreuse de flux (J ms) et 3 H-5- HT absorption. traitement par la fluoxétine du tissu iléal a inhibé la stimulation de TGF-β1 à médiation par la 5-HT absorption.
pour Achie étapes critiques de cette technique comprennent le montage du tissu sur l'ouverture de glissement comme une couche intacte (sans déchirures) ve des mesures précises. outils chirurgicaux appropriés, tels que des ciseaux à billes, une pince fine pointe, et les lames chirurgicales de plumes, sont importants pour le traitement approprié et le décapage des tissus.
Cette méthode est applicable à l' étude de la fonction des autres transporteurs épithéliaux, tels que les transporteurs d'électrolyte (chlorure, les transporteurs de Na + / H + échangeurs, les transporteurs de nutriments, etc.). Utilisations spécialisées du Ussing de chambre tels que la technique de pH stat, pour mesurer transépithélial la sécrétion de bicarbonate, et la méthode de flux isotopique, pour mesurer la sécrétion nette ou l' absorption de substrats ont été examinés en détail par le Dr Clarke et al. 8. Ils longuement examiné la demande de chambres d' Ussing à l'étude du transport des éléments nutritifs 19. chambres Mini Ussing ont également été utilisés dans des situations cliniquement pertinentes, par exemple pour mesurer la fonction de transport dans les échantillons de biopsieref "> 20. Le principal avantage de la technique de la chambre de Ussing sur la méthode de sac évasé est la capacité de mesurer simultanément les paramètres électriques et de transport des intact, épithélium intestinal polarisé.
Une préoccupation avec la méthode de la chambre de Ussing est limitée à la viabilité et la fonction optimale d'une préparation ex vivo intestinale. Lors du retrait de l'animal, l'ex vivo préparation intestinale ne peut durer jusqu'à 3 h dans une chambre de Ussing 19. Ainsi, ce procédé peut avoir des limites à tester l'effet des agents pendant des périodes de temps plus longues. Dans de tels cas, le traitement peut être effectué in vivo et ensuite isolé les intestins des groupes de contrôle et de traitement peuvent être utilisés pour mesurer les paramètres de transport avec la méthode Ussing. Dans tous les cas, l'amplitude du G t (ou R t) peut être un indicateur en temps réel de la viabilité et peut être utile dans la discrimination entre leseffets spécifiques et non spécifiques de réactifs testés.
En résumé, les méthodes décrites ici peuvent faciliter notre compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent la fonction et la régulation des transporteurs épithéliales dans des conditions saines et malades, tels que l'inflammation intestinale, la diarrhée infectieuse, la malabsorption, ou des troubles métaboliques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
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