Summary
وصفنا طرق بسيطة لدراسة تنظيم نقل السيروتونين في الأمعاء وظيفة (سرت) والتعبير عن الرأي في المختبر خلية نموذج ثقافة كاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D ونموذج المجراة سابقا من الأمعاء الماوس. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لدراسة النقل الظهارية الأخرى.
Abstract
ظهارة الأمعاء لها وظائف النقل وحاجز الهامة التي تلعب دورا رئيسيا في الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للجسم في الوقت الذي توفر حاجزا أمام الجسيمات الأجنبية. ارتبط النقل الظهارية ضعف (أيون، والمواد الغذائية، أو المخدرات) مع العديد من الأمراض ويمكن أن يكون لها عواقب تتجاوز الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للنقل، مثل من خلال التأثير على سلامة الظهارية وmicrobiome القناة الهضمية. فهم وظيفة وتنظيم البروتينات النقل هو أمر حاسم لتطوير التدخلات العلاجية تحسينها. التحدي الأكبر في دراسة النقل الظهارية بوضع نظام نموذج مناسب الذي يلخص الميزات الهامة للخلايا الظهارية في الأمعاء الأم. وتستخدم عدة نماذج زراعة الخلايا في المختبر، مثل كاتشو-2، T-84، والخلايا HT-29-Cl.19A عادة في البحوث النقل الظهارية. هذه خطوط الخلايا تمثل المقاربة الاختزالية لنمذجة هوقد استخدمت pithelium وفي العديد من الدراسات الميكانيكية، بما في ذلك فحصها من التفاعلات الظهارية الميكروبي. ومع ذلك، الطبقات الوحيدة الخلية لا تعكس بدقة التفاعلات خلية خلية والمكروية في الجسم الحي. وقد أظهرت الخلايا المزروعة في 3D لتكون واعدة نماذج لدراسات نفاذية المخدرات. وتبين لنا أن كاتشو-2 الخلايا في 3D يمكن استخدامها لدراسة النقل الظهارية. ومن المهم أيضا أن الدراسات في الخلايا كاتشو-2 وتستكمل مع نماذج أخرى لاستبعاد خلية آثار محددة وأن تأخذ في الاعتبار تعقيد الأمعاء الأصلي. وقد استخدمت عدة طرق في السابق لتقييم وظائف النقل، مثل كيس مقلوبة وامتصاص في الخلايا الظهارية المعزولة أو في عزلة حويصلات غشاء البلازما. مع الأخذ بعين الاعتبار التحديات في هذا المجال مع الاحترام لنماذج وقياس وظيفة النقل، وعلينا أن نظهر هنا بروتوكول لتنمو كاتشو-2 الخلايا في 3D ووصف استخدام لغرفة أوسينج باعتبارهانهج فعال لقياس نقل السيروتونين، كما هو الحال في الظهارة المعوية الاستقطاب سليمة.
Introduction
وقد تم تجهيز ظهارة الأمعاء مع بروتينات النقل المختلفة (القنوات، ATPases، وشارك في النقل والمبادلات) التي تؤدي وظائف عديدة بدءا من امتصاص المواد الغذائية، الشوارد، والأدوية لإفراز السوائل والأيونات في التجويف. بروتينات النقل توليد التدرجات الكهروكيميائية التي تسمح حركة الأيونات أو الجزيئات بطريقة اتجاهي. ويتحقق ذلك عن طريق توزيعات غير المتماثلة لنظم النقل في الأغشية القمية وbasolateral من الخلايا الظهارية الاستقطاب. وبالإضافة إلى ذلك، منعطفات ضيقة، الذي حبل الخلايا الظهارية المجاورة، وتلعب دورا هاما في هذه العملية بمثابة حاجز لنشر intramembrane من المكونات بين المجالات غشاء قمي وbasolateral. نظم نموذج محاكاة مناسبة هذه السمات المميزة للأمعاء الأصلي (أي القطبية، والتمايز، وسلامة تقاطع ضيقة) هي الحاسمة لدراسة functionality أنظمة النقل الظهارية.
وفيما يتعلق النماذج، وخطوط الخلايا التقليدية المستخدمة حاليا في مجال البحوث النقل الظهارية في الأمعاء هي كاتشو-2، وهذا نموذج من متباينة تماما، الاستيعابية الخلايا الظهارية في الأمعاء الصغيرة؛ والخلايا T84 أو HT-29 subclones، ونماذج من المشتقة من سرداب كبيرة الخلايا الظهارية في الأمعاء 1. تقليديا، وتزرع هذه خطوط الخلايا كما الطبقات الوحيدة في الأسطح البلاستيكية أو في إدراج transwell المغلفة. عبر أيضا إدراج ثقافة خلية إلى حد ما تشبه البيئة في الجسم الحي من خلال السماح للخلايا الاستقطاب لإطعام basolaterally. ومع ذلك، وجود قيود في نظم الاستزراع 2D التقليدية هو أن يضطر الخلايا على التكيف مع سطح الاصطناعي، شقة، وجامدة. وبالتالي، لا ينعكس تعقيد الفسيولوجية للظهائر الأم بدقة في نظام 2D. وقد تم التغلب على هذا التحديد عن طريق وسائل لزراعة خلايا في 3D في المكروية محددة، مثل mixtur البروتين هلاميةالإلكترونية، التي تحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات المصفوفة خارج الخلية 2 و 3. ومع ذلك، يمكن للفي المختبر الثقافات ليس محاكاة تعقيد ظهارة الأمعاء، والتي لديها أنواع خلايا متعددة والهندسة المعمارية الخاصة بكل منطقة في الأمعاء. وهكذا، فإن الدراسات باستخدام نماذج ثقافة الخلية تحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة في الأمعاء الأصلي. باستخدام 3D الثقافة في المختبر الخلايا والأغشية المخاطية المعوية الماوس، وصفنا هنا طرق بسيطة لدراسة تنظيم نقل الأمعاء السيروتونين (SLC6A4، سرت).
ونقل سرت ينظم توافر خارج الخلية من هورمون مهم والعصبي، 5-هيدروكسي (5-HT)، قبل نقله بسرعة من خلال نا + / كلور - عملية معتمد على. سرت هو الهدف معروف عقاقير مضادة للاكتئاب وبرز مؤخرا باعتباره هدفا علاجيا جديدا لاضطرابات الجهاز الهضمي مثل الإسهال والتهاب الأمعاء.طرق للتحقيق امتصاص 5-HT في الخلايا الظهارية في الأمعاء وقد وصفت سابقا. على سبيل المثال، وقد ثبت كاتشو-2 الخلايا المزروعة على دعامات بلاستيكية أو إدراج نفاذية لعرض فلوكستين تراعي 3 H-5-HT امتصاص في كل قمي وbasolateral المجالات 4. كما تم وصف قياس وظيفة سرت في عزل فرشاة الحدود غشاء الحويصلات (BBMVs) التي أعدت من الأمعاء بالأعضاء البشرية المانحة صغيرة من قبلنا 5. تم إنذار 3 امتصاص H-5-HT في BBVMs الإنسان أن يكون فلوكستين حساسة والصوديوم + / كلور - معتمد على، وعرضت حركية التشبع مع ك م من 300 نانومتر 5. استخدام وسائل مماثلة، ونحن أيضا قياس سابقا وظيفة سرت إلى 3 امتصاص H-5-HT في الماوس BBMVs المعوية 6. ومع ذلك، فإن إعداد نقية حويصلات غشاء البلازما يتطلب كمية كبيرة من الغشاء المخاطي الأنسجة. أساليب أخرى، مثل radiogالتصور raphic من 3 مواقع امتصاص H-5-HT، وأيضا ثبت سابقا في خنزير غينيا والفئران الأمعاء الدقيقة 7.
توفر غرفة أوسينج نظام أكثر الفسيولوجية لقياس نقل الأيونات، المواد الغذائية، والمخدرات عبر مختلف الأنسجة الظهارية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية غرفة أوسينج هو أنه تمكن من قياس دقيق للالمعلمات الكهربائية ونقل سليمة، ظهارة الأمعاء الاستقطاب. وعلاوة على ذلك، للحد من تأثير الجهاز العصبي العضلي جوهري، تجريد الطبقتين المصلية و العضلية من الغشاء المخاطي في الأمعاء يمكن القيام بها لتحقيق تنظيم النقل في الظهارة 8.
علينا أن نبرهن على كاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D على البروتين هلامي تشكل التجويف جوفاء تعبر عن علامات قمي وbasolateral متميزة. تظهر هذه الخلايا تعبير أعلى من سرت من 2D خلايا كاتشو-2. طرق لتنمو خلايا 3D والمؤسسة العامة لووصف rform المناعية أو RNA والبروتين الاستخراج. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف أساليب لدراسة وظيفة سرت والتنظيم من قبل TGF-β1، خلوى عديد المظاهر، في الغشاء المخاطي في الأمعاء الصغيرة من خلال الاستفادة من تقنية غرفة أوسينج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. دراسة المعوية نواقل في نظام الثقافة 3D من كاتشو-2: تزايد 3D كاتشو-2 خلية الثقافة على خليط من البروتين هلامي
- عامل النمو ذوبان تخفيض هلامي خليط من البروتين على الجليد لمدة 8 ساعات (أو O / N) في 4 درجات مئوية. إذابة مرة واحدة، وجعل 1 مل أو 500 مكل للاستخدام أو تخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
- يوم الثقافة، precool لوحات ثقافة (لRNA والبروتين الاستخراج) أو الشرائح غرف (لالمناعية) على الجليد. إضافة 30 ميكرولتر من خليط من البروتين هلامي إلى كل بئر من شريحة ثمانية جيدا غرف من الزجاج الملون (أو 120 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 6 جيدا) وموزعة بالتساوي. الحرص على عدم توليد فقاعات الهواء أثناء العملية.
- ضع الشرائح / لوحات داخل حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة، والسماح للخليط من البروتين هلامي ليصلب.
- في حين أن خليط من البروتين هلامي وبدمج، يعرض للتريبسين قارورة متكدسة من خلايا كاتشو-2.
- حساب عددمن الخلايا وتدور لهم في 500 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق بيليه خلية في 3D كاتشو-2 متوسطة حسب الحاجة.
- البذور الشرائح غرفة زجاجية في 4000 خلية لكل جيدا (لوحات، 20000 لكل بئر). السماح للخلايا أن تنمو في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة كل 3-4 د.
2. المناعي تلطيخ لطلائي نواقل في 3D كاتشو-2 الخلايا: 1 يوم
- نضح المتوسطة وإصلاح الخلايا مع 400 ميكرولتر من 2٪ امتصاص العرق (PFA) (في برنامج تلفزيوني مع تعديل درجة الحموضة إلى 8.5 مع هيدروكسيد الصوديوم) لمدة 30 دقيقة في RT.
يجب عدم تخزين PFA حل لأكثر من 1 في الاسبوع في 4 درجات مئوية، والحل تقدم طازجة يمكن استخدام: ملاحظة. تنبيه: PFA شديدة السمية ومسرطنة محتملة. التعامل دائما مع الحذر في غطاء الكيميائية واستخدام معدات الوقاية الشخصية. - شطف الآبار مرتين مع 1X برنامج تلفزيوني وتخزين الشرائح في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني (400 ميكرولتر /حسنا). مرة واحدة ثابتة، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى واحد.
- تدفئة الشرائح غرفة لRT (وهذا سوف تتصلب هلامي السرير بروتين خليط وتجعل من السهل على نضح خلال خطوات الغسيل).
- Permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة لا تزيد عن 15 دقيقة.
- إعداد العازلة في برنامج تلفزيوني-جليكاين (130 ملي مول كلوريد الصوديوم، 7 ملي نا 2 هبو 4، 3.5 مم ناه 2 ص 4، و 100 ملي جليكاين). شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X-الجلايسين لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT.
- إعداد عازلة المناعي (IF): 130 مم كلوريد الصوديوم، 7 ملي نا 2 هبو 4، 3.5 مم ناه 2 ص 4، 100 ملي جليكاين، 7.7 ملي نان 3، 0.1٪ BSA، 0.2٪ TritonX-100، و 0.05٪ توين-20 .
- غسل 3X في IF العازلة لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT. كتلة في 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع) في المخزن IF. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في IF + 1٪ مصل الماعز، و 200 ميكرولتر / جيد، ل1 - 2 ساعة عند RT. يغسل مع IF عازلة 3X لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان مع المضادة الثانويةالجسم (1: 200) المخفف في IF + 1٪ خ ع، 200 ميكرولتر / جيد، لمدة 1 ساعة على RT.
- يغسل مع العازلة IF ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما. الحفاظ على الشرائح في الظلام من هذه الخطوة على. رفع غرف البلاستيك من الشرائح الزجاجية عن طريق وضع شريحة غرفة في حامل الأسود وانزلاق رافع البيضاء من خلال حامل حتى الاتصالات حافته حافة الآبار. سحب بلطف صعودا غرف (حامل ورافع ينبغي أن يأتي مع الشرائح الثقافة).
- جبل مع بطء المتوسطة مكافحة تتلاشى، واتركه حتى يجف لمدة 10 دقيقة في RT.
- مرة واحدة جفت تماما، وختم الشرائح مع طلاء الأظافر وصورة لهم مع المجهر متحد البؤر. تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين أو عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
3. RNA واستخراج البروتين من 3D كاتشو-2 خلايا
- علاج الخلايا مثقف على خليط من البروتين هلامي ل12-14 د مع وكيل الاختبار، مثل β1 TGF- (10 نانوغرام / مل، 1 ساعة).
- بعد العلاج، وغسل الخلايا مع 1برنامج تلفزيوني ×. تبقي الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة لتسييل خليط من البروتين هلامي.
- غسل الآبار مع المبردة برنامج تلفزيوني وجمع الخلايا في أنابيب الطرد المركزي الفردية. جمع الخلايا باستخدام منخفضة السرعة الطرد المركزي في 500 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الإجراءات القياسية واستخدام الوقت الحقيقي RT-PCR.
- لاستخراج البروتين، ليز الخلايا باستخدام 1X عازلة خلية تحلل تستكمل مع 1X البروتيني كوكتيل المانع. بعد إضافة عازلة خلية تحلل لبيليه، ليز خلايا صوتنة وإزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي في 7500 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة.
4. قياس 5-HT امتصاص في ماوس الدقاق الاستفادة من غرفة أوسينج: إعداد المعوية والطبقتين المصلية و العضلية تجريد
- بعد القتل الرحيم، تشريح الفئران وإزالة الأمعاء الدقيقة (بعد المعدة وقبل الأعور). تقسيم الأمعاء الدقيقة إلى ثلاثة أجزاء. تجاهل ثلث الوسط استخدام ثلث القريبةكما الصائم، واستخدام ثلث البعيدة كما الدقاق. تجنب سحب الأمعاء من تمسكه المساريقي لمنع الأضرار التي لحقت ظهارة. حافظ على قسم الأنسجة البرد بتغطيته مع العازلة الجليد الباردة كريبس الرنين بيكربونات (KBR).
- فتح الأمعاء طوليا باستخدام المقص. احتضان أقسام المعوية رفعه حديثا في الجليد الباردة، والغاز، KBR التي تحتوي على 1 ميكرومتر الاندوميتاسين لمدة 10 دقيقة قبل الطبقتين المصلية و العضلية تجريد.
- دبوس قسم الأمعاء (~ 1 سم في الطول) الجانب المخاطية وصولا الى لوحة تحتوي على 7٪ الاغاروز أو علاجها المطاط الصناعي سيليكون (0.5 سم سميكة).
- تجريد الطبقات الطبقتين المصلية و العضلية تحت مجهر تشريحي تشريح مع الإضاءة السفلية. قطع طبقة الطبقتين المصلية و العضلية باستخدام شفرة ريشة مشرط. استخدام ملقط غرامة للحصول على حافة طبقة على طول المحور الطولي للأمعاء.
ملاحظة: أثناء إجراء تجريد، والإضاءة السفلية للمجهر تشريحي يساعد على تحديد وتجنب المناطق مع التصحيح باير لوفاق. - بعد الانتهاء من تجريد الطبقتين المصلية و العضلية، تركيب الغشاء المخاطي بعناية على دبابيس من نصف غرفة-Ussing. خلال العملية برمتها، ورعاية لعقد الأنسجة المخاطية تجريده من الحواف لتجنب تمزق.
5. موازنة ومعالجة الأنسجة
- يعد حل كريب: 115 مم كلوريد الصوديوم، و 25 ملي NaHCO 3، 2.4 ملي K 2 هبو 4، 1.2 ملي CaCl 2، 1.2 ملي MgCl 2، و 0.4 ملي KH 2 PO 4 في 7.4 درجة الحموضة، ابيدوا 95٪ O 2/5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. إضافة 10 ملي الجلوكوز إلى الحمام المصلي لتكون بمثابة الركيزة الطاقة و 10 ملي مانيتول إلى الحمام المخاطية للحفاظ على التوازن الاسموزي.
ملاحظة: يتم استكمال حل كريب مع حمض L-الاسكوربيك (100 ميكرون) وبارغيلين (100 ميكرومتر، أوكسيديز المانع) لمنع تدهور داخل الخلايا 5-HT. - إدراج شريط التمرير الى غرفة لفضح كل من القمي (اللمعية) سيدي و(المصلي) الجانب basolateral من الأنسجة إلى حل كريب.
- بعد فترة موازنة من 10 دقيقة، يمهد للمعالجة الأنسجة اللفائفية مع فلوكستين (10 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة على الجانب قمية للمللي J (الغشاء المخاطي إلى المصلي تدفق).
- علاج الأنسجة مع TGF-β1 (10 نانوغرام / مل) لمدة 1 ساعة على الجانب basolateral ثم احتضان مع 3 [H] -5-HT (20 نانومتر) لمدة 30 دقيقة على الجانب قمي.
6. الكمي لالأغشية المخاطية للالمصلي الجريان (J مللي ثانية) و 3 [H] تراكم -5-HT في الأنسجة
- جمع 0.75 مليلتر مأخوذة من الخزان المصلي (ما مجموعه 5 مل) لقياس النشاط الإشعاعي في عداد التلألؤ السائلة ولحساب-الغشاء المخاطي للالمصلي (J مللي ثانية) معدلات التدفق. ، فلوكستين الحساسة تدفق تمثل سرت بوساطة 3 امتصاص [H] -5-HT.
- لتجنب الخلافات الضغط الهيدروستاتيكي عبر الغشاء المخاطي خلال فترة التدفق، أخذ عينات من الجانب المصلي وإعادةوضعها مع وحدات التخزين متطابقة المتوسطة حمام.
ملاحظة: حساب تدفق بتصحيح للتخفيف من العينة نهاية (4.25 مل / 5 مل = 0.85). - لتقدير حجم 3 [H] -5-HT المتراكمة في الأنسجة، وترجل الغشاء المخاطي من شريط التمرير، ويغسل مرة واحدة مع العازلة KRB الجليد الباردة، ووضعه في أنابيب ثقافة الزجاج.
- احتضان الغشاء المخاطي في 0.5 مل من 10٪ KOH بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. قياس النشاط الإشعاعي في 150 مكل من لست] (في يثلث) باستخدام عداد التلألؤ السائل.
- استخدام قسامات (3-5 ميكرولتر) من لست] لقياس تركيز البروتين باستخدام طريقة برادفورد.
ملاحظة: يتم استخدام 10 مل من المتوسط الحضانة التي تحتوي على مادة السيروتونين المشع كمعيار. الاحتفاظ 5-HT في الأنسجة يتم التعبير عن بمول / ملغ من البروتين / دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد المناعية في 3D كاتشو-2 الخراجات في الشكل 1. ويصور صورة تمثيلية من XY-الطائرة تظهر التجويف ترسيمها جيدا في كيس 3D ملطخة الأكتين phalloidin في الشكل 1A. الجانب التي تواجه التجويف يدل على الجانب قمي. خلايا ظهارية في نتيجة بيئة 3D في النمط الظاهري الظهارية قوية. مختلفة كاتشو-2 الخراجات في يوم 12، عندما كانت الأكتين وسرت شارك الملطخة، في الشكل 1B. في هذا التمثيل من XY-طائرة (مختلفة من الطائرة هو مبين في الشكل 1A)، سرت تلطيخ مرئيا، في الغالب في الغشاء اللمعية، جنبا إلى جنب مع تلطيخ شبه قمي. ويبين الشكل 2 أن مستويات البروتين سرت هي أعلى في الخراجات 3D بالمقارنة مع كاتشو-2 الخلايا المزروعة كما الطبقات الوحيدة على postplating اليوم ال 12. وتشير هذه البيانات إلى أن الثقافة 3D الخلايا كاتشو-2 قد يؤدي يشير الأحداث التي تحاكي غTIVE ظهائر ويؤدي إلى زيادة التعبير سرت. الشكل 3A يصور محة عامة وتشغيل نظام غرفة أوسينج ويظهر الأمعاء الصغيرة التي شنت في دبابيس من الفتحة. هذا الأسلوب يسمح للتقييم لنشاط النقل الظهارية في الأمعاء الأصلي. الاستفادة من نهج غرفة أوسينج هي القدرة على تقييم وظيفة النقل أعرب عن اللمعية (الغشاء المخاطي) أو basolateral الجانب (المصلي). الشكل (4) يوضح زيادة 5-HT J مللي تدفق (A) وزيادة تراكم 5-HT في الغشاء المخاطي لفائفي (ب) استجابة لTGF-β. منذ زيادة TGF-β1 حركة رديولبلد 5-HT من الغشاء المخاطي لجانب المصلي، ممثلا في السيدة J، وهذه البيانات تدل على زيادة في امتصاص 5-HT من الغشاء اللمعية من الخلايا الظهارية اللفائفية. وهذا هو الواضح كذلك من زيادة في تراكم رديولبلد 5-HT في الخلية، التيكان حساسا للتثبيط من فلوكستين، وهو ما يعكس نشاط سرت أعرب عن غشاء اللمعية.
الشكل 1: كاتشو-2 نمت على خليط من البروتين هلامية بنسبة 12 د عرض مميز التجويف. الأحمر: الأكتين. لالمناعية لكاتشو-2 الخراجات التي تزرع في 3D، وكانت الخلايا المستزرعة في شريحة غرف 8 جيدا وملطخة phalloidin (A)، كما هو موضح سابقا من قبل Debnath وآخرون. 9. لالمناعية ثقافة 3D كاتشو-2 (ب)، كانت ثابتة الخراجات في 2٪ PFA لمدة 30 دقيقة، تعامل مع برنامج تلفزيوني الجلايسين، وpermeabilized مع 0.5٪ تريتون-X-100 لمدة 15 دقيقة في RT. بعد حظر، وحضنت الخراجات في الأجسام المضادة سرت (1: 100) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ثم تم غسلها وحضنت مع الأجسام المضادة مضان مترافق الثانوية (1: 200) وphalloidin (1: 200)لمدة 45 دقيقة في RT. وأخيرا، كانت تقام في antifade تحتوي على دابي. تم القبض على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر. شريط الحجم: 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سرت البروتين التعبير في كاتشو-2 الخلايا المزروعة في 2D و 3D. نشف لست] من خلايا كاتشو-2 مثقف على الدعم من البلاستيك وكاتشو-2 3D المجالات تم حلها بواسطة SDS-PAGE على الأغشية النيتروسليلوز وتحليلها مع الأجسام المضادة سرت وGAPDH. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
![الشكل (3)]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
الشكل (3): (أ) غرفة أوسينج و "المنزلق" مع المسامير والفتحة تظهر الأمعاء الماوس محمولة صغيرة. المتزلج منطقة الفتحة = 0.30 سم 2. المنزلق يلائم نصفي من غرفة أوسينج، والتي هي مجزأة. المعلمات الكهربائية، مثل إمكانية بطريق الظهارة الجهد (V ر)، ويقاس على الجهد والأقطاب الكهربائية (عادة كالوميل نصف الخلايا أو ترتبط حج-أجكل عن طريق جسور الملح لكل نصف دائرة). وتتكون الملح جسور 3٪ أجار ذاب في المنطقة العازلة الفسيولوجية (على سبيل المثال، KBR) المستخدمة في الاستحمام الغشاء المخاطي لتجنب إحداث تغييرات في تركيبة الأيونية من الحلول. (ب) رسم تخطيطي لمبدأ غرفة أوسينج. وقد شنت الغشاء المخاطي المعوي جردت في شطري وغرفة أوسينج فصل الغشاء المخاطي والمصلي غرف. تمت إضافة التتبع الإشعاعي للسيد المخاطيةه. وقد تم قياس امتصاص إذ أن كمية النشاط الإشعاعي إدراجها من قبل الأنسجة، وتطبيع للمحتوى البروتين الكلي. تم تقييم التدفق من خلال قياس النشاط الإشعاعي في غرفة المصلي على مدى فترة من الزمن. الأقطاب هو مبين في التخطيطي تسمح لرصد وقت واحد من المعلمات الكهربائية، وبما في ذلك التيار، والجهد، والمقاومة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4): قياس سرت وظيفة في اللفائفية الغشاء المخاطي جردت من طبقة الطبقتين المصلية و العضلية. فيفو السابقين آثار على المدى القصير العلاج TGF-β1 على وظيفة سرت في الدقاق الماوس، ويتجلى من خلال قياس 3 [H] امتصاص -5-HT و 3 [H] -5-HT الطلاءات باستخدامUssing غرفة. العلاج TGF-β1 (10 نانوغرام / مل، 1 ح) على الجانب basolateral زيادة كبيرة في وظيفة سرت، كما يتضح من زيادة الصوديوم -sensitive المخاطية إلى المصلي تدفق (J مللي ثانية) (أ) و (3) [H] - امتصاص 5-HT (B). العلاج فلوكستين من الأنسجة اللفائفية تحول دون حفز TGF-β1-5-HT امتصاص. وقد زاد الإقبال الحساسة للفلوكستين 2.5 أضعاف بحلول TGF-β1 مقارنة بالمجموعة الضابطة. وتتمثل النتائج كما يعني SEM. تم استخدام اختبار A-اتجاه واحد أنوفا توكي للتحليل الإحصائي. حساب J مللي تدفق: [(CPM ه - الاجتماع التحضيري للمؤتمر ق) س عامل التخفيف] / [(الخامس الأمراض المنقولة جنسيا س اضرب الركيزة) الاجتماع التحضيري للمؤتمر الأمراض المنقولة جنسيا / xtxa]. الاجتماع التحضيري للمؤتمر البريد: التهم لكل دقيقة في نهاية قياس التدفق. الاجتماع التحضيري للمؤتمر ق: التهم لكل دقيقة في بداية قياس التدفق. الاجتماع التحضيري للمؤتمر الأمراض المنقولة جنسيا: التهم لكل دقيقة من معيار (مأخوذة من الخزان المخاطية)؛ V الأمراض المنقولة جنسيا: حجم سو الأمراض المنقولة جنسيا الاجتماع التحضيري للمؤتمر. ر: حان الوقت للتدفق في ح. و: منطقة الفتحة (0.3 سم 2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت متباينة تماما الطبقات الوحيدة كاتشو-2 خلية على نطاق واسع كما الاستقطاب الطبقات الوحيدة الظهارية لدراسة النقل المعوي 10، 11، 12، 13، 14، 15. ومع ذلك، لمحاكاة منظمة الفسيولوجية للخلايا الظهارية في الأمعاء، وكان هناك اهتمام كبير في تطوير ثقافة كاتشو-2 في 3D. وقد وضعت عددا من النماذج 3D زراعة الخلايا لخلايا الظهارية في الأمعاء مؤخرا التي تحاكي الأم خلية خلية وخلية خارج الخلية المصفوفة (ECM) التفاعل مع أهميتها الفسيولوجية أكبر من أنظمة 2D 16. وبالتالي، يتم استخدام الهلاميات المائية الطبيعية القائمة على ECM التي تحتوي على مكونات مشتركة (مثل laminin، الكولاجين الرابع، والهيبارين بروتيوغليكان سلفات) على نطاق واسع لتوليد الخلايا الثقافات 3D 16.
بروتوكول الموصوفة هنا يوضح مدى ملاءمة 3D كاتشو-2 الخلايا المزروعة في خليط من البروتين هلامي (وهو هيدروجيل الطبيعي القائم على ECM المستخرجة من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) الأورام الماوس) للبحوث النقل الظهارية. في غضون 10 يوما، تبدأ الخلايا لتشكيل تجويف مجوفة محاطة بطبقة من الخلايا وتظهر القطبية، مع مجالات قمي وbasolateral متميزة. كثافة الخلية في وقت البذر على خليط من البروتين هلامي هو أمر حاسم لتشكيل الخراجات منتظمة مع التجويف المركزي. للتجارب تلطيخ، واضاف نحن 4،000 خلايا جيدا / من شريحة (منطقة السطح جيدا: 0.7 سم 2) 8-غرفة. بذر خلايا في ينتج عن ارتفاع الكثافة في المجالات غير النظامية. الخراجات 3D كاتشو-2 في 10-12 أيام وتبين الاستقطاب والمزيد من التمييز من 2D كاتشو-2 الخلايا المزروعة على transwells 17 (الملاحظات غير منشورة). لقد أظهرت زيادة ملحوظة في التعبير عن سرت مرنا ومستويات البروتين وشركاتعرب كورب إلى الطبقات الوحيدة 2D متباينة تماما. أيضا، وذلك باستخدام هذه الأساليب، لقد أظهرنا أن TGF-TGF-β1 يزيد من مستويات سطح سرت، كما هو مبين المناعي تلطيخ 15.
ومن المثير للاهتمام، وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن 3D كاتشو-2 الخلايا أكثر استجابة للمثيرات المرضية بسبب وجود مكونات الإشارات الحيوية، مثل TNF مستقبلات 2 و MyD88، وتمثل نموذجا أفضل من نظام 2D التقليدية 17. ومع ذلك، قضية واحدة أن يحد من استخدام 3D كاتشو-2 في أبحاث النقل الظهارية هو عدم وجود أنواع مختلفة من الخلايا والتعقيد التي توجد في الأمعاء الأصلي. وفي هذا الصدد، organoids الأمعاء (المعروف أيضا باسم enteroids / colonoids) من الإنسان أو الأصل الماوس تمثل نموذجا للدولة من بين الفن وتحتوي على جميع أنواع مختلفة من الخلايا الطلائية من الأم إلى دراسة نقل الأيونات، المواد الغذائية، أو المخدرات. بالمقارنة مع organoids، جيدامتباينة 3D كاتشو-2 الخراجات تمثل نوع واحد من الخلايا الظهارية (أي المعوية الاستيعابية) وهي بالتأكيد مناسبة للالدراسات التي تركز على الآليات الخلوية والجزيئية التي تحكم النقل المعوية. وذلك لأن خلايا 3D كاتشو-2 هي مريحة للتعامل، وفعالة من حيث التكلفة، وسهلة للتلاعب، مثل لتعداء من البلازميد والرناوات siRNAs. الحد آخر من الخلايا 3D كاتشو-2 في أبحاث النقل الظهارية هو صعوبة في الوصول إلى التجويف. العوامل التي ربط اللمعية مستقبلات الغشاء أو العوامل المعدية التي يمكنها الوصول إلى ظهارة من الجانب اللمعية قد يكون تحديا للدراسة في هذا النظام. هذا القيد يمكن التغلب على microinjecting وكلاء في التجويف، كما حدث من قبل في حالات ثقافة عضي المعوية الإنسان لجيم العدوى صعب 18. غير أنه من المهم أن يتم التحقق من صحة الدراسات في المختبر في نماذج ثقافة الخلية في ط الأصليntestine استخدام في الجسم الحي أو النهج خارج الحي.
على مدى العقود القليلة الماضية، ساهمت غرفة أوسينج إلى حد كبير في التعرف على الخصائص الفنية أو التنظيمية العديد من شركات النقل الظهارية 19. هنا، وتبين لنا مدى ملاءمة النهج غرفة أوسينج لقياس التدفق 5-HT وامتصاص 5-HT في الماوس الأمعاء المخاطي يخلو من طبقة الطبقتين المصلية و العضلية 15. العلاج TGF-β1 من الغشاء المخاطي لفائفي على الجانب basolateral (10 نانوغرام / مل، 1 ح) زيادة كبيرة في وظيفة سرت، كما يتضح من زيادة الصوديوم -sensitive المخاطية إلى المصلي تدفق (J مللي ثانية) و 3 H-5- HT امتصاص. العلاج فلوكستين من الأنسجة اللفائفية تحول دون تحفيز بوساطة TGF-β1 لامتصاص 5-HT.
وتشمل الخطوات الحاسمة لهذه التقنية تتصاعد الأنسجة على فتحة شريحة باعتبارها طبقة سليمة (دون أي تمزق) من أجل achie لقد قياسات دقيقة. أدوات الجراحية المناسبة، مثل مقص الكرة، ملقط رقيقة طرف، وريش الجراحية ريشة، مهمة لمعالجة المناسب وتجريد من الأنسجة.
هذه الطريقة تنطبق على دراسة وظيفة النقل الأخرى الظهارية، مثل النقل بالكهرباء (نقل الكلوريد والصوديوم + / H + المبادلات، نقل المواد الغذائية، وما إلى ذلك). الاستخدامات المتخصصة التابعة للUssing غرفة مثل تقنية القانون الأساسي ودرجة الحموضة، لقياس إفراز بيكربونات بطريق الظهارة، وطريقة تدفق النظائر، لقياس صافي إفراز أو امتصاص ركائز تم استعراض شامل من قبل الدكتور كلارك وآخرون. 8. واستعرض على نطاق واسع تطبيق غرفة أوسينج لدراسة نقل المغذيات 19. كما استخدمت الدوائر البسيطة Ussing في الحالات ذات الصلة سريريا، مثل لقياس وظيفة النقل في عينات الخزعةالمرجع "> 20. والميزة الرئيسية لهذه التقنية غرفة أوسينج على الطريقة كيس مقلوبة هي القدرة على قياس واحد المعلمات الكهربائية ونقل سليمة، ظهارة الأمعاء الاستقطاب.
واحد قلق مع أسلوب غرفة أوسينج هو السلامة محدودة وظيفة المثلى لإعداد الأمعاء خارج الجسم الحي. عند إزالة من الحيوان، وإعداد الأمعاء خارج الجسم قد تستمر فقط لمدة تصل إلى 3 ساعات في غرفة أوسينج 19. وبالتالي، قد يكون هذا الأسلوب قيود في اختبار تأثير وكلاء لفترات زمنية أطول. في مثل هذه الحالات، والعلاج لا يمكن أن يؤديها في الجسم الحي ثم عزل الأمعاء من مجموعات المراقبة والعلاج يمكن أن تستخدم لقياس المعلمات النقل مع أسلوب Ussing. في كل الحالات، فإن حجم G ر (أو آر تي) يمكن أن يكون مؤشرا الوقت الحقيقي الحيوية ويمكن أن تكون مفيدة في التمييز بينآثار محددة وغير محددة من الكواشف التي تم اختبارها.
وباختصار، يمكن الأساليب المذكورة هنا تسهيل فهمنا للآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم وظيفة وتنظيم النقل الظهارية في ظروف صحية والمريضة، مثل التهاب الأمعاء والإسهال المعدية، وسوء الامتصاص، أو اضطرابات التمثيل الغذائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
