Summary
Vi beskriver enkle metoder for å studere reguleringen av tarmserotonintransportøren (SERT) funksjon og ekspresjon ved bruk av en in vitro-cellekulturmodell av Caco-2-celler dyrket i 3D og en ex vivo-modell av mus tarmen. Disse metodene er aktuelt for studiet av andre epiteliale transportører.
Abstract
Tarmepitelet har viktige transport- og barrierefunksjoner som spiller nøkkelroller i normale fysiologiske funksjoner i kroppen samtidig som det gir en barriere mot fremmede partikler. Nedsatt epitelial transport (ion, næringsstoffer eller medikamenter) har blitt forbundet med mange sykdommer og kan ha konsekvenser som strekker seg utover de normale fysiologiske funksjoner av transportørene, for eksempel ved å påvirke epitelial integritet og tarmen mikrobiomer. Å forstå funksjon og regulering av transportproteiner er kritisk for utviklingen av forbedrede terapeutiske intervensjoner. Den største utfordringen i studiet av epiteliale transport er å utvikle en passende modellsystem som sammenfatter viktige trekk ved de innfødte intestinale epitelceller. Flere in vitro cellekultur modeller, slik som Caco-2, T-84, og HT-29-celler Cl.19A brukes vanligvis i epithelial transport forskning. Disse cellelinjene representerer en reductionist tilnærming for å modellere epithelium og har vært brukt i mange mekanistiske studier, inkludert deres undersøkelse av epitel-mikrobiell interaksjoner. Men ikke cellemono ikke nøyaktig gjenspeiler celle-celle interaksjoner og in vivo mikromiljøet. Celler dyrket i 3D har vist seg å være lovende modeller for medikament permeabilitet studier. Vi viser at Caco-2-celler i 3D, kan brukes til å studere epiteliale transportører. Det er også viktig at studier i Caco-2-celler er supplert med andre modeller for å utelukke celle spesifikke effekter og for å ta hensyn til kompleksiteten til det native tarmen. Flere metoder er tidligere blitt brukt til å vurdere funksjonaliteten av transportører, slik som vrengte sekk og opptak i isolerte epitelceller eller i isolerte plasmamembranvesiklene. Tatt i betraktning de utfordringer i felt med hensyn til modell og måling av transportfunksjon, viser vi her en protokoll for å vokse Caco-2-celler i 3D og beskriver bruken av en Ussing kammer som eneffektiv metode for å måle serotonin transport, for eksempel i intakte polariserte intestinale epitel.
Introduction
Tarmepitelet er utstyrt med flere transport- proteiner (kanaler, ATPaser, co-transportører og veks) som utfører en rekke funksjoner som strekker seg fra absorpsjon av næringsstoffer, elektrolytter, og legemidler for utskillelsen av væske og ioner i lumen. Transportproteiner generere elektrokjemiske gradienter som tillater bevegelse av ioner eller molekyler i en vektoriell måte. Dette oppnås ved de asymmetriske fordelinger av transportsystemene i den apikale og basolaterale membraner av polariserte epitelceller. I tillegg er tett veikryss, som fortøyningen tilstøtende epitelceller, spiller en viktig rolle i denne prosessen ved å tjene som en barriere mot intramembrane diffusjon av komponentene mellom de apikale og basolaterale membran domener. Passende modellsystemer som etterligner disse karakteristiske trekk ved de innfødte tarmen (dvs. polaritet, differensiering, og stram krysset integritet) er kritisk for studiet av functiodis- posisjon av epiteliale transportsystemer.
Med hensyn til modeller, den typiske cellelinjer som benyttes for tiden i intestinal epithelial transport forskning er Caco-2, en modell av fullt differensiert, absorberende små intestinale epitelceller; og T84 celler eller HT-29 subkloner, modeller av krypten-avledet store intestinale epitelceller 1. Vanligvis er disse cellelinjer dyrket som monolag i plastoverflater eller i belagte Transwell innsatser. Trans-brønns celledyrkningsinnsatser til en viss grad ligner in vivo miljø ved at polariserte celler til å mate basolaterally. Imidlertid er en begrensning i konvensjonelle 2D kultursystemer at cellene blir tvunget til å tilpasse seg en kunstig, flat og stiv overflate. Således er den fysiologiske kompleksiteten av det native epitel ikke nøyaktig gjenspeiles i et 2D-system. Denne begrensningen har blitt overvunnet ved fremgangsmåter for å dyrke celler i 3D i en bestemt mikromiljøet, for eksempel gelatinaktig protein mixture, som inneholder en rekke ekstracellulære matriks-komponentene 2, 3. Ikke desto mindre kan de in vitro kulturer ikke simulere kompleksiteten i tarmepitelet, som har flere celletyper og regionspesifikke arkitektur i tarmen. Dermed studier ved hjelp av cellekultur modeller kreve ytterligere validering på mors tarmen. Ved hjelp av in vitro cellekultur 3D og mus intestinal mucosa, beskriver vi her enkle metoder for å studere reguleringen av tarmserotonintransportøren (SLC6A4, SERT).
Den SERT transporter regulerer den ekstracellulære tilgjengeligheten av et viktig hormon og nevrotransmitter, 5-hydroksytryptamin (5-HT), ved raskt å transportere den gjennom en Na + / Cl - -avhengig prosess. Sert er et kjent mål for anti-depressiva og har nylig dukket opp som en roman terapeutisk mål av GI lidelser, for eksempel diaré og tarmbetennelse.Metoder for å undersøke 5-HT-opptak i intestinale epitelceller er tidligere blitt beskrevet. For eksempel har Caco-2-celler dyrket på plast bærere eller gjennomtrengelige innsatser blitt vist å oppvise fluoksetin-sensitive 3H-5-HT gjenopptak ved begge apikale og basolaterale domener 4. Målingen av SERT funksjon i isolert børstegrense membranvesikler (BBMVs) fremstilt fra menneskeorgan givertynntarmen er også blitt beskrevet av oss 5. 3-H-5-HT gjenopptak i humane BBVMs ble vist å være fluoksetin-sensitive og Na + / Cl - -avhengig, og det oppviste metningskinetikk med en K m av 300 nM 5. Ved å benytte lignende fremgangsmåter, har vi også tidligere målte SERT funksjon som 3H-5-HT-opptak i mus intestinal BBMVs 6. Imidlertid er fremstilling av rene plasmamembranvesiklene krever en stor mengde av vev mucosa. Andre metoder, slik som radiographic visualisering av 3 H-5-HT-opptakssetene, har også vært vist tidligere i marsvin og rotte tynntarmen 7.
Den Ussing kammer gir et mer fysiologisk system for å måle transport av ioner, næringsstoffer, medikamenter og på tvers av ulike epitelvev. Den største fordelen med den Ussing kammer teknikken er at den muliggjør nøyaktig måling av de elektriske og transportparameterne i intakte, polarisert tarmepitelet. Videre, for å minimalisere påvirkning av den iboende nevromuskulære system, kan seromuskulære stripping av tarmslimhinnen bli utført for å undersøke regulering av transportører i epitelet 8.
Vi viser at Caco-2 celler dyrket i 3D på geléaktig protein danner en hul lumen uttrykke tydelige apikale og basolaterale markører. Disse cellene viser høyere uttrykk av Sert enn 2D Caco-2 celler. Fremgangsmåter for å dyrke 3D-celler og for å perform farging eller RNA og proteinutvinning er beskrevet. I tillegg, beskriver vi metoder for å studere SERT funksjon og regulering av TGF-β1, en pleiotropisk cytokin, i tynntarmslimhinne ved bruk av en Ussing kammer teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utredning av Intestinal transportører i en 3D Kultur System of Caco-2: Økende 3D Caco-2 cellekultur på en Gelatinous proteinblanding
- Tine-vekstfaktor redusert gelatinøse proteinblandingen på is i 8 timer (eller O / N) ved 4 ° C. Tint, lage 1 ml eller 500 ul porsjoner for bruk eller oppbevar ved -20 ° C for senere bruk.
- På dagen for kultur, kjøle kulturplater (for RNA og protein utvinning) eller kamret lysbilder (for farging) på isen. Tilsett 30 mL av geléaktige proteinblanding til hver brønn av en åtte-brønn kammer-objektglass (eller 120 ul per brønn i en 6-brønn plate) og fordeles jevnt. Pass på å ikke generere luftbobler under prosessen.
- Plasser lysbilder / platene inne i en cellekulturinkubator ved 37 ° C 15 - 30 minutter og lar den geléaktige proteinblandingen å stivne.
- Mens den geléaktige proteinblandingen stivner, trypsineres en konfluent kolbe Caco-2 celler.
- Tell antallav celler og spinne dem ved 500 xg i en bordsentrifuge i 5 minutter. Re-suspendere cellepelleten i 3D Caco-2 Medium behov.
- Seed glasskammer presentasjoner på 4000 celler per brønn (for plater, 20.000 per brønn). La cellene vokse i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 ° C. Endre medium hver 3-4 d.
2. immunfluorescens farging for epithelial Vogner i 3D Caco-2 celler: Dag 1
- Aspirere mediet og fikser cellene med 400 ul av 2% paraformaldehyd (PFA) (i PBS med pH justert til 8,5 med NaOH) i 30 minutter ved RT.
MERK: PFA Løsningen bør ikke lagres i mer enn en uke ved 4 ° C, og nylaget løsning kan brukes. FORSIKTIG: PFA er svært giftig og en potensiell kreftfremkallende. Alltid håndtere det med forsiktighet i en kjemisk hette og bruke personlig verneutstyr. - Skyll brønnene to ganger med 1 x PBS og lagres skinnene ved 4 ° C i PBS (400 pl /vi vil). Når faste, lagre dem ved 4 ° C i opp til en uke.
- Varm kammer lysbilder til RT (dette vil herde den geléaktige proteinblanding seng og gjør det enkelt å aspirere under vasketrinnene).
- Permeabilisere cellene med 0,5% Triton i PBS i ikke lenger enn 15 min.
- Fremstille PBS-glycin-buffer (130 mM NaCl, 7 mM Na HPO 2 til 4, 3,5 mM NaH 2PO 4, og 100 mM Glycine). Skyll 3x med 1 x PBS-glycin i 10 minutter hver ved RT.
- Forbered immunfluorescens buffer (IF): 130 mM NaCl, 7 mM Na2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2PO 4, 100 mM glycin, 7,7 mM NaN3, 0,1% BSA, 0,2% TritonX-100 og 0,05% Tween-20 .
- Vask 3x i IF buffer i 10 minutter hver på RT. Blokk i 5% normalt geiteserum (NGS) i IF buffer. Inkuber med primært antistoff fortynnet i IF + 1% geiteserum, 200 ul / brønn, i 1 - 2 h ved RT. Vask med IF buffer 3x i 10 minutter hver.
- Inkuber med sekundær antilegeme (1: 200) fortynnet i IF + 1% NGS, 200 ul / brønn, i 1 time ved RT.
- Vask med IF buffer tre ganger i 10 minutter hver. Hold lysbilder i mørket fra dette trinnet på. Løft plastkamre fra glassplater ved å plassere kammeret lysbildet i en svart holder og skyve en hvit løfter gjennom holderen til sine kant kontakt med kanten av brønnene. Dra forsiktig opp kamrene (holderen og løfteren bør komme med kultur lysbilder).
- Monter med langsom anti-fade medium og la det tørke i 10 min ved RT.
- Når tørket helt, forsegle lysbilder med neglelakk og bilde dem med konfokalmikroskopi. Oppbevar glassene ved 4 ° C i to uker eller ved -20 ° C i flere måneder.
3. RNA og protein utvinning fra 3D Caco-2 celler
- Behandle cellene dyrkes på gelatinøse proteinblandingen i 12 - 14 d med et testmiddel, slik som TGF-β1 (10 ng / ml, 1 h).
- Etter behandling, vaske cellene med enx PBS. Holde cellene på is i 30 minutter for å flytendegjøre den geléaktige proteinblandingen.
- Vask brønnene med avkjølt PBS og samle cellene i enkelte sentrifugerør. Samle cellene ved hjelp av sentrifugering ved lav hastighet ved 500 x g og 4 ° C i 10 min. Ekstrahere RNA ved anvendelse av standardprosedyrer og bruke sanntids RT-PCR.
- For proteinet ekstraksjon, lysere cellene ved hjelp av 1x cellelyseringsbuffer supplert med 1x protease inhibitor cocktail. Etter tilsetning av cellelyseringsbuffer til pelleten, lysere cellene ved ultralydbehandling og fjerne celleavfall ved sentrifugering ved 7500 xg og 4 ° C i 10 min.
4. Måling av 5-HT-opptak i Mouse ileum Utnytte en Ussing Chamber: Tarm Forberedelse og seromuskulære Stripping
- Etter dødshjelp, dissekere musene og fjerne tynntarmen (etter magen og før cecum). Fordel tynntarmen inn i tre deler. Kast midten tredje, bruker den proksimale tredjesom jejunum, og bruke den distale tredjedel så ileum. Unngå å trekke tarmen fra sin mesenteric vedlegg for å hindre skade på epitel. Hold vev seksjon kulden ved å dekke den med iskald Krebs-Ringer bikarbonat (KBR) buffer.
- Åpne tarmen lengderetningen ved hjelp av saks. Inkuber friskt uttatt tarmavsnitt i iskald, gassing KBR inneholdende 1 uM indometacin i 10 minutter før den seromuskulære stripping.
- Pin tarmdelen (~ 1 cm i lengde) slimhinnesiden ned til en plate inneholdende 7% agarose eller herdet silikon-elastomer (0,5 cm tykk).
- Strip seromuskulære lag under en disseksjon stereomikroskop med bunnen belysning. Skjær seromuskulære laget ved hjelp av en fjær skalpell blad. Bruk fin pinsett for å oppnå den kant av laget langs lengdeaksen av tarmen.
MERK: Under stripping prosedyren, bunnen belysning av stereo bidrar til å identifisere og unngå områder med Peyer sin lappes. - Etter fullførelse av seromuskulære stripping, montere mucosa forsiktig på pinnene av en halv Ussing-kammer. Under hele prosessen, ta vare å holde strippet slimhinnevevet i kantene for å unngå å rive det.
5. Ekvilibrering og Tissue Treatment
- Fremstille Krebs-løsning: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 2,4 mM K 2 HPO 4, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, og 0,4 mM KH 2PO 4 ved pH 7,4, gasset med 95% O2 / 5% CO 2 ved 37 ° C. Legg 10 mM glukose til den serøse badet for å tjene som et energisubstrat og 10 mM mannitol til slimhinne badet for å opprettholde det osmotiske balanse.
MERK: Krebs oppløsning supplert med L-askorbinsyre (100 uM) og pargylin (100 uM, monoaminoksidase-inhibitor) for å forhindre intracellulære 5-HT degradering. - Sett skyveren inn i kammeret for å utsette både den apikale (luminal) side og den basolateral (serosale) siden av vev til Krebs-løsning.
- Etter en ekvilibreringsperiode på 10 min, forbehandle ileal vev med fluoxetin (10 uM) i 30 minutter på den apikale side for J ms (mucosal-til-serøse flux).
- Behandle vevet med TGF-β1 (10 ng / ml) i 1 time på basolateral side og deretter inkuberes det med 3 [H] -5-HT (20 nM) i 30 minutter på den apikale side.
6. Kvantifisering av slimhinner i serøse Flux (J ms) og 3 [H] -5-HT Opphopning i Tissue
- Samle 0,75 ml alikvoter fra den serosale reservoaret (totalt 5 ml) for å måle radioaktiviteten i en væskescintillasjonsteller for å beregne og slimhinne-til-serøse (J ms) flukshastigheter; fluoksetin følsomme flux representerer Sert-mediert 3 [H] -5-HT opptak.
- For å unngå hydrostatiske trykkforskjeller over slimhinnen under en forandring periode, ta prøver fra serøse side og replassere dem med identiske volumer av bad medium.
MERK: fluks Beregningen korrigerer for fortynningen av ende prøven (4,25 ml / 5 ml = 0,85). - For kvantifisering av 3 [H] -5-HT akkumulert i vevet, demontere slimhinnen fra glidebryteren, vaske den en gang med iskald KRB buffer, og legg den i glass kultur rør.
- Inkuber i slimhinnene i 0,5 ml 10% KOH over natten ved 37 ° C. Måle radioaktiviteten i 150 ul aliquoter av lysatene (i tre paralleller) ved anvendelse av en væskescintillasjonsteller.
- Det benyttes aliquotdeler (3 - 5 mL) av lysatene for å måle proteinkonsentrasjon ved hjelp av Bradford-metoden.
MERK: 10 ml inkubasjonsmedium inneholdende radioaktivt serotonin blir brukt som en standard. 5-HT beholdes i vevet er uttrykt som pmol / mg protein / min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunfarging i 3D Caco-2 cyster er vist i figur 1. Et representativt bilde av et XY-plan som viser godt avgrensede hulrom i 3D-cyst farget med phalloidin aktin er vist i figur 1A. Den siden som vender mot hulrommet betegner den apikale side. Epitelceller dyrket i et 3D-miljø resultat i en robust epitelial fenotype. Ulike Caco-2 cyster på dag 12, da aktin og Sert var co-farget, er vist i figur 1B. I denne representasjon av en XY-planet (forskjellig fra planet vist på figur 1 A), er SERT flekker synlig, hovedsakelig i luminal membran, sammen med sub-apikal farging. Figur 2 viser at Sert proteinnivået er høyere i 3D-cyster i forhold til Caco-2 celler dyrket som monolag på 12 th dagen postplating. Disse dataene tyder på at 3D-kulturen i Caco-2 celler kan utløse signale hendelser som etterligner native epitel og resultere i økt Sert uttrykk. Figur 3A viser den generelle oversikt og drift av et Ussing kammer system og viser det monterte tynntarmen i pluggene til åpning. Denne teknikken gjør det mulig for evalueringen av aktiviteten av epitel-transportører i det native tarmen. Fordelen med den Ussing kammer tilnærmingen er muligheten til å vurdere funksjon av transportører uttrykt i luminal (mucosa) eller basolateral (serøse) side. Figur 4 demonstrerer øket 5-HT J ms fluks (A) og øker 5-HT-akkumulering i ileal slimhinnen (B) som reaksjon på TGF-β. Siden TGF-β1 øket bevegelsen av radioaktivt merket 5-HT fra slimhinne til serosale side, som vist ved J ms Disse data er en indikasjon på en økning i 5-HT-opptak fra den luminale membranen av ileale epitelceller. Det er videre tydelig av en økning i akkumuleringen av radioaktivt merket 5-HT i cellen, hvilkenvar sensitive for hemning av fluoksetin, som gjenspeiler aktiviteten av SERT uttrykt på den luminale membranen.
Figur 1: Caco-2 Grown på en Gelatinous proteinblanding på 12 d Viser Tydelig Lumen. Red: aktin. For farging av Caco-2 cyster dyrket i 3D, ble cellene dyrket i et 8-brønns kammer lysbilde og farget med phalloidin (A), som tidligere beskrevet av Debnath et al. 9. For farging 3D Caco-2-kultur (B), ble cyster fiksert i 2% PFA i 30 minutter, behandlet med PBS-glycin, og permeabilisert med 0,5% Triton-X-100 i 15 min ved RT. Etter blokkering, ble cystene inkubert i SERT antistoff (1: 100) over natten ved 4 ° C. De ble så vasket og inkubert med fluorescens-konjugert sekundært antistoff (1: 200) og phalloidin (1: 200)i 45 minutter ved RT. Til slutt, de ble montert i antifade inneholder DAPI. Bilder ble tatt med et konfokal mikroskop. Skala: 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sert Protein Expression i Caco-2 celler dyrket i 2D og 3D. Lysater fra Caco-2-celler dyrket på en kunststoffbærer og Caco-2 3D-sfærer ble løst ved hjelp av SDS-PAGE blottet på nitrocellulosemembraner og analysert med SERT antistoff og GAPDH. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Figur 3: (A) Ussing kammer og "glideren" med pinnene og åpning som viser en montert mus tynntarmen. Slider blenderåpning areal = 0,30 cm 2. Glideren passer inn i de to halvdelene av Ussing kammer, som er romoppdelt. Elektriske parametere, slik som transepitelial spenningspotensial (V t), måles ved hjelp av et potensiometer, og elektroder (typisk kalomel-halv-celler eller Ag-AgCl er forbundet ved saltbroer til hvert kammer halvdel). Saltbroer er sammensatt av 3% agar smeltet i fysiologisk buffer (f.eks KBR) som brukes til bading slimhinnen for å unngå endringer i den ioniske sammensetning av oppløsningene. (B) Skjematisk av prinsippet om Ussing kammeret. Den strippede tarmslimhinnen ble montert i de to halvdeler av den Ussing kammer separering av de mucosale og serøse kamre. Radioaktiv tracer ble tilsatt til slimhinne side; opptaket ble målt som mengden radioaktivitet inkorporert ved vev, normalisert til det totale proteininnhold. Fluksen ble evaluert ved å måle radioaktiviteten i den serosale kammeret i løpet av en tidsperiode. Elektrodene som vises i skjematisk tillate samtidig overvåking av elektriske parametre, det inkludert strøm, spenning og motstand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Måling av Sert Funksjon i ileal Slimhinner Strippet av seromuskulære Layer. Ex vivo-effekter av korttids TGF-β1 behandling på SERT funksjon hos mus ileum, demonstreres gjennom måling av 3 [H] -5-HT gjenopptak og 3 [H] -5-HT-belegg ved å brukeUssing kammeret. TGF-β1 behandling (10 ng / ml, 1 time) på basolateral side betydelig økt SERT funksjon, som vist ved den økte Na + -sensitive mucosal-til-serøse fluks (J ms) (A) og 3 [H] - 5-HT gjenopptak (B). Fluoksetin behandling av ileal vev inhiberte TGF-β1-stimulert 5-HT-opptak. Fluoksetin-sensitive opptaket ble øket 2,5 ganger etter TGF-β1 sammenlignet med kontrollen. Resultatene er representert som gjennomsnittet SEM. En en-veis ANOVA Tukey s Test ble anvendt for statistisk analyse. Beregning av J ms flux: [(CPM e - CPM er) x fortynningsfaktoren] / [(. V std x kons av underlaget) CPM std / xtxa]. CPM e: tellinger pr min ved slutten av fluksen måling; CPM s: tellinger pr min ved starten av fluksen måling; CPM std: tellinger pr min av standard (tatt fra slimhinne reservoar); V std: volum of CPM std; t: tid av forandring i h; a: område av åpningen (0,3 cm2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fullt differensierte Caco-2-cellemonolagene har blitt brukt i stor utstrekning som polarisert epitel-monolag å studere intestinal transport 10, 11, 12, 13, 14, 15. Imidlertid, for å etterligne fysiologiske organiseringen av intestinale epitelceller, har det vært stor interesse for utvikling av en Caco-2-kultur i 3D. En rekke av 3D-cellekultur-modeller for intestinale epitelceller har nylig blitt utviklet som etterligner naturlig celle-celle og celle-ekstracellulære matriks (ECM) interaksjoner med større fysiologiske relevans enn 2D-systemer 16. Således er ECM-baserte naturlige hydrogeler inneholdende felleskomponenter (for eksempel laminin, kollagen IV, og heparin-sulfat proteoglykaner) utstrekning brukes for generering av 3D-cellekulturer 16.
Protokollen er beskrevet her demonstrerer egnetheten av 3D Caco-2-celler dyrket i gelatinøse proteinblanding (en ECM-baserte naturlig hydrogel ekstrahert fra Engelbreth-Holm-sverm (EHS) musetumorer) for epiteliale transport forskning. Innen 10 dager, cellene begynner å danne en hul hulrom omgitt av et lag av celler og viser polaritet, med distinkte apikale og basolaterale domener. Celletettheten ved tiden for poding på en geléproteinblanding er kritisk for dannelsen av vanlige cyster med sentrale lumen. For flekker eksperimenter, har vi lagt 4000 celler / brønn av en 8-kammer lysbilde (vel overflateareal: 0,7 cm 2). Seeding cellene på et høyere resultat tetthet i uregelmessige kuler. De 3D Caco-2 cyster på 10 - 12 dager viser polaritet og mer differensiering enn 2D Caco-2 celler dyrket på transwells 17 (upubliserte observasjoner). Vi har vist en markant økning i uttrykket av Sert mRNA og proteinnivåer som kompared å fullt differensierte 2D monolag. Også anvendelse av disse fremgangsmåter, har vi vist at TGF-TGF-β1 øker overflate nivåene av SERT, slik som vist ved immunofluorescens farging 15.
Interessant nok har nylige studier vist at 3D Caco-2-celler er mer mottakelig for patofysiologiske stimuli på grunn av tilstedeværelsen av kritiske signalkomponenter, så som TNF-reseptor 2 og MyD88, og representerer en bedre modell enn det konvensjonelle system 2D 17. Imidlertid ett problem som begrenser bruken av 3D Caco-2 i epithelial transport forskning er mangelen på de forskjellige celletyper og kompleksiteten som finnes i det native tarmen. I denne forbindelse, tarm organoids (også kjent som enteroids / colonoids) av human eller mus opprinnelse representerer en state-of-the-art-modellen inneholder alle ulike celletyper innfødte epitel å studere transport av ioner, næringsstoffer eller narkotika. I forhold til organoids, godtdifferensiert 3D Caco-2 cyster representerer en type epitelceller (dvs. absorberende enterocytter) og er absolutt egnet for studier som fokuserer på de cellulære og molekylære mekanismer som styrer tarm transportører. Dette skyldes at 3D Caco-2-celler er praktiske å håndtere, er kostnadseffektive, og er lette å manipulere, slik som for transfeksjoner av plasmid-DNA og sirnas. En annen begrensning av 3D Caco-2-celler i epithelial transport forskning er vanskeligheten med å få tilgang til lumen. Agenter som binder seg til luminal membranreseptorer eller til smittestoffer som har tilgang til epitel fra luminal side kan være utfordrende å studere i dette systemet. Denne begrensning kan overvinnes ved microinjecting agentene i lumen, som har vært gjort tidligere i tilfeller av human tarm organoid kultur for C. difficile-infeksjon 18. Det er imidlertid viktig at studier ved in vitro cellekultur modeller blir validert i det native jegntestine bruker in vivo eller ex vivo tilnærminger.
I løpet av de siste tiårene, har Ussing kammeret bidro sterkt til anerkjennelse av de funksjonelle eller regulatoriske egenskaper av mange epiteliale transportører 19. Her viser vi egnethet Ussing kammer tilnærming til måling av 5-HT fluks og 5-HT-opptak i mus tarmslimhinnen blottet for seromuskulære sjiktet 15. TGF-β1 behandling av ileal mucosa på basolateral side (10 ng / ml, 1 time) en signifikant økning SERT funksjon, som vist ved øket Na + -sensitive mucosal-til-serøse fluks (J ms) og 3H-5- HT opptak. Fluoksetin behandling av ileal vev inhiberte TGF-β1-mediert stimulering av 5-HT-opptak.
Kritiske trinn av denne teknikken omfatter montering av vev på sleiden åpning som en intakt lag (uten sprekker) for å achie ve nøyaktige målinger. Passende kirurgiske verktøy, for eksempel kule saks, tynn-tip pinsett og fjær kirurgiske kniver, er viktig for riktig håndtering og stripping av vev.
Denne metoden er aktuelt å studere funksjonen til andre epiteliale transportører, for eksempel elektrolytt transportører (klorid transportører, Na + / H + lere, nærings transportører, etc.). Spesialiserte anvendelser av Ussing kammer-som for eksempel pH-stat-teknikken, for å måle transepitelial bikarbonat sekresjon, og den isotopiske fluks-metoden, for å måle netto sekresjon eller absorpsjon av substrater-er gjennomgått omfattende av Dr. Clarke et al. 8. De omfattende anmeldt anvendelsen av Ussing-kammere til studiet av næringsstoff transport 19. Mini Ussing-kammere har også blitt brukt i klinisk relevante situasjoner, for eksempel for å måle transportfunksjon i biopsiprøverref "> 20. Den store fordelen med den Ussing kammer teknikk den vrengte sac fremgangsmåte er evnen til å samtidig måle de elektriske og transportparameterne i intakte, polarisert tarmepitelet.
En bekymring med Ussing kammer fremgangsmåten er den begrensede levedyktigheten og optimal funksjon av en ex vivo intestinal preparat. Etter fjerning fra dyr, kan den ex vivo tarm forberedelse bare vare i opp til 3 timer i et Ussing kammer 19. Dermed kan denne metoden har begrensninger i å teste effekten av midler for lengre tidsperioder. I slike tilfeller kan behandlingen utføres in vivo, og deretter isoleres tarmene fra kontroll- og behandlingsgrupper kan anvendes for å måle transportparameterne med den Ussing-metoden. I alle tilfeller, kan størrelsen av G t (eller R t) være en sanntids-indikator for levedyktighet og kan være nyttig for å skille mellom despesifikke og uspesifikke effekter av testede reagenser.
Oppsummert kan metodene beskrevet her forenkle vår forståelse av cellulære og molekylære mekanismer som styrer funksjon og regulering av epitel transportører hos friske og syke forhold, for eksempel tarmbetennelse, smittsom diaré, malabsorpsjon, eller metabolske forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O.
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
