Summary
Wir beschreiben einfache Methoden der Regulierung der intestinalen Serotonintransporter zu studieren (SERT) Funktion und Expression einer in vitro Zellkulturmodell von Caco-2 - Zellen gezüchtet in 3D und eine ex - vivo - Modell der Maus - Darm verwendet wird . Diese Verfahren sind anwendbar auf die Untersuchung von anderen epithelialen Transportern.
Abstract
Das Darmepithel hat wichtige Transport- und Barrierefunktionen, die Schlüsselrollen in normalen physiologischen Funktionen des Körpers spielen, während eine Barriere gegen Fremdpartikeln. Impaired epithelialen Transport (ion, Nährstoff oder Arzneimittel) wurden mit vielen Krankheiten verbunden und können Folgen haben, die über die normalen physiologischen Funktionen der Transportunternehmen, wie beispielsweise durch Beeinflussung epithelialen Integrität und den Darm microbiome verlängern. die Funktion und die Regulierung der Transportproteine zu verstehen, ist für die Entwicklung von verbesserten therapeutischen Interventionen kritisch. Die größte Herausforderung bei der Untersuchung von epithelialen Transport entwickelt ein geeignetes Modellsystem, das wichtige Funktionen der nativen intestinalen Epithelzellen rekapituliert. Mehrere in vitro - Zellkulturmodellen, wie Caco-2, T-84 und HT-29-Zellen werden typischerweise Cl.19A in epithelialen Transport Forschung eingesetzt. Diese Zelllinien stellen einen reduktionistischen Ansatz zur Modellierung der epithelium und wurden in vielen mechanistische Studien verwendet worden, einschließlich der Prüfung der epithelial-mikrobiellen Wechselwirkungen. Allerdings Zellmonolayern genau nicht Zell-Zell - Interaktionen reflektieren und die in - vivo - Mikroumgebung. Die Zellen in 3D gewachsen sind, werden vielversprechende Modelle für Studien Arzneimittelpermeabilität gezeigt. Wir zeigen, dass Caco-2-Zellen in 3D verwendet werden können epithelialen Transporter zu studieren. Es ist auch wichtig, dass Studien in Caco-2-Zellen mit anderen Modellen ergänzt werden zellspezifische Effekte auszuschließen und die Komplexität des nativen Darm zu berücksichtigen. Mehrere Verfahren zuvor verwendet wurden, um die Funktionalität von Transportern, wie umgestülpte Sack und die Aufnahme in isolierten Epithelzellen oder in isolierten Plasmamembranvesikel zu beurteilen. Unter Berücksichtigung der Herausforderungen auf dem Gebiet in Bezug auf Modelle und die Messung der Transportfunktion, zeigen wir hier ein Protokoll Caco-2-Zellen in 3D zu wachsen und die Verwendung eines Ussingkammer als beschreibenwirksamer Ansatz Serotonin-Transport, wie in intakten polarisierten Darmepithelien zu messen.
Introduction
Das Darmepithel ist mit verschiedenen Transportproteine (Kanäle, ATPasen, Co-Transporter und Austauscher) ausgestattet, die aus der Absorption von Nährstoffen reichen, Elektrolyten und Medikamente zur Sekretion von Flüssigkeit und Ionen in dem Lumen zahlreiche Funktionen ausführen. Transportproteine erzeugen elektrochemischen Gradienten, der die Bewegung von Ionen oder Molekülen in vektorieller Weise ermöglichen. Dies wird durch die asymmetrische Verteilung der Verkehrssysteme in den apikalen und basolateralen Membranen polarisierter Epithelzellen erreicht. Zusätzlich tight junctions, die benachbarten Epithelzellen anbinden, eine wichtige Rolle in diesem Prozess spielen, indem sie als Barriere gegen die Diffusion von Komponenten intramembranären zwischen den apikalen und basolateralen Membrandomänen dienen. Geeignete Modellsysteme , die diese charakteristischen Eigenschaften des nativen Darms (dh Polarität, Differenzierung und tight junction Integrität) nachahmt sind entscheidend für die Untersuchung der functionalität von epithelialen Transportsysteme.
In Bezug auf die Modelle, sind die typischen Zelllinien, die derzeit in Darmepithel-Verkehrsforschung Caco-2, ein Modell der ausdifferenzierten, saugfähig Dünndarm-Epithelzellen; und T84 - Zellen oder HT-29 Subklone, Modelle der Krypta abgeleiteten großen intestinalen Epithelzellen 1. Herkömmlicherweise werden diese Zelllinien als Monoschichten in Kunststoffoberflächen oder in beschichteten Transwell-Einsätzen gewachsen. Trans-Well - Zellkultur - Einsätze zu einem gewissen Grad ähneln der in - vivo - Umgebung von polarisierten Zellen ermöglicht basolaterally zu ernähren. Jedoch ist eine Einschränkung in herkömmlichen 2D-Kultursysteme, dass die Zellen gezwungen werden, einen künstlichen, flachen und steifen Oberfläche anzupassen. Somit wird die physiologische Komplexität der nativen Epithelien nicht genau in einem 2D-System reflektiert wird. Diese Begrenzung wurde durch Methoden überwinden Zellen in 3D in einem bestimmten Mikroumgebung, wie gallertartig Protein Mixtur zu wachsene, eine Vielzahl von extrazellulären Matrixkomponenten , die 2, 3. Dennoch können die in vitro - Kulturen nicht die Komplexität des Darmepithels simulieren, die multiple Zelltypen und regionsspezifischen Architektur im Darm hat. So erfordern die Studien unter Verwendung von Zellkulturmodellen weitere Validierung im nativen Darm. Unter Verwendung der in vitro Zellkultur - 3D und Maus Darmschleimhaut, beschreiben wir hier einfache Methoden der Regulierung der Darmserotonintransporter zu studieren (SLC6A4, SERT).
Der SERT transporter regelt die extrazelluläre Verfügbarkeit eines wichtiges Hormon und Neurotransmitter 5-Hydroxytryptamin (5-HT), indem sie durch einen Na + / Cl rasch transportieren - -abhängigen Prozesses. SERT ist ein bekanntes Ziel von Antidepressiva und als ein neues therapeutisches Ziel von GI Störungen wie Durchfall und Darmentzündung kürzlich entstanden.Methods 5-HT-Aufnahme in intestinalen Epithelzellen zu untersuchen, die zuvor beschrieben wurden. Beispielsweise auf Kunststoffträger oder permeablen Einsätzen Caco-2 - Zellen wurden bei 4 Fluoxetin empfindlichen 3 H-5-HT - Aufnahme zeigen sowohl apikalen und basolateralen Domänen gewachsen gezeigt. Die Messung der SERT - Funktion in isolierten Pinsel-Vesikeln (gereinigten BBMVs) aus menschlichen Organspender Dünndarm hergestellt wurde auch von uns 5 beschrieben worden ist . 3 H-5-HT - Aufnahme in den menschlichen BBVMs wurde gezeigt , Fluoxetin empfindlich und Na + / Cl sein - -abhängigen, und es zeigte Sättigungskinetik mit einem K m von 300 nM 5. 6 Unter Verwendung ähnlicher Verfahren, auch wir vorher SERT Funktion als 3 H-5-HT - Aufnahme in Maus - Darm-gereinigten BBMVs gemessen. Jedoch erfordert die Herstellung von reinen Plasmamembran-Vesikel, eine große Menge von Gewebe-Schleimhaut. Andere Verfahren, wie die radiogphische Visualisierung von 3 H-5-HT - Aufnahme - Sites, haben auch zuvor bei Meerschweinchen und Ratten - Dünndarm 7 gezeigt.
Der Ussing-Kammer bietet eine physiologische System den Transport von Ionen, Nährstoffe und Medikamente in verschiedenen epithelialen Geweben zu messen. Der Hauptvorteil der Ussing-Kammer-Technik ist, dass es die genaue Messung der elektrischen und Transportparameter an intaktem, polarisierter Darmepithel ermöglicht. Ferner kann der Einfluss des intrinsischen neuromuskulären Systems, seromuskuläre Abisolieren von Darmschleimhaut zu minimieren 8 die Regulierung der Transporteure in dem Epithel zu untersuchen , durchgeführt werden.
Wir zeigen, dass Caco-2 in 3D gezüchteten Zellen auf gallertartig Protein ein hohles Lumen deutliche apikale und basolaterale Marker exprimieren, bilden. Diese Zellen zeigen eine höhere Expression von SERT als 2D Caco-2-Zellen. Methoden 3D-Zellen zu wachsen und zu perform Immunfärbung oder RNA und Protein-Extraktion beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir Verfahren SERT Funktion und Regulation von TGF-β1, ein pleiotrope Cytokine, in Dünndarmschleimhaut unter Verwendung einer Ussing-Kammer-Technik zu studieren.
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Protocol
1. Untersuchung der intestinalen Transporters in einer 3D-Kultursystem von Caco-2: Wachsende 3D Caco-2-Zellkultur auf einem Gelatinous Proteinmischung
- Auftau-Wachstumsfaktor gelatinösen Proteingemisch für 8 h auf Eis reduziert (oder O / N) bei 4 ° C. Nach dem Auftauen machen 1 ml oder 500 & mgr; l-Aliquots für die Anwendung oder bei -20 ° C für die spätere Verwendung.
- Am Tag der Kultur, vorzukühlen Die Kulturplatten (für RNA und Proteinextraktion) oder gekammert Folien (Immunfärbung) auf Eis. In 30 ul gallertartig Proteinmischung in jede Vertiefung einer acht gut chambered-Objektträger aus Glas (oder 120 & mgr; l pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) und gleichmäßig verteilt. Achten Sie darauf, keine Luftblasen während des Prozesses zu erzeugen.
- Platzieren Sie die Folien / Platten in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 - 30 min und erlauben die gelatinöse Proteinmischung zu verfestigen.
- Während die gelatinöse Proteingemisch Verfestigen trypsinize eine konfluente Kolben von Caco-2-Zellen.
- Zählen Sie die Anzahlvon Zellen und für 5 min bei 500 xg sie in einer Tischzentrifuge drehen. Resuspendieren des Zellpellets in 3D Caco-2 Medium nach Bedarf.
- Samen der Glaskammer gleitet bei 4.000 Zellen pro Vertiefung (für Teller, 20.000 pro Vertiefung). Lassen Sie die Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator wachsen. Ändern Medium alle 3 - 4 D.
2. Immunfluoreszenzanfärbung für Epithelial Transporters in 3D Caco-2-Zellen: Tag 1
- Anzusaugen, das Medium und fixieren die Zellen mit 400 ul 2% Paraformaldehyd (PFA) (in PBS mit pH auf 8,5 mit NaOH eingestellt) für 30 min bei RT.
HINWEIS: PFA-Lösung sollte nicht für mehr als 1 Woche bei 4 ° C, und frisch zubereitete Lösung verwendet werden, können gespeichert werden. ACHTUNG: PFA ist hochgiftig und ein potenzielles Karzinogen. Fassen Sie sie mit Vorsicht in einer chemischen Haube und mit persönlicher Schutzausrüstung. - Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit 1x PBS und speichern Sie die Folien bei 4 ° C in PBS (400 & mgr; l /Gut). Einmal festgelegt wurden, bei 4 ° C bis zu einer Woche.
- Wärmen Sie die Kammer gleitet auf RT (dies wird die gallertartig Proteinmischung Bett verhärten und machen es zu aspirieren während der Waschschritte leicht).
- Permeabilisierung der Zellen mit 0,5% Triton in PBS für nicht länger als 15 min.
- Bereiten PBS-Glycin - Puffer (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO 4 und 100 mM Glycin). Spülen 3x mit 1x PBS-Glycin für 10 min jeweils bei RT.
- Bereiten Immunofluoreszenz Puffer (IF): 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO 4, 100 mM Glycin, 7,7 mM NaN 3, 0,1% BSA, 0,2% TritonX-100 und 0,05% Tween-20 .
- Waschen 3x in IF für jeweils 10 min bei RT puffern. Block in 5% normalem Ziegenserum (NGS) in IF-Puffer. Inkubieren mit dem primären Antikörper verdünnt in IF + 1% Ziegenserum, 200 & mgr; l / Vertiefung, für 1 bis 2 h bei RT. Waschen Sie mit IF-Puffer 3x je 10 min.
- Inkubieren mit sekundärem AntiKörper (1: 200), verdünnt in IF + 1% NGS, 200 & mgr; l / Vertiefung, 1 h bei RT.
- Waschen Sie mit IF-Puffer dreimal für jeweils 10 min. Halten Sie die Folien in der Dunkelheit von diesem Schritt an. Heben die Kunststoffkammern von den Glasobjektträger durch die Kammer Schieber in einer schwarzen Halterung platziert und ein weißes Hebers durch den Halter bis zu ihrer Kante in Kontakt mit dem Rand der Mulden gleiten. Ziehen Sie die Kammern nach oben (der Halter und Heber sollte mit den Kulturträger kommen).
- Montieren Sie mit langsamen anti-fade Medium und lassen Sie es 10 Minuten lang bei RT trocknen.
- Sobald vollständig getrocknet, versiegeln Sie die Dias mit Nagellack und Bild sie mit der konfokalen Mikroskopie. Speichern der Objektträger bei 4 ° C für zwei Wochen oder bei -20 ° C für mehrere Monate.
3. RNA und Protein Extraktion aus 3D-Caco-2-Zellen
- Behandeln die kultivierten Zellen auf gelatinösen Proteinmischung für 12 bis 14 d mit einem Testmittel, wie TGF- β1 (10 ng / ml, 1 h).
- Nach der Behandlung, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS. Halten Sie die Zellen auf Eis für 30 min die gelatinöse Proteingemisch zu verflüssigen.
- Waschen der Vertiefungen mit PBS gekühlt und die Zellen in einzelnen Zentrifugenröhrchen sammeln. Sammle die Zellen unter Verwendung von Niedergeschwindigkeits-Zentrifugation bei 500 xg und 4 ° C für 10 min. Extrahieren Sie die RNA unter Verwendung von Standardverfahren und verwenden Echtzeit-RT-PCR.
- Für die Proteinextraktion, lysieren die Zellen 1x Zelllysepuffer mit 1x Protease-Inhibitor-Cocktail ergänzt werden. Zell-Lyse-Puffer zu dem Pellet, lysieren die Zellen durch Beschallung und entfernen die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 7.500 xg und 4 ° C für 10 min nach der Zugabe.
4. Messung der 5-HT-Uptake in Maus-Ileum Verwendung einer Ussingkammer: Intestinale Vorbereitung und seromuskuläre Stripping
- Nach Euthanasie, sezieren die Mäuse und entfernen Sie den Dünndarm (nach dem Magen und vor dem Blinddarm). Teilen Sie den Dünndarm in drei Teile. Entsorgen Sie das mittlere Drittel, verwenden Sie den proximalen Drittelals Jejunum und das distale Drittel Ileum verwenden. Vermeiden Sie den Darm von seiner mesenteric Befestigung ziehen Beschädigung des Epithels zu verhindern. Halten Sie den Gewebeschnitt kalt indem sie sie mit eiskaltem Krebs-Ringer-Bicarbonat (KBR) Puffer abdeckt.
- Öffnen Sie den Darm in Längsrichtung mit einer Schere. Inkubieren frisch ausgeschnittenen Darmabschnitte in eiskaltem, Begasung KBR 1 uM Indometacin für 10 Minuten, bevor die seromuskuläre Strippen enthält.
- Pin der Darmabschnitt (~ 1 cm in der Länge) Schleimhautseite nach unten auf eine Platte, enthaltend 7% Agarose oder gehärtetes Silikonelastomer (0,5 cm dick).
- Isolieren Sie die seromuskuläre Schichten unter einer Dissektion Stereomikroskop mit Bodenbeleuchtung. Schneiden Sie die seromuskuläre Schicht eine Feder Skalpellklinge verwendet wird. Verwenden feinen Pinzette die Kante der Schicht entlang der Längsachse des Darmes zu erhalten.
HINWEIS: Während der Stripping-Verfahren, die Bodenbeleuchtung des Stereomikroskops hilft Bereiche mit Peyer-Plaques zu identifizieren und zu vermeidenes. - Nach dem Abschluss der seromuskuläre Strippen, montieren Sie die Schleimhaut sorgfältig auf die Stifte einer Ussing Halbkammer. Während des gesamten Prozesses, achten Sie auf gestrippt Schleimhautgewebe durch die Kanten zu halten es nicht reißt.
5. Equilibrierung und Gewebebehandlung
- Bereiten Kreb-Lösung: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO 3, 2,4 mM K 2 HPO 4, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgCl 2 und 0,4 mM KH 2 PO 4 bei pH 7,4, begast mit 95% O 2/5% CO 2 bei 37 ° C. Zugabe von 10 mM Glucose, um die Serosa Bad als Energiesubstrat und 10 mM Mannit in die Schleimhaut Bad zu dienen der osmotische Gleichgewicht zu halten.
HINWEIS: Kreb-Lösung mit L-Ascorbinsäure (100 & mgr; M) und Pargylin (100 uM, Monoaminoxidase-Hemmer) ergänzt wird intrazellulär 5-HT-Abbau zu verhindern. - Setzen Sie den Schieber in die Kammer sowohl die apikal (Luminal) si aussetzende und der basolateralen (Serosa) Seite des Gewebes zu Kreb-Lösung.
- Nach einer Äquilibrierungsperiode von 10 min, 30 min auf der apikalen Seite für J ms (Schleimhaut-to-Serosa Fluss) die Ileum - Gewebe mit Fluoxetin (10 uM) vorzubehandeln.
- Behandlung des Gewebes mit TGF-β1 (10 ng / ml) für 1 h auf basolateralen Seite und dann inkubiert mit 3 [H] -5-HT (20 nM) für 30 min auf der apikalen Seite.
6. Quantifizierung der Mucosal zu serösen Flux (J ms) und 3 [H] -5-HT Akkumulation im Gewebe
- Sammeln 0,75 ml Aliquots aus dem serösen Reservoir (insgesamt 5 ml) , um die Radioaktivität in einem Flüssigszintillationszähler zu messen und Schleimhaut-to-Serosa (J ms) Flussraten zu berechnen; Fluoxetin empfindlichen Fluss stellt 3 [H] -5-HT - Aufnahme-SERT vermittelt.
- Um zu vermeiden, hydrostatische Druckdifferenzen über die Schleimhaut während einer Fluss Zeit nehmen Proben aus der Serosaseite und relegen Sie sie mit identischen Volumina Bad-Medium.
HINWEIS: Die Flussberechnung korrigiert um die Verdünnung des Endes Probe (4,25 ml / 5 ml = 0,85). - Für die Quantifizierung von 3 [H] -5-HT im Gewebe angesammelt hat , absitzen die Schleimhaut vom Schieber, waschen Sie es einmal mit eiskaltem KRB - Puffer, und legen Sie sie in Kulturröhrchen Glas.
- Inkubiere die Schleimhaut in 0,5 ml 10% KOH über Nacht bei 37 ° C. Messen der Radioaktivität in 150 & mgr; l-Aliquots der Lysate (in dreifacher Ausführung) mit einem Flüssigkeits-Szintillationszähler verwendet wird.
- Aliquots (3 bis 5 & mgr; l) der Lysate Proteinkonzentration unter Verwendung des Bradford-Methode zu messen.
HINWEIS: 10 ml Inkubationsmedium radioaktiven serotonin enthält, als Standard verwendet wird. 5-HT erhalten in das Gewebe wird als pmol / mg Protein / min ausgedrückt.
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Representative Results
Immunfärbung in 3D Caco-2 Zysten ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Bild eines XY-Ebene zeigt gut abgegrenzte Lumen in der 3D - Zyste gefärbt mit Phalloidin Aktin ist in 1A dargestellt. Die Seite, die dem Lumen zugewandt bezeichnet die apikalen Seite. Epithelialen Zellen in einer 3D Umgebung Ergebnis in einem robusten epithelialen Phänotyp. Verschiedene Caco-2 Zysten am Tag 12, wenn Aktin und SERT waren co-gefärbt, sind in 1B gezeigt. In dieser Darstellung einer XY-Ebene ( die sich von der Ebene , in Figur 1A gezeigt), SERT - Färbung sichtbar ist , überwiegend in der luminalen Membran, zusammen mit Unter apikalen Färbung. 2 zeigt , dass SERT - Proteinspiegel sind höher in 3D Zysten im Vergleich mit Caco-2 - Zellen als Monoschichten auf dem 12. Tag postplating gezüchtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass die 3D-Kultur von Caco-2-Zellen können Signalereignisse ausgelöst werden, imitieren native Epithelien und führen zu einer erhöhten SERT Ausdruck. 3A zeigt die Gesamtübersicht und den Betrieb einer Ussing - Kammer - System und zeigt den montierten Dünndarm in den Stiften der Öffnung. Diese Technik ermöglicht die Bewertung der Aktivität des epithelialen Transportern in der nativen Darm. Der Vorteil der Ussing-Kammer-Ansatz ist die Fähigkeit, die Funktion der Transporter auf der luminalen (Schleimhaut) oder basolateralen (Serosa) Seite ausgedrückt zu beurteilen. Figur 4 veranschaulicht , 5-HT J ms Fluss (A) erhöht und um 5-HT - Akkumulation in der Ileumschleimhaut (B) in Reaktion auf TGF-β. Da TGF-β1 die Bewegung von radiomarkiertem 5-HT aus der Schleimhaut zu Serosaseite erhöht, wie durch die J ms dargestellt, sind diese Daten , die für eine Erhöhung der 5-HT - Aufnahme aus der luminalen Membran ileal Epithelzellen. Dies ist ein weiterer sich aus einer Erhöhung der Akkumulation von radiomarkiertem 5-HT in der Zelle, dieauf der luminalen Membran war empfindlich gegenüber Hemmung durch Fluoxetin, äußerte die Aktivität von SERT widerspiegelt.
Abbildung 1: Caco-2 , gewachsen auf einem Gelatinous Proteinmischung bei 12 d Distinct Lumen angezeigt. Rot: Aktin. Für die Immunfärbung von Caco-2 in 3D gezüchtet Zysten wurden die Zellen in einem 8-Well - Kammerobjektträger und gefärbt mit Phalloidin (A), wie zuvor von Debnath et al. 9. Für die Immunfärbung des 3D - Caco-2 - Kultur (B), Zysten wurden in 2% PFA für 30 min fixiert, mit PBS-Glycin behandelt und permeabilisiert mit 0,5% Triton-X-100 für 15 min bei RT. über Nacht bei 4 ° C: Nach dem Blockieren wurden die Zysten in SERT-Antikörper (100 1) inkubiert. Sie wurden dann gewaschen und mit Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (1: 200) und Phalloidin (1: 200)45 min bei RT. Schließlich wurden sie in Antifade enthält DAPI montiert. Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop erfasst. Maßstabsbalken: 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: SERT Protein Expression in Caco-2 - Zellen gezüchtet in 2D und 3D. Lysate von Caco-2-Zellen, die auf einem Kunststoffträger und Caco-2 3D-Kugeln durch SDS-PAGE aufgetrennt wurden, auf Nitrocellulose geblottet Membranen und mit dem SERT-Antikörper und GAPDH analysiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Abbildung 3: (A) Die Ussingkammer und "Schieber" mit den Stiften und Blende ein bereitgestelltes Maus Dünndarm zeigt. Slider Aperturfläche = 0,30 cm 2. Der Schieber passt in die beiden Hälften der Ussing-Kammer, die kompartimentiert sind. Elektrische Parameter, wie transepithelialen Spannungspotential (V t) wird durch ein Potentiometer und Elektroden gemessen (typischerweise Kalomel Halbzellen oder Ag-AgCl durch Salzbrücken an jede Kammerhälfte verbunden ist ). Salzbrücken sind im physiologischen Puffer (zB KBR) zum Baden der Schleimhaut verwendet geschmolzen von 3% Agar zusammengesetzt Veränderungen in der ionischen Zusammensetzung der Lösungen zu vermeiden. (B) Schematische Darstellung des Prinzips der Ussingkammer. Die gestrippte Darmschleimhaut wurde in den beiden Hälften der Ussing-Kammer Trennen der Schleimhaut und Serosa Kammern montiert. Radioaktive Tracer wurde an die Schleimhaut sid hinzugefügte; die Aufnahme wurde als die Menge an Radioaktivität, die von dem Gewebe aufgenommen gemessen, um den Gesamtproteingehalt normalisiert. Das Flussmittel wurde durch Messung der Radioaktivität in der Serosa Kammer über einen Zeitraum ausgewertet. Die Elektroden in der schematischen Darstellung gezeigt, ermöglichen die gleichzeitige Überwachung von elektrischen Parametern, die einschließlich Strom, Spannung und Widerstand. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Messung der SERT - Funktion in Ileumschleimhaut der seromuskuläre Schicht gestrippt. Ex vivo - Effekte der kurzfristigen TGF-β1 - Behandlung auf SERT Funktion in der Maus Ileum nachgewiesen durch die Messung der 3 [H] -5-HT - Aufnahme und 3 [H] -5-HT Flüsse der VerwendungUssingkammer. TGF-β1 - Behandlung (10 ng / ml, 1 h) auf der basolateralen Seite deutlich SERT Funktion erhöht, wie durch die erhöhte Na + -sensitiven belegt Schleimhaut-to-Serosa Fluss (J ms) (A) und 3 [H] - 5-HT - Aufnahme (B). Fluoxetin Behandlung des Ileumgewebe gehemmt TGF-β1-stimulierte 5-HT-Aufnahme. Fluoxetin empfindliche Aufnahme wurde das 2,5-fache von TGF-β1 erhöhte sich im Vergleich mit der Kontrolle. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Ein Einweg-ANOVA Tukey-Test wurde für die statistische Analyse verwendet. Berechnung von J ms Strom: [(CPM e - CPM s) x Verdünnungsfaktor] / [(. V std x Konz Substrat) CPM std / xtxa]. CPM e: counts per min am Ende der Flussmessung; CPM s: Counts pro min zu Beginn der Strommessung; CPM std: Zählungen pro min Standard (aus der Schleimhaut Reservoir genommen); V std: Volumen of der CPM std; t: Zeit des Flusses in h; a: Bereich der Öffnung (0,3 cm 2). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Ausdifferenzierten Monolayern Caco-2 - Zell haben ausgiebig Darm Transport zu studieren 10, 11, 12, 13, 14, 15 als polarisierte epitheliale Monolayern verwendet worden. Um jedoch die physiologischen Organisation der intestinalen Epithelzellen zu imitieren, hat es ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung eines Caco-2-Kultur in 3D wurde. Eine Reihe von 3D - Zellkulturmodelle für Darmepithelzellen kürzlich entwickelt worden , die native Zell-Zell und Zell-extrazellulären Matrix (ECM) -Wechselwirkungen mit größerer physiologische Relevanz als 2D - Systemen 16 zu imitieren. Somit ECM-basierten natürlichen Hydrogelen gemeinsame Komponenten (wie zB Laminin, Kollagen IV, und Heparinsulfat - Proteoglykan) enthalten , sind in großem Umfang für die Erzeugung von 3D Zellkulturen 16.
Das hier beschriebene Protokoll zeigt die Eignung von 3D-Caco-2 in gallertartig Proteinmischung gezüchteten Zellen (eine ECM-basierten natürlichen Hydrogel extrahiert aus Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maustumoren) für epithelialen Verkehrsforschung. Innerhalb von 10 Tagen beginnen die Zellen, die durch eine Schicht von Zellen und zeigen die Polarität, mit deutlichen apikalen und basolateralen Domänen umgeben einem hohlen Lumen zu bilden. Die Zelldichte zum Zeitpunkt der Aussaat auf einer gelatinösen Proteinmischung ist von entscheidender Bedeutung für die Bildung von regelmäßigen Zysten mit zentralem Lumen. Zur Färbung Experimenten haben wir 4.000 Zellen / Vertiefung eines 8-Kammer Schieber (gut Oberfläche: 0,7 cm 2). Aussäen Zellen bei einer höheren Dichte führt in unregelmäßigen Bereichen. Die 3D - Caco-2 - Zysten bei 10 - 12 Tage zeigen Polarität und mehr Differenzierung als 2D Caco-2 - Zellen auf Transwells gewachsen 17 (nicht veröffentlichte Beobachtungen). Wir haben einen deutlichen Anstieg der Expression von SERT mRNA und Protein-Ebene als comp gezeigtared 2D-Monolayern zu ausdifferenzierten. Auch diese Verfahren verwendet wird , haben wir gezeigt , dass TGF-TGF-β1 die Oberflächenniveaus SERT erhöht, wie durch Immunfluoreszenzfärbung 15 gezeigt.
Interessanterweise haben neuere Studien gezeigt , dass die 3D - Caco-2 - Zellen auf pathophysiologischen Stimuli reaktions sind wegen der Anwesenheit von kritischen Signalkomponenten, wie TNF - Rezeptor 2 und MyD88 und stellen ein besseres Modell als das herkömmliche 2D - System 17. ein Problem jedoch, dass die Verwendung von 3D-Caco-2 in epithelialen Verkehrsforschung begrenzt, ist das Fehlen der verschiedenen Zelltypen und die Komplexität, die im nativen Darm zu finden sind. In diesem Zusammenhang stellen Darm-Organoiden (auch als enteroids / colonoids bekannt) menschlichen oder Maus Herkunft eine state-of-the-art-Modell alle verschiedenen Zelltypen des nativen Epithel enthält den Transport von Ionen, Nährstoffe oder Medikamente zu untersuchen. Im Vergleich zu Organoiden, gutdifferenzierte 3D Caco-2 - Zysten repräsentieren eine Art von Epithelzellen (dh Absorptions Enterozyten) und sind für Studien sicherlich geeignet , um auf die zellulären und molekularen Mechanismen sind regeln Darm-Transportern. Dies ist, weil die 3D-Caco-2-Zellen bequem zu handhaben sind, sind kostengünstig, und sind leicht zu handhaben, wie zum Transfektionen von Plasmid-DNA und siRNAs. Eine weitere Einschränkung von 3D-Caco-2-Zellen in epithelialen Verkehrsforschung ist die Schwierigkeit, in das Lumen erreichbar. Mittel, die Membranrezeptoren luminalen oder infektiöse Erreger binden, die das Epithel von der luminalen Seite zugreifen können in diesem System zu studieren, eine Herausforderung sein. Diese Einschränkung kann durch Mikroinjektion der Mittel in das Lumen überwunden werden, wie zuvor in den Fällen der menschlichen Darm-organoiden Kultur von C. difficile - Infektionen 18 geschehen. Es ist jedoch wichtig , dass Studien in vitro in Zellkulturmodellen in der nativen i validiertntestine Verwendung in vivo oder ex vivo - Ansätzen.
Im Laufe der letzten Jahrzehnte hat die Ussingkammer wesentlich zur Anerkennung der funktionalen oder regulatorische Eigenschaften vieler epithelialer Transporter 19 beigetragen. Hier zeigen wir die Eignung des Ansatzes Ussing - Kammer 5-HT Flußmittel und 5-HT - Aufnahme in Maus Darmschleimhaut ohne den seromuskuläre Schicht 15 zu messen. TGF-β1 Behandlung der Ileumschleimhaut auf der basolateralen Seite (10 ng / ml, 1 h) signifikant SERT Funktion erhöht, wie durch eine erhöhte Na + -sensitiven belegt Schleimhaut-to-Serosa Fluss (J ms) und 3 H-5- HT - Aufnahme. Fluoxetin Behandlung des Ileumgewebe hemmte die TGF-β1-vermittelte Stimulation von 5-HT-Aufnahme.
Kritischen Schritte dieses Verfahrens umfassen Anbringen des Gewebes an der Schieberöffnung als intakte Schicht (ohne Reißen), um Achie ve genaue Messungen. Geeignete chirurgische Instrumente, wie Kugel Schere, Dünn Spitze Zange und chirurgische Klingen Feder, sind wichtig für die sachgemäße Handhabung und Abisolieren von Gewebe.
Dieses Verfahren ist für die Funktion anderer epithelialer Transporter zu studieren, wie Elektrolyt - Transporter (Transporter Chlorid, Na + / H + Austauscher, Nährstofftransport, etc.). Specialized Verwendungen des Ussingkammer-wie der pH - Stat - Technik, transepithelial Bicarbonat - Sekretion und die Isotopenflussverfahren zu messen, Nettosekretion oder Absorption von zu messen Substrate-wurden umfassend von Dr. Clarke et al überprüft. 8. Sie prüften ausgiebig die Anwendung der Ussing - Kammern zur Erforschung der Nährstofftransport 19. Mini Ussing Kammern haben auch in klinisch relevanten Situationen eingesetzt, wie zum Beispiel Transportfunktion in Biopsieproben zu messenref "> 20. Der Hauptvorteil der Ussing - Kammer - Technik über die umgestülpte sac Methode ist die Möglichkeit , gleichzeitig die elektrischen und Transportparameter an intaktem, polarisierter Darmepithel zu messen.
Ein Problem bei der Ussingkammer Methode ist die begrenzte Tragfähigkeit und optimale Funktion eines ex - vivo - Darm-Präparat. Nach der Entnahme aus dem Tier, die ex vivo Darm-Präparat kann nur dauern für bis zu 3 h in einer Ussingkammer 19. Somit kann dieses Verfahren außerdem Einschränkungen in die Wirkung von Mitteln für längere Zeitperioden zu testen. In solchen Fällen kann die Behandlung in vivo durchgeführt werden und dann Darm von Kontroll- und Behandlungsgruppen isoliert können verwendet werden , um die Transportparameter mit der Ussing - Methode zu messen. In allen Fällen kann die Größe des G t (oder R t) eine Echtzeit - Anzeige der Lebensfähigkeit und kann in Unterscheiden zwischen die nützlich sein ,spezifische und unspezifische Effekte der getesteten Reagenzien.
Zusammengefasst werden die hier beschriebenen Verfahren können unser Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen Regeln für die Funktion und Regulation der epithelialen Transporter in gesunden und krankhaften Zuständen, wie Darm-Entzündungen, infektiösen Durchfall, Malabsorption oder Stoffwechselstörungen erleichtern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
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