Summary
Nós descrevemos métodos simples para o estudo da regulação da função intestinal transportador de serotonina (SERT) e de expressão, utilizando um modelo in vitro de células de cultura de células Caco-2 cultivadas em 3D e um modelo ex vivo de intestino de rato. Estes métodos são aplicáveis para o estudo de outros transportadores epiteliais.
Abstract
O epitélio intestinal tem importantes funções de transporte e de barreira que desempenham um papel-chave nas funções fisiológicas normais do corpo, proporcionando uma barreira para partículas estranhas. transporte epitelial prejudicada (íon, nutrientes, ou drogas) tem sido associada a muitas doenças e pode ter consequências que ultrapassam as funções fisiológicas normais dos transportadores, como por influenciar a integridade do epitélio e o microbioma intestinal. Compreendendo a função e a regulação das proteínas de transporte é crítico para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. O maior desafio no estudo do transporte epitelial é o desenvolvimento de um sistema modelo adequado que recapitula características importantes das células epiteliais intestinais nativas. Vários modelos in vitro de cultura de células, tais como células Caco-2, T-84, e células HT-29-Cl.19A são normalmente utilizados em pesquisa de transporte epitelial. Estas linhas celulares representam uma abordagem reducionista para modelar o epithelium e têm sido utilizados em vários estudos mecanicistas, incluindo o seu exame de interacções epiteliais-microbiana. No entanto, as monocamadas de células não reflectem com precisão as interacções célula-célula e o microambiente in vivo. As células cultivadas em 3D mostraram-se promissores modelos para estudos de permeabilidade de drogas. Mostra-se que as células Caco-2 em 3D podem ser utilizados para estudar os transportadores epiteliais. É também importante que os estudos em células Caco-2 são complementados com outros modelos para excluir efeitos específicos de células e para ter em conta a complexidade do intestino nativo. Vários métodos têm sido anteriormente utilizados para avaliar a funcionalidade de transportadores, como o saco evertido e absorção nas células epiteliais isolados ou em vesículas da membrana do plasma isoladas. Levando em consideração os desafios no campo com respeito a modelos ea medição da função de transporte, demonstramos aqui um protocolo para crescer células Caco-2 em 3D e descrevem o uso de uma câmara Ussing como umabordagem eficaz para medir o transporte da serotonina, como no epitélio intestinal polarizadas intactas.
Introduction
O epitélio intestinal é equipado com várias proteínas de transporte (canais, ATPases, co-transportadores e trocadores) que realizam numerosas funções que vão desde a absorção de nutrientes, electrólitos, e medicamentos para a secreção de fluido e de iões no lúmen. proteínas de transporte gerar gradientes electroquímicos que permitem o movimento de iões ou moléculas de um modo vectorial. Isto é conseguido por as distribuições assimétricas de os sistemas de transporte nas membranas basolaterais e apicais de células epiteliais polarizadas. Além disso, as junções apertadas, que amarrar as células epiteliais adjacentes, desempenham um papel importante neste processo, servindo como uma barreira para a difusão dos componentes intramembranar entre os domínios de membrana apical e basolateral. Sistemas modelo adequado que mimetizam estas características do intestino nativo (isto é, a polaridade, a diferenciação e a integridade junção estanque) são críticos para o estudo da functionalidade de sistemas de transporte epiteliais.
No que diz respeito aos modelos, as linhas celulares típicas actualmente utilizadas na pesquisa de transporte epitelial intestinal Caco-2 são, de um modelo completamente diferenciado, absorventes de células epiteliais do intestino delgado; e células T84 ou HT-29 subclones, modelos de grandes células epiteliais intestinais derivado 1-crypt. Convencionalmente, estas linhas de células são crescidas como monocamadas em superfícies de plástico ou em inserções Transwell revestidas. Trans poços de cultura de células inserções em certa medida, assemelhar-se ao ambiente in vivo, permitindo que as células polarizadas para alimentar basolateralmente. No entanto, uma limitação dos sistemas de cultura 2D convencionais é que as células são forçadas a se adaptar a uma superfície artificial, plana e rígida. Assim, a complexidade fisiológica do epitélio nativa não é reflectida de forma adequada num sistema 2D. Esta limitação foi superada através de métodos de cultivar células em 3D em um microambiente específico, como MIXTUR proteína gelatinosaE, contendo uma variedade de componentes da matriz extracelular 2, 3. No entanto, as culturas in vitro não pode simular a complexidade do epitélio intestinal, o que tem vários tipos de células e a arquitectura específica da região no intestino. Assim, os estudos utilizando modelos de cultura celular exigir uma validação adicional no intestino nativo. Utilizando a cultura de células in vitro 3D e da mucosa intestinal do rato, que descrevem aqui métodos simples para estudar a regulação do transportador de serotonina intestinal (SLC6A4, SERT).
O transportador SERT regula a disponibilidade extracelular de uma hormona importante neurotransmissor e, 5-hidroxitriptamina (5-HT), transportando-o através de uma rápida Na + / Cl - dependente de processo. SERT é um alvo conhecido dos anti-depressivos e surgiu recentemente como um novo alvo terapêutico de distúrbios gastrointestinais, como diarréia e inflamação intestinal.Métodos para investigar absorção de 5-HT, em células epiteliais intestinais foram anteriormente descritos. Por exemplo, Caco-2 células cultivadas em suportes de plástico ou inserções permeáveis têm mostrado exibir absorção 3 H-5-HT fluoxetina e minúsculas em ambos os domínios basolaterais e apicais 4. A medida da função SERT em escova isolado beira da Membrana As vesículas (BBMVs) preparado a partir de doadores de órgãos humanos intestino delgado, também foi descrita por 5 nós. 3 absorção de H-5-HT em BBVMs humanos mostrou-se fluoxetina-sensível e Na + / Cl - dependente, e exibiu uma cinética de saturação com um K m de 300 nM 5. Utilizando métodos semelhantes, também medido anteriormente função de SERT como 3 absorção de H-5-HT no rato BBMVs intestinais 6. No entanto, a preparação de vesículas de membrana de plasma puro requer uma grande quantidade de tecido de mucosa. Outros métodos, tais como o radiographic visualização de locais de recaptação 3 H-5-HT, têm também sido mostrado anteriormente na cobaia e de ratazana intestino delgado 7.
A câmara Ussing proporciona um sistema mais fisiológico para medir o transporte de iões, nutrientes, e medicamentos através de vários tecidos epiteliais. A principal vantagem da técnica de câmara Ussing é que ele permite a medição precisa dos parâmetros eléctricos e de transporte de intacta, epitélio intestinal polarizada. Além disso, para minimizar a influência do sistema neuromuscular intrínseca, de decapagem seromuscular da mucosa intestinal pode ser realizada para investigar a regulação dos transportadores no epitélio 8.
Nós demonstramos que as células Caco-2 cultivadas em 3D na proteína gelatinosa formar um lúmen oco que expressam marcadores apical e basolateral distintas. Estas células apresentam maior expressão de SERT do que as células Caco-2 2D. Métodos para cultivar células em 3D e perform imunocoloração ou extração de RNA e de proteínas são descritos. Além disso, descrevemos métodos para estudar a função SERT e regulação dos TGF-β1, uma citocina pleiotropic, na mucosa do intestino delgado, utilizando uma técnica de câmara de Ussing.
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Protocol
1. Estudo de intestinal transportador num sistema de cultura 3D de Caco-2: Cultivo Cultura de Células Caco-2 3D sobre uma mistura de proteína gelatinoso
- factor de crescimento reduzida Descongelar mistura gelatinosa proteína em gelo durante 8 h (ou O / N) a 4 ° C. Uma vez descongelada, fazer 1 mL ou 500 mL alíquotas para uso ou armazenar a -20 ° C para uso posterior.
- No dia da cultura, as placas de cultura pré-resfriamento (para extracção de ARN e proteína) ou lâminas de câmaras (por imunocoloração) em gelo. Adicionar 30 uL de mistura de proteína gelatinosa a cada poço de uma corrediça de vidro compartimentado oito poços (ou 120 uL por poço de uma placa de 6 poços) e espalhar uniformemente. Tome cuidado para não gerar bolhas de ar durante o processo.
- Colocar as lâminas / placas dentro de uma incubadora de cultura de células a 37 ° C durante 15-30 min e permitir que a mistura de proteína gelatinoso para solidificar.
- Enquanto a mistura de proteínas é gelatinoso solidificando, trypsinize um frasco confluente de células Caco-2.
- Contar o númerode células e colocá-los a 500 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. Re-suspender o sedimento de células em 3D Caco-2 médio, conforme necessário.
- Semear as lâminas de câmara de vidro e 4.000 células por poço (para placas, 20.000 por poço). Permitir que as células a crescer numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C. Alterar médio a cada 3 - 4 d.
2. Imunofluorescência coloração para epitelial Transportadores em 3D Caco-2 Cells: Dia 1
- Aspirar o meio e fixar as células com 400 uL de 2% de paraformaldeído (PFA) (em PBS com o pH ajustado para 8,5 com NaOH) durante 30 min à TA.
NOTA: solução PFA não devem ser armazenados durante mais de 1 semana a 4 ° C, e frescos solução pode ser utilizada. CUIDADO: PFA é altamente tóxico e potencialmente cancerígeno. Sempre lidar com isso com cuidado em uma capa química e uso de equipamentos de proteção individual. - Lavar as cavidades duas vezes com PBS 1x e armazenar as lâminas a 4 ° C em PBS (400 ul /bem). Uma vez fixo, armazená-los a 4 ° C durante até uma semana.
- Aquecer as lâminas de câmara para RT (isso vai endurecer a cama mistura de proteína gelatinosa e torná-lo fácil para aspirar durante as etapas de lavagem).
- Permeabilizar as células com 0,5% de Triton em PBS durante não mais do que 15 min.
- Preparar tampão PBS-glicina (130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de NaH 2 PO 4, e 100 mM de glicina). Lavar 3x com PBS 1x-glicina durante 10 minutos cada à temperatura ambiente.
- Preparar tampão de imunofluorescência (IF): 130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de NaH 2 PO 4, glicina 100 mM, NaN 7,7 3, 0,1% de BSA, 0,2% Triton X-100, e 0,05% de Tween-20 .
- Lavar 3x em tampão IF durante 10 minutos cada à temperatura ambiente. Bloco em 5% normal Goat Serum (NGS) em tampão IF. Incubar com anticorpo primário diluído em soro de cabra + 1% de SE, 200 uL / poço, durante 1 - 2 h à TA. Lave com tampão IF 3x durante 10 minutos cada um.
- Incube com anti secundáriocorpo (1: 200) diluída em SE + 1% de NGS, 200 uL / poço, durante 1 h, à RT.
- Lave com tampão IF três vezes durante 10 minutos cada. Mantenha os slides no escuro a partir deste passo. Levante as câmaras de plástico dos lâminas de vidro, colocando o slide câmara em um suporte preto e deslizando um levantador branca através do suporte até que seus contatos de borda a borda dos poços. Gentilmente puxar para cima as câmaras (o titular eo levantador deve vir com os slides de cultura).
- Montagem com meio anti-fade lento e deixe-a secar por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Uma vez completamente seco, selar as lâminas com unha polonês e imagem-los com a microscopia confocal. Armazenar as lâminas a 4 ° C durante duas semanas ou a -20 ° C durante vários meses.
3. RNA e extração de proteínas de 3D Caco-2 células
- Tratar as células cultivadas na mistura gelatinosa proteína de 12 - 14 d, com um agente de teste, tais como TGF- β1 (10 ng / mL, 1 h).
- Após o tratamento, lavar as células com umax PBS. Manter as células em gelo durante 30 min para se liquefazer a mistura de proteína gelatinosa.
- Lavar os poços com PBS gelada e recolher as células em tubos de centrífuga individuais. Recolher as células através de centrifugação a baixa velocidade a 500 xg e 4 ° C durante 10 min. Extrai-se a ARN utilizando procedimentos padrão e utilizar em tempo real de RT-PCR.
- Para a extracção de proteínas, a lise das células utilizando tampão de lise celular 1x suplementado com inibidor de protease 1x cocktail. Após a adição de tampão de lise de células para o sedimento, a lise das células por ultra-sons e remover os restos celulares por centrifugação a 7500 xg e 4 ° C durante 10 min.
4. Medição do 5-HT A captação do rato íleo Utilizando uma Câmara de Ussing: Preparação intestinal e seromuscular Decapagem
- Após a eutanásia, dissecar os ratos e remover o intestino delgado (após o estômago e antes do ceco). Dividir o intestino delgado em três partes. Descartar o terço médio, use o terço proximalcomo jejuno, e usar o terço distal como íleo. Evitar puxar o intestino a partir da sua ligação mesentérica para evitar danos ao epitélio. Manter o frio secção de tecido cobrindo-o com gelado bicarbonato de Krebs-Ringer tampão (KBR).
- Abra o intestino longitudinalmente com uma tesoura. Incubar secções intestinais recentemente excisadas em gelada, gaseamento KBR contendo 1 uM de indometacina durante 10 min antes da seromuscular decapagem.
- Pin a secção intestinal (~ 1 cm de comprimento) da mucosa voltada para baixo para uma placa contendo 7% de agarose ou de elastómero de silicone curado (0,5 cm de espessura).
- Tira as camadas seromuscular sob um microscópio estereoscópico de dissecação com iluminação de fundo. Cortar a camada seromuscular usando uma lâmina de bisturi pena. Utilize uma pinça fina para obter o bordo da camada ao longo do eixo longitudinal do intestino.
NOTA: Durante o processo de extracção, a iluminação de fundo do microscópio estereoscópico ajuda a identificar e evitar áreas com placa de Peyeres. - Após a conclusão da operação de stripping seromuscular, montar a mucosa cuidadosamente sobre os pinos de uma meia-câmara Ussing. Durante todo o processo, tome cuidado para segurar o tecido da mucosa despojado pelas bordas, para evitar que se rasgue.
5. A equilibração e o tratamento dos tecidos
- Preparar a solução de Kreb: NaCl 115 mM, NaHCO3 25, 2,4 mM de K 2 HPO 4, CaCl2 1,2, MgCl2 1,2, e 0,4 mM de KH 2 PO 4 a pH 7,4, gaseificado com 95% O2 / 5% CO 2 a 37 ° C. Adicionar 10 mM de glucose para o banho de seroso para servir como um substrato energético e manitol 10 mM ao banho mucoso para manter o equilíbrio osmótico.
Nota: A solução de Krebs é suplementada com ácido L-ascórbico (100 uM) e pargilina (100 uM, inibidor de monoamina-oxidase) para evitar a degradação intracelular de 5-HT. - Insira o controle deslizante para a câmara para expor tanto a si (luminal) apicale de o (seroso) lado basolateral do tecido a uma solução de Kreb.
- Após um período de equilibração de 10 min, o pré-tratamento do tecido do íleo com fluoxetina (10 uM) durante 30 min no lado apical para o MS de fluxo (J-a-mucosa da serosa).
- Tratar o tecido com TGF-β1 (10 ng / mL) durante 1 h no lado basolateral e depois incubar com 3 [H] -5-HT (20 nM) durante 30 min sobre o lado apical.
6. A quantificação da mucosa a serosa fluxo (J ms) e 3 [H] -5-HT acumulação no tecido
- Recolhe 0,75 mL alíquotas do reservatório seroso (total de 5 ml) para medir a radioactividade num contador de cintilação líquida e para calcular mucosa-a serosa (J ms) taxas de fluxo; sensíveis fluoxetina-flux representa SERT mediada por 3 a absorção de [H] -5-HT.
- Para evitar diferenças de pressão hidrostática através da mucosa durante um período de fluxo, recolher amostras do lado da serosa e recolocá-los com volumes iguais de meio de banho.
NOTA: O cálculo do fluxo corrige para a diluição final da amostra (4,25 ml / 5 ml = 0,85). - Para a quantificação de 3 [H] -5-HT acumulada no tecido, desmontar a mucosa do cursor, lavar uma vez com tampão KRB gelada, e colocá-lo em tubos de cultura de vidro.
- Incubar a mucosa em 0,5 mL de KOH a 10% durante a noite a 37 ° C. Medir a radioactividade em 150 ul de aliquotas dos lisados (em triplicado), utilizando um contador de cintilação líquida.
- Utilizar-se aliquotas (3-5 ul) dos lisados para medir a concentração de proteína utilizando o método de Bradford.
NOTA: 10 ml de meio de incubação contendo serotonina radioactivos é usada como um padrão. 5-HT retidos no tecido é expressa em pmol / mg de proteína / min.
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Representative Results
A imunocoloração em 3D Caco-2 cistos é mostrado na Figura 1. Uma imagem representativa de um plano XY mostrando lúmen bem demarcadas do cisto 3D coradas com faloidina actina é representado na Figura 1A. O lado voltado para o lúmen denota o lado apical. As células epiteliais de cultura em resultado ambiente 3D num fenótipo epitelial robusto. Diferentes células Caco-2 cistos no dia 12, quando a actina e SERT foram co-corados, são mostradas na Figura 1B. Nesta representação de um plano XY (diferente do plano mostrado na Figura 1A), a coloração é visível SERT, predominantemente na membrana luminal, juntamente com coloração sub-apical. A Figura 2 mostra que os níveis de proteína SERT são mais elevados em 3D quistos, em comparação com células Caco-2 cultivadas como monocamadas sobre o postplating dia 12 th. Estes dados sugerem que a cultura 3D de células Caco-2 podem desencadear eventos de sinalização que imitam nativa epitélios e resultar num aumento da expressão de SERT. A Figura 3A representa a visão geral e o funcionamento de um sistema de câmara Ussing e mostra o intestino delgado montado nos pinos da abertura. Esta técnica permite a avaliação da actividade de transportadores epiteliais no intestino nativo. A vantagem da abordagem câmara Ussing é a capacidade de avaliar a função dos transportadores expressas em luminal (mucosa) ou no lado basolateral (serosa). A Figura 4 demonstra um aumento de 5-HT J fluxo MS (A) e o aumento da acumulação de 5-HT na mucosa ileal (B) em resposta a TGF-β. Uma vez que o TGF-β1 aumentou a circulação de 5-HT marcado radioactivamente a partir da mucosa para o lado da serosa, tal como representado pelas ms J, estes dados são indicativos de um aumento na absorção de 5-HT a partir da membrana luminal das células epiteliais ileais. Isto é ainda mais evidente a partir de um aumento na acumulação de 5-HT marcado radioactivamente na célula, quefoi sensível à inibição por fluoxetina, que reflecte a actividade de SERT expresso na membrana luminal.
Figura 1: Caco-2 cultivadas em uma mistura de proteínas Gelatinous às 12 d Mostrando distinto Lumen. Vermelho: actina. Para a imunocoloração de Caco-2 cultivadas em 3D cistos, as células foram cultivadas em uma corrediça de 8 poços septadas e coradas com faloidina (A), tal como descrito anteriormente por Debnath et ai. 9. Para a imunocoloração da cultura 3D Caco-2 (B), os cistos foram fixadas em 2% de PFA durante 30 minutos, tratou-se com PBS-glicina, e permeabilizadas com 0,5% de Triton-X-100 durante 15 min à TA. Após o bloqueio, os cistos foram incubados em anticorpo SERT (1: 100) durante a noite a 4 ° C. Eles foram então lavadas e incubadas com anticorpos de fluorescência secundário conjugado (1: 200) e faloidina (1: 200)durante 45 min à TA. Finalmente, elas foram montadas em antifade contendo DAPI. As imagens foram capturadas usando um microscópio confocal. Barra de escala: 20 ^ m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão de Proteínas de SERT em Caco-2 células cultivadas em 2D e 3D. Os lisados de células Caco-2 cultivadas sobre um suporte de plástico e Caco-2 3D esferas foram resolvidas por SDS-PAGE, transferidas para membranas de nitrocelulose e analisadas com o anticorpo SERT e GAPDH. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
![Figura 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Figura 3: (A) A câmara Ussing e "barra" com os pinos e a abertura que apresentam um pequeno intestino de rato montado. Área de abertura deslizante = 0,30 cm2. O deslizante se encaixa nas duas metades da câmara de Ussing, que são compartimentados. Os parâmetros eléctricos, tais como o potencial de tensão transepitelial (Vt), é medido por um potenciómetro e eléctrodos de calomelano (tipicamente meias-células Ag-AgCl ou são ligadas por pontes de sal para cada meia câmara). Pontes salinas são compostas por 3% de agar derretido em tampão fisiológico (por exemplo, KBR) utilizado para o banho da mucosa para evitar alterações na composição iónica das soluções. (B) Esquema do princípio da câmara Ussing. A mucosa intestinal foi despojado montado nas duas metades da câmara Ussing que separa as câmaras das mucosas e serosas. marcador radioactivo foi adicionada à SID mucosae; a absorção foi medida como a quantidade de radioactividade incorporada pelo tecido, normalizados para o teor total de proteína. O fluxo foi avaliada através da medição da radioactividade na câmara seroso durante um período de tempo. Os eléctrodos apresentados no esquema permitir o monitoramento simultâneo de parâmetros elétricos, a incluindo a corrente, voltagem e resistência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Medição da Função SERT em ileal Mucosa Despojado de seromuscular. Efeitos ex vivo de tratamento TGF-β1 de curto prazo sobre a função SERT no íleo de rato, demonstrada através da medição de 3 [H] captação -5-HT e 3 [H] -5-HT fluxos usando oUssing câmara. Tratamento de TGF-β1 (10 ng / mL, 1 h) no lado basolateral aumentou significativamente a função SERT, como evidenciado pelo aumento do fluxo de Na + sensível a (J ms) (A) e da mucosa serosa-a-3 [H] - absorção de 5-HT (B). A fluoxetina tratamento do tecido do íleo inibiu a absorção de 5-HT TGF-estimularam-β1. captação sensível a fluoxetina foi aumentada de 2,5 vezes pelo TGF-β1 em comparação com o controlo. Os resultados estão representados como a média SEM. Teste de um one-way ANOVA de Tukey foi utilizado para a análise estatística. Cálculo da J fluxo ms: [(CPM e - CPM s) x fator de diluição] / [(V. Std x conc de substrato) CPM DST / xtxa]. CPM E: contagens por min no fim da medição de fluxo; CPM s: contagens por min, no início do fluxo de medição; CPM std: contagens por min da norma (retirado do reservatório da mucosa); V std: o volume de of o std CPM; t: tempo de fluxo no h; A: área da abertura (0,3 cm2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As monocamadas de células Caco-2 completamente diferenciadas foram utilizados extensivamente como monocamadas epiteliais polarizadas para estudar o transporte intestinal 10, 11, 12, 13, 14, 15. No entanto, para imitar a organização fisiológico das células epiteliais intestinais, tem havido um interesse considerável no desenvolvimento de uma cultura Caco-2 em 3D. Um certo número de modelos de cultura de células em 3D para células epiteliais intestinais têm sido desenvolvidos recentemente que imitam matriz célula-célula e célula-extracelular nativa (ECM) interacções com maior relevância fisiológica do que os sistemas 2D 16. Assim, os hidrogéis naturais à base de ECM contendo componentes comuns (tais como laminina, colagénio IV, e proteoglicano sulfato de heparina) são amplamente utilizados para a geração de culturas de células 1 3D6.
O protocolo aqui descrito demonstra a adequação de 2 Caco-células cultivadas em 3D mistura de proteína gelatinosa (um hidrogel naturais à base de ECM extraído de tumores de ratos Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)) para a investigação de transporte epitelial. Dentro de 10 dias, as células começam a formar um lúmen oco rodeado por uma camada de células e mostra a polaridade, com domínios basolaterais e apicais distintas. A densidade celular na altura da sementeira com uma mistura de proteína gelatinosa é crítico para a formação de cistos regulares com lúmen central. Para experiências de coloração, nós adicionamos 4.000 células / poço de uma corrediça (área de superfície bem: 2 0,7 cm) 8 câmaras. Semeando células em maior resultados de densidade em esferas irregulares. Os 3D Caco-2 cistos em 10 - 12 dias, demonstram uma polaridade mais e diferenciação de células Caco-2 cultivadas em 2D 17 transwells (observações não publicadas). Nós mostramos um aumento marcado na expressão de ARNm de SERT e os níveis de proteína que compared de monocamadas 2D totalmente diferenciadas. Além disso, utilizando estes métodos, têm mostrado que o TGF-TGF-β1 aumenta os níveis superficiais de SERT, como mostrado por coloração de imunofluorescência 15.
Interessantemente, os estudos recentes têm demonstrado que as células Caco-2 3D são mais sensíveis a estímulos fisiopatológicos por causa da presença de componentes de sinalização críticos, tais como o receptor de TNF 2 e MyD88, e representam um modelo melhor do que o sistema convencional 2D 17. No entanto, um problema que limita o uso de 3D Caco-2 em investigação transporte epitelial é a falta dos diferentes tipos de células e a complexidade que são encontradas no intestino nativo. A este respeito, Organóides intestinais (também conhecidos como enteroids / colonoids) de origem humana ou de rato representam um modelo de estado-da-arte, contendo todos os tipos de células diferentes de epitélio nativo para o estudo do transporte de iões, nutrientes ou medicamentos. Em comparação com Organóides, bemdiferenciada 3D Caco-2 cistos representam um tipo de células epiteliais (ou seja, enterócitos de absorção) e são certamente adequado para estudos sobre os mecanismos celulares e moleculares que regulam transportadores intestinais. Isto é porque as células Caco-2 3D são convenientes de manusear, são de custo-eficácia, e são fáceis de manipular, tais como, por transfecções de ADN plasmídico e ARNsi. Outra limitação das células 3D Caco-2 na pesquisa de transporte epitelial é a dificuldade no acesso ao lúmen. Os agentes que se ligam a receptores de membrana luminal ou a agentes infecciosos que acessam o epitélio do lado luminal pode ser um desafio para estudar neste sistema. Esta limitação pode ser superada por microinjecção os agentes no lúmen, como foi feito anteriormente, nos casos de cultura organ�de intestinal humano de infecções de C. difficile 18. É, no entanto, importante que estudos em modelos de cultura de células in vitro são validados no I nativantestine usando abordagens in vivo ou ex vivo.
Ao longo das últimas décadas, a câmara Ussing tem contribuído grandemente para o reconhecimento das propriedades funcionais ou regulamentares de muitos transportadores epiteliais 19. Aqui, mostramos a adequação da abordagem câmara Ussing para medir fluxo de 5-HT e 5-HT no rato mucosa intestinal sem a camada seromuscular 15. Tratamento de TGF-β1 da mucosa ileal no lado basolateral (10 ng / mL, 1 h) aumentou significativamente a função SERT, como evidenciado pelo aumento do Na + sensível a mucosa-a-serosa fluxo (J ms) e 3H-5- HT. A fluoxetina tratamento do tecido do íleo inibiu a estimulação de TGF-β1-mediada de absorção de 5-HT.
As etapas críticas desta técnica incluem a montagem do tecido na abertura deslizante como uma camada intacta (sem qualquer ruptura), a fim de Achie ve medições precisas. instrumentos cirúrgicos adequados, tais como tesouras, pinças bola fina de ponta porosa e penas lâminas cirúrgicas, são importantes para o manejo adequado e remoção de tecido.
Este método é aplicável para estudar a função de outros transportadores epiteliais, tais como transportadores de transportadores de electrólitos (cloreto, Na + / H + permutadores, transportadores de nutrientes, etc.). Usos especializados da Ussing câmara de como a técnica pH stat, para medir a secreção de bicarbonato transepithelial, e o método de fluxo de isótopos, para medir a secreção líquida ou absorção de substratos foram revistos exaustivamente pelo Dr. Clarke et al. 8. Eles extensivamente revisado a aplicação de câmaras de Ussing ao estudo do transporte de nutrientes 19. Mini câmaras de Ussing, também têm sido usados em situações clínicas relevantes, tais como para medir a função de transporte em amostras de biópsiaRef "> 20. A grande vantagem da técnica de câmara Ussing sobre o método SAC evertido é a capacidade de medir simultaneamente os parâmetros eléctricos e de transporte de intacta, epitélio intestinal polarizada.
Uma preocupação com o método da câmara Ussing é limitada a viabilidade e função óptima de uma preparação ex vivo intestinal. Após a remoção do animal, o ex vivo preparo intestinal só pode durar até 3 horas em uma câmara Ussing 19. Assim, este método pode ter limitações em testar o efeito de agentes durante períodos de tempo mais longos. Em tais casos, o tratamento pode ser realizado in vivo e, em seguida, isolado a partir de intestino grupos de controlo e de tratamento podem ser utilizados para medir os parâmetros de transporte com o método de Ussing. Em todos os casos, a magnitude da L T (ou Rt) pode ser um indicador de tempo real de viabilidade e pode ser útil para discriminar entre oefeitos específicos e inespecíficos de reagentes testados.
Em resumo, os métodos aqui descritos podem facilitar a nossa compreensão dos mecanismos celulares e moleculares que regulam a função e regulação dos transportadores epiteliais em condições saudáveis e doentes, tais como a inflamação intestinal, diarreia infecciosa, má absorção, ou doenças metabólicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
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