Summary
Descriviamo semplici metodi per studiare la regolazione del trasportatore della serotonina intestinale funzione (SERT) e l'espressione utilizzando una cella modello in vitro cultura di cellule Caco-2 cresciuto in 3D e un modello ex vivo di intestino di topo. Questi metodi sono applicabili allo studio di altri trasportatori epiteliali.
Abstract
L'epitelio intestinale ha importanti funzioni di trasporto e di barriera che giocano un ruolo chiave nei normali funzioni fisiologiche dell'organismo fornendo una barriera per particelle estranee. Impaired trasporto epiteliale (ioni, nutrienti, o farmaci) è stata associata a molte malattie e può avere conseguenze che si estendono al di là delle normali funzioni fisiologiche dei trasportatori, ad esempio influenzando l'integrità epiteliale e microbioma intestinale. La comprensione della funzione e regolazione delle proteine di trasporto è essenziale per lo sviluppo di migliori interventi terapeutici. La sfida più grande nello studio del trasporto epiteliale sta sviluppando un sistema modello adatto che ricapitola le caratteristiche importanti delle cellule epiteliali intestinali nativi. Diversi modelli in vitro di colture cellulari, come ad esempio Caco-2, T-84, e le cellule HT-29-Cl.19A sono tipicamente utilizzati nella ricerca sui trasporti epiteliale. Queste linee cellulari rappresentano un approccio riduzionista per modellare la postapithelium e sono stati utilizzati in molti studi meccanicistici, tra cui l'esame delle interazioni epiteliali-microbica. Tuttavia, monostrati cellulari non riflettono accuratamente le interazioni cellula-cellula e il microambiente in vivo. Cellule coltivate in 3D hanno dimostrato essere promettente modelli per Studi permeabilità droga. Abbiamo dimostrato che cellule Caco-2 in 3D possono essere utilizzati per studiare trasportatori epiteliali. È inoltre importante che gli studi in cellule Caco-2 sono integrate con altri modelli per escludere effetti specifici di cellule e tener conto della complessità dell'intestino nativo. Diversi metodi sono stati usati in precedenza per valutare la funzionalità dei trasportatori, come sac estroflesso e uptake in cellule epiteliali isolate o in vescicole di membrana plasmatica isolati. Prendendo in considerazione le sfide nel campo rispetto ai modelli e la misura della funzione di trasporto, dimostriamo qui un protocollo di crescere cellule Caco-2 in 3D e descrivere l'uso di una camera di Ussing comeapproccio efficace per misurare il trasporto della serotonina, come ad esempio negli epiteli intestinali polarizzate intatti.
Introduction
L'epitelio intestinale è dotato di varie proteine di trasporto (canali, ATPasi, co-trasportatori e scambiatori) che eseguono numerose funzioni che vanno dal l'assorbimento di nutrienti, elettroliti, e farmaci per la secrezione di fluido e ioni nel lume. proteine di trasporto generano gradienti elettrochimici che permettono il movimento di ioni o molecole in modo vettoriale. Questo risultato è ottenuto dalle distribuzioni asimmetriche dei sistemi di trasporto nelle membrane apicale e basolaterale delle cellule epiteliali polarizzate. Inoltre, giunzioni strette, che Tether cellule epiteliali adiacenti, svolgono un ruolo importante in questo processo servendo come un ostacolo alla diffusione intramembrane di componenti tra i domini di membrana apicale e basolaterale. Sistemi modello appropriato che mimano queste caratteristiche dell'intestino nativo (cioè polarità, la differenziazione e l'integrità di giunzione a tenuta) sono fondamentali per lo studio della functionalità dei sistemi di trasporto epiteliali.
Per quanto riguarda i modelli, le linee cellulari tipiche utilizzate attualmente nella ricerca sui trasporti epiteliale intestinale sono Caco-2, un modello di completamente differenziata, assorbenti piccole cellule epiteliali intestinali; e le cellule T84 o HT-29 subclones, modelli di grandi cellule epiteliali intestinali cripta di derivazione 1. Convenzionalmente, queste linee cellulari sono coltivate come monostrati in superfici in plastica o in inserti Transwell rivestiti. Trans pozzetti di coltura cellulare inserti in qualche misura assomigliano l'ambiente in vivo consentendo cellule polarizzate per alimentare basolaterally. Tuttavia, una limitazione in sistemi di coltura 2D convenzionali è che le cellule sono costretti ad adattarsi ad una superficie artificiale, piatta e rigida. Pertanto, la complessità fisiologica degli epiteli nativa non è accuratamente riflette in un sistema 2D. Questa limitazione è stato superato con metodi per crescere le cellule in 3D in un microambiente specifico, ad esempio Mixtur proteina gelatinosae, contenente una varietà di componenti della matrice extracellulare 2, 3. Tuttavia, le colture in vitro non possono simulare la complessità dell'epitelio intestinale, che ha più tipi di cellule e un'architettura specifica regione nell'intestino. Così, gli studi che utilizzano modelli di colture cellulari richiedono ulteriori convalida a livello intestinale nativo. Utilizzando la coltura cellulare in vitro 3D e della mucosa intestinale del mouse, descriviamo qui semplici metodi per studiare la regolazione del trasportatore della serotonina intestinale (SLC6A4, SERT).
Il trasportatore SERT regola la disponibilità extracellulare di un ormone importante neurotrasmettitore, 5-idrossitriptamina (5-HT), mediante una rapida trasportandolo attraverso un Na + / Cl - processo -dipendente. SERT è un bersaglio noto di anti-depressivi e ha recentemente emerso come un nuovo bersaglio terapeutico di disturbi gastrointestinali, come diarrea e infiammazione intestinale.Metodi per indagare 5-HT uptake in cellule epiteliali intestinali sono stati precedentemente descritto. Ad esempio, Caco-2 cellule cresciute su supporti plastici o inserti permeabili hanno dimostrato di presentare fluoxetina sensibile 3 H-5-HT uptake in entrambi i domini apicali e basolaterale 4. La misurazione della funzione SERT in isolato pennello Border membrana vescicole (BBMVs) preparato da donatori di organi umani intestino tenue è stata descritta anche da noi 5. 3 uptake H-5-HT in BBVMs umani è dimostrata fluoxetina sensibili e Na + / Cl - -dipendente, ed espone la cinetica di saturazione con K m di 300 nM 5. Utilizzando metodi simili, abbiamo anche precedentemente misurato funzione SERT come 3 H-5-HT assorbimento nel topo BBMVs intestinali 6. Tuttavia, la preparazione di vescicole di membrana plasmatica puri richiede una grande quantità di mucosa tessuti. Altri metodi, come la radiogvisualizzazione raphic di 3 siti di assorbimento H-5-HT, hanno anche dimostrato in precedenza nella cavia e topo piccolo intestino 7.
La camera di Ussing fornisce un sistema più fisiologico per misurare il trasporto di ioni, nutrienti e farmaci attraverso vari tessuti epiteliali. Il vantaggio principale della tecnica della camera Ussing è che permette la misurazione precisa dei parametri elettrici e di trasporto dei intatta, epitelio intestinale polarizzata. Inoltre, per ridurre al minimo l'influenza del sistema neuromuscolare intrinseca, strippaggio seromuscular della mucosa intestinale può essere eseguita per studiare la regolazione dei trasportatori nell'epitelio 8.
Abbiamo dimostrato che cellule Caco-2 cresciute in 3D sulla proteina gelatinosa formano un lume cave che esprimono i marcatori apicale e basolaterale distinte. Queste cellule mostrano più alta espressione di SERT di 2D cellule Caco-2. I metodi per crescere le cellule in 3D e per perform immunostaining o RNA e proteine di estrazione sono descritti. Inoltre, si descrivono i metodi per studiare la funzione del SERT e regolazione con il TGF-β1, una citochina pleiotropica, in piccola mucosa intestinale, utilizzando una tecnica di camera di Ussing.
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Protocol
1. Studio di intestinale Trasportatori in un sistema di coltura 3D di Caco-2: 3D crescente Caco-2 colture cellulari su una miscela proteica Gelatinoso
- fattore di crescita Scongelare ridotto miscela proteica gelatinosa in ghiaccio per 8 h (o O / N) a 4 ° C. Una volta scongelato, fare 1 ml o 500 aliquote microlitri per l'uso o conservare a -20 ° C per un uso successivo.
- Il giorno della cultura, preraffreddare le piastre di coltura (per RNA e proteine di estrazione) o diapositive Pompilius (per immunostaining) su ghiaccio. Aggiungere 30 ml di miscela proteica gelatinosa in ciascun pozzetto di una sagoma di vetro a camera a otto bene (o 120 ml per pozzetto di un 6-pozzetti) e distribuiti in modo uniforme. Fare attenzione a non generare bolle d'aria durante il processo.
- Porre i vetrini / piastre all'interno di un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C per 15 - 30 min e lasciare che la miscela proteica gelatinosa solidificare.
- Mentre la miscela proteica gelatinoso solidificazione, trypsinize un pallone confluenti di cellule Caco-2.
- Contare il numerodi cellule e girare a 500 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in 3D Caco-2 Medium, se necessario.
- Seed le diapositive da camera di vetro a 4.000 cellule per pozzetto (per piatti, 20.000 per pozzetto). Lasciare le cellule di crescere in un 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C. Cambiare media ogni 3 - 4 d.
2. immunofluorescenza colorazione per epiteliale Trasportatori in 3D cellule Caco-2: 1 ° giorno
- Aspirare il mezzo e fissare le cellule con 400 ml di 2% paraformaldeide (PFA) (in PBS con il pH regolato a 8,5 con NaOH) per 30 minuti a RT.
NOTA: soluzione PFA non deve essere conservata per più di 1 settimana a 4 ° C, e la soluzione preparata può essere utilizzato. ATTENZIONE: PFA è altamente tossico e un potenziale cancerogeno. Maneggiare sempre con cautela in una cappa chimica e l'utilizzo di dispositivi di protezione individuale. - Lavare i pozzetti due volte con PBS 1x e conservare i campioni a 4 ° C in PBS (400 microlitri /bene). Una volta fissato, conservarli a 4 ° C per un massimo di una settimana.
- Riscaldare le diapositive da camera a RT (questo si indurisce il letto miscela proteica gelatinosa e rendere più facile per aspirare durante le fasi di lavaggio).
- Permeabilize le cellule con 0,5% Triton in PBS per non più di 15 min.
- Preparare tampone PBS-glicina (130 mM NaCl, 7 mm Na 2 HPO 4, 3,5 mm NaH 2 PO 4, e 100 mm Glycine). Lavare 3x con PBS 1x-glicina per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente.
- Preparare tampone di immunofluorescenza (IF): 130 mm NaCl, 7 mm Na 2 HPO 4, 3,5 mm NaH 2 PO 4, 100 mM glicina, 7,7 mM NaN 3, 0,1% di BSA, 0,2% TritonX-100, e 0,05% di Tween-20 .
- Lavare 3x in se il buffer per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Blocco a 5% Normal Goat Serum (NGS) nel tampone IF. Incubare con l'anticorpo primario diluito in IF + 1% di siero di capra, 200 microlitri / bene, per 1 - 2 ore a temperatura ambiente. Lavare con tampone IF 3x per 10 minuti ciascuno.
- Incubare con l'anti secondariacorpo (1: 200) diluito in IF + 1% NGS, 200 microlitri / pozzetto, per 1 ora a RT.
- Lavare con tampone IF tre volte per 10 minuti ciascuno. Mantenere le diapositive nel buio da questo passo. Sollevare le camere plastica dai vetrini ponendo il vetrino camera in un supporto bianco e scorrevole un sollevatore bianco attraverso il supporto fino suoi contatti bordo del bordo dei pozzetti. Tirare delicatamente le camere (il titolare e sollevatore dovrebbe venire con le diapositive di cultura).
- Montare con anti medio-lenta dissolvenza e lasciare asciugare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Una volta asciugato completamente, sigillare i vetrini con smalto e loro immagine con microscopia confocale. Conservare i vetrini a 4 ° C per due settimane oa -20 ° C per diversi mesi.
3. RNA e proteine Estrazione da 3D cellule Caco-2
- Trattare le cellule coltivate in miscela proteica gelatinose per 12 - 14 d con un agente di test, come β1 TGF- (10 ng / ml, 1 h).
- Dopo il trattamento, lavare le cellule con 1x PBS. Mantenere le cellule in ghiaccio per 30 min per liquefare il miscuglio proteinico gelatinosa.
- Lavare i pozzetti con refrigerata PBS e raccogliere le cellule in provette da centrifuga singoli. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a bassa velocità a 500 xg e 4 ° C per 10 min. Estrarre l'RNA utilizzando le procedure standard e utilizzare in tempo reale RT-PCR.
- Per l'estrazione di proteine, la lisi delle cellule con 1x tampone di lisi cellulare integrato con inibitore della proteasi cocktail 1x. Dopo l'aggiunta di tampone di lisi cellulare al pellet, lisare le cellule mediante sonicazione e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 7.500 xg e 4 ° C per 10 min.
4. Misura della 5-HT assorbimento nel topo Ileum Utilizzando una Camera Ussing: intestinale Preparazione e Seromuscular Spogliarello
- Dopo l'eutanasia, sezionare i topi e rimuovere il piccolo intestino (dopo lo stomaco e prima del cieco). Dividere il piccolo intestino in tre parti. Eliminare il terzo mezzo, utilizzare il terzo prossimalecome digiuno, e utilizzare il terzo distale come ileo. Evitare di tirare l'intestino dal suo attaccamento mesenterica per evitare di danneggiare l'epitelio. Tenere il freddo sezione di tessuto coprendolo con ghiacciata Krebs-Ringer bicarbonato (KBR) tampone.
- Aprire l'intestino longitudinalmente con le forbici. Incubare sezioni intestinali asportati recentemente nelle ghiacciata, gassing KBR contenente 1 mM indometacina per 10 minuti prima che il seromuscular stripping.
- Pin la sezione intestinale (~ 1 cm di lunghezza) della mucosa rivolto verso il basso ad un piatto contenente 7% di agarosio o elastomero silicone vulcanizzato (spessore 0,5 cm).
- Striscia gli strati seromuscular allo stereomicroscopio dissezione con illuminazione di fondo. Tagliare lo strato seromuscular utilizzando una lama di bisturi piuma. Utilizzare una pinza sottile per ottenere il bordo dello strato lungo l'asse longitudinale dell'intestino.
NOTA: Durante la procedura di stripping, l'illuminazione di fondo dello stereomicroscopio aiuta a identificare ed evitare le zone con la patch di Peyeres. - Dopo il completamento del strippaggio seromuscular, montare la mucosa attenzione sui perni di una semicamera Ussing. Durante tutto il processo, fare attenzione a tenere il tessuto mucoso spogliato dai bordi per evitare di strapparla.
5. Equilibration e trattamento del tessuto
- Preparare la soluzione di Krebs: 115 mm NaCl, 25 mM NaHCO 3, 2,4 mm K 2 HPO 4, 1,2 mm CaCl 2, 1,2 mm MgCl 2 e 0,4 mm KH 2 PO 4 a pH 7,4, gasati con il 95% O 2/5% CO 2 a 37 ° C. Aggiungere 10 mM di glucosio al bagno sierosa per servire come substrato energetico e 10 mM di mannitolo al bagno mucosa per mantenere l'equilibrio osmotico.
NOTA: soluzione di Krebs è completato con l'acido L-ascorbico (100 mM) e pargilina (100 pM, inibitore di monoammina ossidasi) per impedire la degradazione intracellulare 5-HT. - Inserire il cursore nella camera per esporre sia il (luminale) si apicalede e il (sierosa) lato basolaterale del tessuto di soluzione di Krebs.
- Dopo un periodo di equilibrazione di 10 min, pretrattare il tessuto ileale con fluoxetina (10 pM) per 30 min sul lato apicale per J ms (flusso mucosa-to-sierosa).
- Trattare il tessuto con TGF-β1 (10 ng / ml) per 1 h sul lato basolaterale e poi incubare con 3 [H] -5-HT (20 nM) per 30 min sul lato apicale.
6. Quantificazione delle mucose per sierosa Flux (J ms) e 3 [H] -5-HT accumulo nel tessuto
- Raccogliere 0,75 aliquote mL dal serbatoio sierosa (totale di 5 ml) per misurare la radioattività in un contatore a scintillazione liquida e per il calcolo della mucosa-to-sierosa (J ms) tassi di flusso; fluoxetina sensibile flusso rappresenta SERT-mediata 3 [H] -5-HT assorbimento.
- Per evitare differenze di pressione idrostatica attraverso la mucosa durante un periodo di flusso, prelevare campioni dal lato sierosa e rimetterli con volumi identici di media bagno.
NOTA: Il calcolo del flusso corregge per la diluizione del campione finale (4.25 mL / 5 ml = 0.85). - Per la quantificazione dei 3 [H] -5-HT accumulato nel tessuto, smontare la mucosa dal cursore, lavare una volta con tampone KRB ghiacciata, e metterlo in tubi di coltura in vetro.
- Incubare la mucosa in 0,5 mL di 10% KOH notte a 37 ° C. Misurare la radioattività in 150 microlitri aliquote dei lisati (in triplice copia) utilizzando un contatore a scintillazione liquida.
- Utilizzare aliquote (3 - 5 microlitri) dei lisati per misurare la concentrazione di proteine utilizzando il metodo Bradford.
NOTA: 10 mL di mezzo di incubazione contenente serotonina radioattiva è utilizzato come standard. 5-HT trattenuto nel tessuto è espressa come pmol / mg proteine / min.
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Representative Results
Immunocolorazione in 3D Caco-2 cisti è mostrato in Figura 1. Una immagine rappresentativa di un piano XY mostrando lume ben delimitate-in cisti 3D macchiato di falloidina actina è mostrata in figura 1A. Il lato rivolto verso il lume denota il lato apicale. Le cellule epiteliali in coltura in un risultato ambiente 3D in un robusto fenotipo epiteliale. Diversi Caco-2 cisti il giorno 12, quando actina e SERT sono stati co-macchiato, sono mostrati in figura 1B. In questa rappresentazione di un piano XY (diverso dal piano mostrato in Figura 1A), SERT colorazione è visibile, prevalentemente nella membrana luminale, insieme con colorazione sub-apicale. La Figura 2 mostra che i livelli di proteina SERT sono più alti in cisti 3D rispetto al Caco-2 cellule cresciute in monostrato il giorno postplating th 12. Questi dati suggeriscono che la cultura 3D di cellule Caco-2 può innescare eventi di segnalazione che imitano nativa epiteli e comportare un aumento dell'espressione del SERT. Figura 3A illustra una panoramica generale e il funzionamento di un sistema di camera di Ussing e mostra tenue montato nei perni dell'apertura. Questa tecnica permette la valutazione dell'attività dei trasportatori epiteliali nell'intestino nativa. Il vantaggio dell'approccio camera di Ussing è la capacità di valutare la funzione dei trasportatori espressi sulla luminale (mucosa) o basolaterale laterale (sierosa). Figura 4 dimostra aumentata 5-HT J ms flusso (A) e aumentato accumulo 5-HT nella mucosa ileale (B) in risposta a TGF-β. Poiché TGF-β1 aumentato il movimento radiomarcato 5-HT dalla mucosa al lato sierose, come rappresentato dalle ms J, questi dati sono indicativi di un aumento 5-HT assorbimento dalla membrana luminale delle cellule epiteliali ileali. Questo è anche evidente da un aumento nell'accumulo di radiomarcato 5-HT nella cella, cheera sensibile all'inibizione da fluoxetina, riflettendo l'attività di SERT espressa sulla membrana luminale.
Figura 1: Caco-2 coltivate su una miscela proteica gelatinoso al 12 d Mostrando distinto Lumen. Rosso: actina. Per l'immunocolorazione di Caco-2 cisti coltivato in 3D, le cellule sono state coltivate in una slitta 8 pozzetti chambered e colorati con falloidina (A), come descritto in precedenza da Debnath et al. 9. Per immunocolorazione cultura 3D Caco-2 (B), cisti sono state fissate in 2% PFA per 30 min, trattati con PBS-glicina, e permeabilizzate con 0,5% Triton-X-100 per 15 minuti a RT. Dopo il blocco, le cisti sono state incubate in anticorpi SERT (1: 100) notte a 4 ° C. Esse sono state quindi lavate e incubate con anticorpi fluorescenza coniugati secondari (1: 200) e phalloidin (1: 200)per 45 minuti a RT. Infine, sono stati montati in antifade contenente DAPI. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio confocale. barra della scala: 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: SERT espressione della proteina in cellule Caco-2 cresciute in 2D e 3D. Lisati da cellule Caco-2 coltivate su un supporto di plastica e Caco-2 3D sfere sono state risolte mediante SDS-PAGE cancellati su membrane di nitrocellulosa e analizzati con l'anticorpo SERT e GAPDH. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
![Figura 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Figura 3: (A) La camera Ussing e "slider" con i perni e diaframma mostrano un mouse montato intestino tenue. Slider superficie di apertura = 0,30 centimetri 2. Il cursore si inserisce nelle due metà della camera di Ussing, che sono in compartimenti. I parametri elettrici, quali potenziale di tensione transepiteliale (V t), viene misurata da un potenziometro e gli elettrodi (tipicamente calomelano semicelle o Ag-AgCl sono collegati da ponti salini per ogni metà da camera). Ponti salini sono composti da 3% agar sciolto in tampone fisiologico (ad esempio, KBR) usato per il bagno mucosa per evitare alterazioni della composizione ionica delle soluzioni. (B) Schema del principio della camera di Ussing. La mucosa intestinale spogliato stato montato in due metà della camera di Ussing separa le camere mucose e sierose. tracciante radioattivo è stata aggiunta al sid mucosae; l'assorbimento è stata misurata come la quantità di radioattività incorporata dal tessuto, normalizzato al contenuto totale di proteine. Il flusso è stata valutata misurando la radioattività nella camera sierosa per un periodo di tempo. Gli elettrodi mostrati nello schema consentono il monitoraggio simultaneo dei parametri elettrici, l'attuale, la tensione e la resistenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Misura della Funzione SERT in ileale Mucosa Spogliato dello strato Seromuscular. Ex vivo effetti del trattamento TGF-β1 a breve termine sulla funzione SERT nell'ileo del mouse, dimostrato attraverso la misurazione di 3 [H] -5-HT assorbimento e 3 [H] -5-HT fondenti con ilUssing camera. Trattamento TGF-β1 (10 ng / ml, 1 h) sul lato basolaterale aumentato significativamente la funzione SERT, come evidenziato dall'aumento della Na + sensibile mucosa-to-sierosa flusso (J ms) (A) e 3 [H] - 5-HT uptake (B). trattamento con fluoxetina del tessuto ileale inibito TGF-β1-stimolata 5-HT assorbimento. uptake Fluoxetina sensibili è stata aumentata di 2,5 volte dal TGF-β1 rispetto al controllo. I risultati sono rappresentati come media ± SEM. Un test ANOVA di Tukey è stato utilizzato per l'analisi statistica. Calcolo del ms flusso J: [(CPM e - CPM s) x fattore di diluizione] / [(. V STD x conc di substrato) CPM std / xtxa]. CPM e: conteggi per minuto al termine della misurazione del flusso; CPM s: conteggi per minuto all'inizio della misurazione del flusso; CPM std: conteggi per minuto di standard (preso dal serbatoio della mucosa); V std: il volume of std CPM; t: tempo di flusso nel h; un: area del diaframma (0,3 cm 2). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Monostrati di cellule Caco-2 completamente differenziati sono stati ampiamente utilizzati come polarizzato monostrati epiteliali per studiare il trasporto intestinale 10, 11, 12, 13, 14, 15. Tuttavia, per imitare l'organizzazione fisiologica delle cellule epiteliali intestinali, c'è stato un considerevole interesse per lo sviluppo di una cultura Caco-2 in 3D. Un certo numero di modelli di coltura cellulare 3D per cellule epiteliali intestinali sono stati recentemente sviluppati che imitano matrice nativa cellula-cellula e cellula-extracellulare (ECM) interazioni con maggiore rilevanza fisiologica rispetto ai sistemi 2D 16. Così, ECM basata idrogel naturali contenenti componenti comuni (come laminina, collagene IV e eparina solfato proteoglicani) sono ampiamente utilizzati per la generazione di colture cellulari 3D 16.
Il protocollo qui descritto dimostra l'idoneità di cellule Caco-2 3D coltivate in miscela proteica gelatinosa (un idrogel naturale ECM basate su estratti da tumori di topo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)) per la ricerca sui trasporti epiteliale. Entro 10 giorni, le cellule iniziano a formare un lume cavo circondato da uno strato di cellule e mostrano polarità, con i domini apicale e basolaterale distinte. La densità delle cellule al momento della semina su una miscela proteica gelatinosa è critica per la formazione di cisti regolari con lume centrale. Per gli esperimenti di colorazione, abbiamo aggiunto 4.000 cellule / pozzetto di uno scivolo (ben superficie: 0,7 cm 2) 8-camera. Semina cellule a un più alto risultato della densità di sfere irregolari. Il 3D Caco-2 cisti a 10 - 12 giorni Mostra polarità e una maggiore differenziazione di 2D Caco-2 cellule coltivate su transwells 17 (osservazioni non pubblicate). Abbiamo mostrato un marcato aumento nell'espressione di SERT mRNA e di proteina compared a monostrati 2D completamente differenziate. Inoltre, utilizzando questi metodi, abbiamo dimostrato che TGF-TGF-β1 aumenta i livelli superficiali di SERT, come dimostrato da immunofluorescenza 15.
Studi recenti hanno dimostrato che il 3D cellule Caco-2 sono più sensibili agli stimoli fisiopatologici per la presenza di componenti di segnalazione critiche, come TNF receptor 2 e MyD88, e rappresentano un modello migliore rispetto al sistema convenzionale 2D 17. Tuttavia, un problema che limita l'uso di 3D Caco-2 nella ricerca sui trasporti epiteliale è la mancanza di diversi tipi cellulari e la complessità che si trovano nell'intestino nativa. A questo proposito, organoidi intestinali (noto anche come enteroids / colonoids) di origine umana o del mouse rappresentano un modello state-of-the-art che contiene tutti i diversi tipi di cellule di epitelio nativo per studiare il trasporto di ioni, sostanze nutritive, o farmaci. Rispetto al organoidi, bendifferenziata 3D Caco-2 cisti rappresentano un tipo di cellule epiteliali (cioè enterociti di assorbimento) e sono certamente adatti per studi incentrati sui meccanismi cellulari e molecolari che regolano trasportatori intestinali. Questo perché le cellule 3D Caco-2 sono comodi da gestire, sono costo-efficaci, e sono facili da manipolare, come ad esempio per trasfezioni di DNA plasmidico e siRNA. Un'altra limitazione di cellule Caco-2 3D nella ricerca sui trasporti epiteliale è la difficoltà di accesso al lume. Gli agenti che si legano ai recettori di membrana luminale o ad agenti infettivi che accedono l'epitelio dal lato luminale possono essere difficili da studiare in questo sistema. Questa limitazione può essere superata microinjecting agenti nel lume, come è stato fatto in precedenza nel caso di coltura organoide intestinale umano per C. infezioni difficile 18. E 'tuttavia importante che gli studi in modelli di coltura cellulare in vitro sono convalidati in i nativontestine utilizzando in vivo o ex vivo approcci.
Nel corso degli ultimi decenni, la camera Ussing ha contribuito notevolmente al riconoscimento delle proprietà funzionali o normativi di molti trasportatori epiteliali 19. Qui mostriamo l'idoneità dell'approccio camera di Ussing per misurare flusso 5-HT e 5-HT assorbimento nel topo mucosa intestinale privo dello strato seromuscular 15. Trattamento TGF-β1 della mucosa ileale sul lato basolaterale (10 ng / ml, 1 h) significativamente aumentata funzione SERT, come evidenziato dall'aumento della Na + sensibile mucosa-to-sierosa flusso (J ms) e 3 H-5- HT assorbimento. trattamento con fluoxetina del tessuto ileale inibita la stimolazione TGF-β1-mediata di 5-HT assorbimento.
Passaggi critici di questa tecnica includono montare il tessuto sul diaframma diapositiva come strato intatto (senza strappi) per Achie ve misurazioni accurate. strumenti chirurgici appropriati, come forbici, pinze a sfera sottile punta, e lame chirurgiche di piume, sono importanti per la gestione appropriata e stripping del tessuto.
Questo metodo è applicabile per studiare la funzione di altri trasportatori epiteliali, come trasportatori di elettroliti (trasportatori cloruro, Na + / H + scambiatori, trasportatori di nutrienti, ecc). Usi specializzati del Ussing camera-come la tecnica stat pH, per misurare transepiteliale la secrezione di bicarbonato, e il metodo di flusso isotopica, per misurare la secrezione di rete o l'assorbimento di substrati-sono stati rivisti globalmente dal Dr. Clarke et al. 8. Essi ampiamente recensione all'applicazione di Camera di Ussing allo studio del trasporto dei nutrienti 19. camere Mini Ussing sono state utilizzate anche in situazioni clinicamente rilevanti, ad esempio per misurare funzione di trasporto in campioni biopticiref "> 20. Il principale vantaggio della tecnica camera di Ussing rispetto al metodo sac estroflesso è la capacità di misurare simultaneamente i parametri elettrici e di trasporto dei intatta, epitelio intestinale polarizzata.
Una preoccupazione con il metodo della camera Ussing è la vitalità limitata e la funzione ottimale di una preparazione intestinale ex vivo. Dopo la rimozione dall'animale, la preparazione intestinale ex vivo può durare solo per un massimo di 3 ore in una camera Ussing 19. Così, questo metodo può avere limitazioni nel testare l'effetto di agenti per periodi di tempo più lunghi. In tali casi, il trattamento può essere eseguito in vivo e quindi isolato intestini dal controllo e di trattamento gruppi possono essere utilizzati per misurare i parametri di trasporto con il metodo Ussing. In tutti i casi, la grandezza del G t (o R t) può essere un indicatore in tempo reale della redditività e può essere utile nel discriminare tra ileffetti specifici e non specifici di reagenti testati.
In sintesi, i metodi descritti qui possono facilitare la nostra comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari che regolano la funzione e la regolazione dei trasportatori epiteliali in condizioni di sani e malati, come l'infiammazione intestinale, diarrea infettiva, malassorbimento, o disturbi metabolici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
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