Summary
우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다.
Abstract
장 상피 세포는 이물질에 대한 장벽을 제공하면서 신체의 정상적인 생리 기능에 중요한 역할을 중요 전송 및 장벽 기능이 있습니다. 손상된 상피 전송 (이온 영양 또는 약물)는 많은 질환과 관련되어 있으며, 상피 무결성 및 장내 마이크로 바이 영향으로 같은 컨베이어의 정상적인 생리 학적 기능을 넘어 연장 결과를 가져올 수있다. 기능 및 수송 단백질의 조절을 이해하는 것은 개선 된 치료 적 개입의 발전을 위해 중요하다. 상피 수송의 연구에서 가장 큰 문제는 네이티브 장 상피 세포의 중요한 기능 되풀이되었습니다 적합한 모델 시스템을 개발하고있다. 예컨대 카코-2, T-84, 및 HT-29 세포 Cl.19A 여러 시험 관내 세포 배양 모델은 일반적으로 상피 전송 연구에 사용된다. 이 세포주는 전자를 모델링에 환원 접근 방식을 나타냅니다pithelium 및 상피 미생물 작용들의 검사를 포함한 다양한 역학적 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 세포 단일 층 정확하게 세포 - 세포 상호 작용과 생체 내 미세 환경을 반영하지 않습니다. 3D에서 자란 세포는 약물 투과 연구 모델 유망한 것으로 도시 하였다. 우리는 3 차원의 카코 -2 세포는 상피 수송을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 카코 2 세포 연구는 세포 특정 효과를 배제하고 계정에 기본 대장의 복잡성을 다른 모델로하고 있습니다 것이 중요하다. 여러 방법들이 이전에 이러한 절연 상피 세포 또는 절연 세포막 소포에 everted SAC와 같은 흡수 수송의 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 모델에 대한 및 수송 기능의 측정을 고려하여 현장에서 문제를 가지고, 여기에서 3D 카코 -2 세포 성장과 같은 Ussing 챔버의 사용을 설명하기위한 프로토콜을 보여효과적인 접근법은 그대로 편광 장내 상피 같이 세로토닌 수송을 측정한다.
Introduction
장 상피 세포는 루멘에 유체의 분비 및 이온 다양한 수송 단백질 (채널, -ATPase를, 공동 운송 및 기) 영양소, 전해질의 흡수에 이르기까지 다양한 기능을 수행하고, 마약을 갖추고있다. 수송 단백질이 방식의 vectorial 이온 또는 분자의 이동을 허용하는 전기 화학적 구배를 생성한다. 이것은 편광 상피 세포의 정단 및 기저 세포막 반송 시스템의 비대칭 분포에 의해 달성된다. 또한, 인접하는 상피 세포 밧줄 단단한 접합부는 꼭대기 및 기저 멤브레인 도메인 사이 intramembrane 성분의 확산에 대한 장벽으로서이 과정에서 중요한 역할을한다. 네이티브 소장의 이러한 특징적인 기능을 흉내 낸 적합한 모델 시스템 (즉, 극성, 분화, 꽉 접합 무결성)은 능의 연구에 중요한상피 교통 시스템의 된 스위치들.
모델에 관해서는, 장 상피 전송 연구에 현재 사용되는 전형적인 세포주는 카코이 완전히 분화의 모델이다 소장 상피 세포를 흡수; 및 T-84 세포 또는 HT-29 서브 클론, 토굴에서 파생 된 큰 장 상피 세포 하나의 모델. 통상적으로, 이러한 세포 라인은 플라스틱 표면에 단일 층 또는 코팅 된 트랜스 웰 인서트에서 재배된다. 어느 정도 트랜스 웰 세포 배양 인서트 편광 세포 basolaterally 공급할 수 있도록하여 생체 내 환경을 닮은. 그러나, 종래의 2 차원 배양 시스템에 제한은 세포가 인공 편평하고 단단한 표면에 적응하도록 강요된다는 것이다. 따라서, 원시 상피 생리 복잡성 정확하게 차원 시스템에 반영되지 않는다. 이 제한은 예컨대 젤라틴 단백질 mixtur 같은 특정 미세 차원에서 세포를 성장하는 방법에 의해 극복되었다즉, 세포 외 매트릭스 성분 (2, 3)의 종류를 포함. 그럼에도 불구하고, 체외 배양 여러 세포 유형과 장내 영역 특정 구조를 갖는 장 상피의 복잡성을 시뮬레이션 할 수있다. 따라서, 세포 배양 모델을 이용하여 연구를 기본 대장에 추가 검증을 요구한다. 체외 3D 세포 배양 및 마우스 장 점막을 사용하여, 우리는 장 세로토닌 수송 (SLC6A4, SERT)의 조절을 연구하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명합니다.
의존적 과정 - SERT 수송이 급격히 나 + / CL을 통해 운반하여, 중요한 호르몬 및 신경 전달 물질 5- 하이드 록시 (5-HT)의 세포 외 가용성을 조절한다. SERT는 항우울제의 알려진 대상 최근 설사와 장의 염증과 같은 위장관 질환의 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다.방법은 장내 상피 세포에서 5-HT의 흡수가 이전에 기술 된 조사합니다. 예를 들어, 플라스틱 또는 투과성 지지체 인서트 성장 카코 -2 세포는 정단 및 기저 영역에서 모두 4 플루옥세틴 성 3 H-5-HT 흡수를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 인간 장기 기증자 소장으로부터 제조 된 절연 브러시 테두리 막 소포 (BBMVs)에 SERT 함수의 측정은 또한 우리 (5)에 의해 설명되었다. 인간 BBVMs 3 H-5-HT 흡수는 플루옥세틴 성 및 나트륨 + / CL 것으로 나타났다 - 의존성과는 300 K에서 5 nM의 m 포화 동력학을 나타내었다. 유사한 방법을 활용, 우리는 이전에 마우스 장 BBMVs 6 세 H-5-HT 흡수로 SERT 기능을 측정 하였다. 그러나, 순수한 세포막 소포의 제조 조직 점막 많은 양을 필요로한다. 예 radiog 같은 다른 방법3 H-5-HT 흡수 사이트의 raphic 시각화는 또한 기니 돼지와 쥐 소장 (7) 이전에 표시되었습니다.
Ussing 챔버 여러 상피 조직에 걸쳐 이온, 영양분, 약물의 이동을 측정하는 이상의 생체 시스템을 제공한다. Ussing 챔버 기술의 주요 장점은 그대로 편광 장 상피의 전기 및 전송 파라미터의 정확한 측정을 가능하게한다는 것이다. 또한, 내장 신경 근육 시스템의 영향을 최소화하기 위해, 장 점막의 seromuscular 박리는 상피 8 수송의 조절을 조사하기 위해 수행 될 수있다.
우리는 젤라틴 단백질에 3D로 성장 카코이 세포는 별개의 혀끝과 기저 마커를 발현하는 중공 루멘을 형성하는 것을 보여줍니다. 이 세포들은 2D 카코이 세포에 비해 SERT의 높은 표현을 보여줍니다. 방법 3D 세포를 성장하고 퍼가기하기rform의 면역 염색 또는 RNA 및 단백질 추출 기술되어있다. 또한, 우리는 Ussing 챔버 기술을 이용하여, 소장 점막 TGF-β1하는다면 발현 성 시토 킨에 의해 SERT 및 규제 기능을 연구하는 방법을 설명한다.
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Protocol
젤라틴 단백질 혼합물에 성장 3D 카코 2 세포 배양 : 카코 2의 3D 문화 시스템에 소장 전송기 1. 연구
- 해동 성장 인자는 8 시간 동안 얼음에 젤라틴 단백질 혼합물을 감소 (또는 O / N) 4 ℃에서. 일단 1 mL를하거나 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 사용하거나 보관 500 μL 씩을, 해동.
- 문화의 날, 얼음에 문화 (RNA 및 단백질 추출을위한) 판 또는 (면역 염색 용) 챔버 슬라이드를 사전 냉각. 여덟 잘 챔버 유리 슬라이드 (또는 6 웰 플레이트의 웰 당 120 μL)의 각 웰에 젤라틴 단백질 혼합물의 30 μL를 추가하고 균일하게 확산. 과정에서 기포가 발생하지 않도록주의하십시오.
- (15) 37 ℃에서 세포 배양 용 인큐베이터 안에서 슬라이드 / 플레이트 플레이스 - 30 분, 젤라틴 단백질 혼합물을 응고 할 수있다.
- 젤라틴 단백질 혼합물이 응고하는 동안, 카코 -2 세포의 합류 플라스크를 Trypsinize.
- 수를 계산세포의 5 분 탁상 원심 분리기 500 XG에서 그들을 스핀. 필요한 3D 카코이 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시.
- (플레이트 잘 당 20,000) 잘 4,000 세포에서 유리 챔버 슬라이드를 시드. 세포를 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 성장 가습 할 수있다. 4 D - 매체 매 3을 변경합니다.
3D 카코이 세포의 상피 전송기 2. 면역 형광 염색법 : 1 일
- 배지를 흡인하고 RT에서 30 분 동안 (NaOH로 8.5로 조정하여 pH PBS)에서 2 % 파라 포름 알데히드 400 μL (PFA)으로 세포를 고정한다.
주 : PFA 용액을 39 ° C에서 이상 1 주간 저장해서는 안되며 갓 만든 용액을 사용할 수있다. 주의 : PFA는 매우 독성 및 잠재적 인 발암 물질이다. 항상 화학 후드주의 및 개인 보호 장비를 사용하여 그것을 처리 할 수 있습니다. - (1X PBS로 두 번 우물을 씻어 PBS에 4 ° C에서 슬라이드를 저장하는 400 μL /잘). 일단 고정, 최대 일주일 동안 4 ° C에 저장합니다.
- RT로 챔버 슬라이드 (이는 젤라틴 단백질 혼합물 층을 경화하고, 세척 단계 동안에 흡하기 쉽게 만들) 가온.
- 더 이상 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤으로 세포를 Permeabilize 하시려면.
- PBS-글리신 완충액 (130 mM의 염화나트륨, 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100 mM의 글리신)을 준비합니다. RT에서 10 분마다 1X PBS-글리신과 함께 배를 씻어.
- 면역 완충액 (IF)를 제조 하였다 : 130 mM의 염화나트륨을 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100mM의 글리신, 7.7 mM의 NaN이 3, 0.1 % BSA, 0.2 % 트리톤-100, 0.05 % 트윈 -20 .
- IF의 워시 배 실온에서 10 분마다 버퍼. 5 %의 블록 IF 버퍼에 정상 염소 혈청 (NGS). IF + 1 % 염소 혈청 희석 차 항체, 200 μL에 품어 / 웰, 1 - 실온에서 2 시간. 10 분마다 IF 버퍼 3 배 씻으시오.
- 이차 항에 품어본체 (1 : 200)을 실온에서 1 시간 동안, IF + 1 % NGS 200 μL / 웰의 희석.
- 10 분마다 IF 버퍼로 3 회 씻는다. 이 단계에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다. 가장자리 연락처 우물의 가장자리까지 홀더를 통해 흰색 리프터 검은 색 홀더에 챔버 슬라이드를 배치하고 슬라이딩하여 유리 슬라이드에서 플라스틱 챔버를 들어 올립니다. 조심스럽게 챔버 (홀더 및 리프터는 문화 슬라이드와 함께합니다)를 잡아 당깁니다.
- 느린 안티 - 페이드 매체를 탑재하고 실온에서 10 분간 건조 할 수 있습니다.
- 완전히 건조되면, 매니큐어 및 공 초점 현미경과 이미지를 함께 슬라이드를 밀봉. 2 주 또는 몇 달 동안 -20 ° C에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.
3D 카코 -2 세포 3. RNA와 단백질 추출
- 이러한 TGF-β1의 같은 시험 제제와 함께 14 일 (10 NG / ㎖, 1H) - (12) 젤라틴 단백질 혼합물에서 배양 세포를 처리한다.
- 치료 후 1 셀을 씻어X PBS. 30 분은 젤라틴 단백질 혼합물을 액화하는 얼음에 세포를 유지합니다.
- 냉장 PBS로 우물을 세척하고 각각의 원심 분리기 튜브에 세포를 수집합니다. 500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 저속 원심 분리하여 세포를 수집한다. 표준 절차를 사용하여 RNA를 추출하고 실시간 RT-PCR을 사용합니다.
- 단백질 추출을 위해, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (1X)로 보충 된 세포 용해 완충액을 사용하여 세포를 용균. 펠렛을 세포 용해 완충액을 첨가 한 후, 초음파 처리로 세포를 용균 및 7,500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거한다.
Ussing 챔버 활용 마우스 회장의 5-HT 통풍 관 4. 측정 : 창자 준비 및 Seromuscular 스트립 댄스
- 안락사 후, 쥐를 해부하고 (위 후 맹장 전) 작은 창자를 제거합니다. 세 부분으로 소장을 나눈다. 중간 제를 폐기 근위 제를 사용공장으로, 그리고 회장 등 원위 세 번째를 사용합니다. 상피의 손상을 방지하기 위해 장간막 첨부 파일에서 장을 당겨하지 마십시오. 얼음처럼 차가운 크렙스 - 링거 중탄산 (KBR) 버퍼를 덮어 조직 섹션 감기를 유지합니다.
- 세로로 가위를 사용하여 장을 엽니 다. KBR은 seromuscular를 제거하기 전에 10 분 동안 1 μM의 인도 메타 신 (indomethacin)를 포함하는 가스를 발산, 얼음처럼 차가운에서 갓 절제 장 섹션을 품어.
- 7 % 아가 로스 또는 경화 된 실리콘 엘라스토머 (0.5 cm 두께)를 포함하는 플레이트에 아래 장내 부 (길이 1 ~ cm) 점막 측에 핀.
- 바닥 조명 해부 실체 현미경 하에서 seromuscular 층을 제거. 깃털 메스 블레이드를 사용하여 seromuscular 층을 잘라. 소장의 길이 방향 축을 따라 층의 에지를 얻는 미세 집게를 사용한다.
참고 : 제거 절차 동안, 실체 현미경의 바닥 조명 파이어 판으로 영역을 파악하고 방지하는 데 도움이에스. - seromuscular 탈기 종료 후, 반 Ussing 챔버의 핀을 잘 점막 마운트. 전체 과정 동안, 찢어지지 않도록 가장자리에 의해 제거 점막 조직을 유지하도록주의하십시오.
5. 평형 및 조직 치료
- Kreb의 용액 조제 : 115 mM의 염화나트륨, 25 mM의 NaHCO3을을 2.4 mM의 K 2 HPO 4, 1.2 mM의 CaCl2를 1.2 밀리미터의 MgCl 2, 95 % O 2 / 5 %로 가스실 pH가 7.4에서 0.4mm의 KH 2 PO 4, 37 ° C에서 CO 2. 삼투압 균형을 유지하기 위해 점막 화장실에 에너지 기판과 10 mM의 만니톨로 사용하기 위해 장막 욕조에 10 mM의 포도당을 추가합니다.
참고 Kreb의 용액을 세포 내 5-HT의 열화를 방지하기 위해 L 아스코르브 산 (100 μM) 및 질라 (100 μM, 모노 아민 옥시 다제 억제제)로 보충된다. - 꼭대기 (내강)시 모두 노출 챔버로 슬라이더를 삽입드와 Kreb의 솔루션에 대한 조직의 기저 (장막) 측.
- 10 분의 평형 기간 후, J 밀리 초 (점막 - 투 - 장막 플럭스)의 정점 측에 30 분 동안 플루옥세틴 (10 μM)과 회장 조직을 전처리.
- 기저 측에서 1 시간 동안 TGF-β1 (10 NG / mL)로 조직을 치료하고 근단 측에서 30 분 동안 3의 H] -5-HT (20 ㎚)와 함께 배양한다.
장막 플럭스 (J 밀리 초) 및 3의 H] 티슈에 -5-HT의 축적에 점막의 6 정량화
- 액체 섬광 계수기의 방사능을 측정하고 점막 - 투 - 장막 (J 밀리 초) 유동 비율을 계산하기 위해 (총 5 ㎖의)에 장막 저수지에서 0.75 mL를 분취 액을 수집; 플루옥세틴에 민감한 플럭스는 3 [H] -5-HT 흡수를 SERT이 매개 나타냅니다.
- 장막 측과 재에서 샘플을 채취, 플럭스 기간 동안 점막에서 수압 차이를 방지하려면목욕 매체의 동일한 볼륨에 배치합니다.
참고 : 플럭스 계산은 최종 샘플 (4.25 ㎖ / 5 ㎖ = 0.85)의 희석 수정합니다. - 3의 H] 조직에 축적 -5-HT의 정량화를 들어, 슬라이더에서 점막을 분리 얼음처럼 차가운 KRB 버퍼로 한번 씻어, 유리 문화 튜브에 넣습니다.
- 밤새 37 ° C에서 10 % KOH 0.5 ㎖의 점막 부화. 액체 섬광 계수기를 사용하여 (삼중)에 용 해물을 150 μL 씩의 방사능을 측정한다.
- 브래드 포드 (Bradford) 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정 해물의 - (5 μL 3) 분취 량을 사용한다.
주 : 방사성 세로토닌을 함유하는 배양 배지 10 mL를 표준으로 사용된다. 5-HT는 pmol의 / mg protein / min으로 산출되는 조직에서 유지.
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Representative Results
3D 카코 2 낭종의 면역 염색은 그림 1과 같다. 팔로이 딘의 굴지 염색 차원 낭종에 잘 경계가 루멘을 나타내는 XY 평면의 대표적인 이미지는도 1a에 도시되어있다. 루멘에 직면 측면은 혀끝의 측면이다. 강력한 상피 표현형의 3D 환경의 결과에서 배양 상피 세포. 액틴과 SERT 공동 염색 하루 12에 다른 카코 2 낭종은 그림 1B에 표시됩니다. XY 평면 (도 1a에 도시 된 평면과 다른)이 표현에서, SERT 염색 서브 정점 염색과 함께 주로 내강 막에서 볼 수있다. 도 2는 12 일째의 postplating에서 단층으로 성장 카코 -2 세포에 비해 SERT 단백질 수준 3D 낭종에서 높은 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 카코 2 세포의 3 차원 문화 노나 모방 신호 이벤트를 트리거 수 있음을 시사상피 세포를 포지티브, 증가 SERT 식 초래한다. 도 3a는 Ussing 챔버 시스템의 일반적인 개요와 동작을 도시하고, 개구의 핀에 장착 소장을 나타낸다. 이 기법은 원래 장내 상피 수송의 활성의 평가를 허용한다. Ussing 챔버 방식의 장점은 내강 (점막) 또는 기저 (장막) 측 표현 수송의 기능을 평가하는 기능이다. 도 4는 5-HT J 밀리 광속 (A)을 증가 및 TGF-β에 대한 응답으로 회장 점막 (B) 5-HT의 축적을 증가 보여준다. 제 j의 MS에 의해 나타난 바와 같이 TGF-β1은, 장막 측 점막에서 방사성 표지 된 5-HT의 이동을 증가하기 때문에, 이러한 데이터는 회장 상피 세포의 내강 막 5-HT 흡수의 증가를 지시한다. 이는 셀 내의 방사성 5-HT의 축적의 증가로부터 더욱 명백 할SERT 활성을 반영 플루옥세틴 의한 억제에 민감 내강 막에 나타냈다.
그림 1 : 카코 2 고유 루멘 표시 12 D에 젤라틴 단백질 혼합물에 재배. 레드 : 액틴. Debnath 등에 의해 전술 한 바와 같이 3 차원 성장 카코이 낭종의 면역 염색을 위해, 세포를 8 웰 챔버 슬라이드에 배양 팔로이 딘 (A)으로 염색 하였다. 9. 3 차원 배양이 카코 (B)을 면역 염색을 위해, 낭종, 30 분 동안 2 % PFA로 고정시켰다 PBS 글리신으로 처리하고 RT에서 15 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100으로 투과 화. 밤새 4 ° C에서 : 차단 한 후, 낭종은 SERT 항체 (100 일)에서 배양 하였다. 그런 다음 세척하고 형광 접합 된 이차 항체 (1 : 200)와 함께 배양하고, 팔로이 딘 (1 : 200)실온에서 45 분. 마지막으로, 그들은 antifade 함유 DAPI에 장착 하였다. 이미지는 공 초점 현미경을 사용하여 촬영 하였다. 스케일 바 : 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 2D 및 3D에서 재배 카코이 세포의 SERT 단백질 식입니다. SDS-PAGE에 의해 해결 된 플라스틱 지원에 배양 카코 2 세포 용 해물과 카코이 3D 분야는 니트로 셀룰로오스 막에 도말하고 SERT 항체와 GAPDH 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
![그림 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg"/>)
그림 3 : (A) 탑재 된 마우스 소장을 나타내는 핀과 구멍을 가진 Ussing 챔버와 "슬라이더". 슬라이더 개구 면적 = 0.30 cm 2. 슬라이더는 실형있는 Ussing 챔버의 두 부분으로 적합합니다. 이러한 transepithelial 전압 전위 (V의 t) 등의 전기적 파라미터는, 전위차계와 전극 (일반적으로 반 - 세포 칼로멜 또는 AG-AgCl을 각각 실 절반 염다리 의해 연결된다)에 의해 측정된다. 염다리는 용액의 이온 조성의 변화를 방지하기 위해 점막 입욕 사용 생리 완충액 (예 : KBR)를 용융 3 % 아가로 구성된다. Ussing 챔버의 원리 (B) 회로도. 스트리핑 장 점막은 점막 및 장막 챔버 분리 Ussing 챔버의 두 개의 절반에 부착 하였다. 방사성 추적자는 점막 SID에 추가이자형; 흡수는 총 단백질 함량으로 표준화 조직으로 포함 된 방사능의 양으로서 측정 하였다. 자속은 시간에 걸쳐 장막 챔버 내의 방사능을 측정함으로써 평가 하였다. 개략적으로 도시 된 전극은 전기적 파라미터는 포함 전류, 전압 및 저항의 동시 모니터링을 허용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Seromuscular 계층의 박탈 회장 점막에 SERT 기능의 측정. 3의 H] -5-HT 흡수와 3의 H] -5-HT는을 사용하여 플럭스의 측정을 통해 입증 마우스 회장의 SERT 기능에 단기 TGF-β1 치료의 생체 효과,챔버를 Ussing. TGF-β1의 치료에 증가 된 나트륨에 의해 입증되는 바와 같이 (10 NG / ㎖, 1 시간)를 기저 측이 크게 SERT 기능 향상이 + 민감한 점막 투 장막 플럭스 (J 밀리) (A), 3 [H] - 5-HT 섭취 (B). 이레 조직 플루옥세틴 처리는 TGF-β1 자극 5-HT 흡수를 억제 하였다. 플루옥세틴에 민감한 흡수는 제어에 비해 TGF-β1에 의해 2.5 배 증가 하였다. 결과는 평균 SEM로 표시됩니다. 일방향 ANOVA Tukey에의 시험은 통계 분석에 사용 하였다. J 밀리 플럭스의 계산 : (CPM 전자 - CPM s의) × 희석 요인] / [(. V의 표준의 X의 진한 기판) CPM의 표준 /는 xtxa]. CPM 전자 : 플럭스 측정의 끝에서 분당 카운트; CPM의 : 플럭스 측정의 시작 분당 카운트; CPM의 표준 : 표준의 분당 카운트 (점막 저수지에서 촬영) V의 표준 : 볼륨 오노출 당 비용의 표준 F] t : 시간의 자속의 시간; A : 조리개 (0.3 cm 2)의 영역입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
장내 트랜스 10, 11, 12, 13, 14, 15 공부 상피 단층 편광으로 완전히 분화 카코 -2 세포 단층을 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 장 상피 세포의 생체 조직을 모방하는 3 차원의 카코 -2 문화의 발달에 상당한 관심이 있었다. 장 상피 세포에 대한 3 차원 세포 배양 모델의 수는 최근 원시 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질 (ECM)의 2D 시스템 (16)보다 큰 생체 적합성과의 상호 작용을 모방 개발되었다. 따라서, (예를 들면 라미닌, 콜라겐 IV 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸과 같은) 공통의 요소를 포함하는 ECM 계 천연 하이드로 겔 광범위 3D 세포 배양 (1)의 생성에 사용되는6.
여기에 설명 된 프로토콜은 젤라틴 단백질 혼합물에서 재배 3D 카코이 세포의 적합성 상피 전송 연구 (Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스의 종양에서 추출 된 ECM 기반의 천연 하이드로 겔)를 보여줍니다. 10 일 이내, 세포 고유 정단 및 기저 도메인과, 셀 및 표시 극성의 층에 의해 둘러싸인 중공 도관을 형성하기 시작한다. 젤라틴 단백질 혼합물에 파종시의 세포 밀도는 중앙 루멘 정규 낭종의 형성에 중요하다. 염색 실험을 위해, 우리는 4000 세포 / 웰의 8 챔버 슬라이드 (0.7 cm 2 웰 표면적)을 첨가. 불규칙한 분야에서 높은 밀도의 결과로 셀 시드. (10)에서 3D 카코 2 낭종 - 11 일 트랜스 웰 (17) (게시되지 않은 관찰)에 성장 2D 카코 2 세포보다 극성 더 차별화를 보여줍니다. 우리는 샘플 콘텐츠로 표시된 SERT의 mRNA의 발현 증가 및 단백질 수준을 보여 주었다완전히 차별화 된 2D 단일 층에 ared. 또한, 이러한 방법을 이용하여, 우리는 면역 형광 염색 (15)에 의해 도시 된 바와 같이, TGF-TGF-β1은 SERT의 표면 레벨을 증가시키는 것으로 나타났다.
흥미롭게도, 최근의 연구는 3D 카코 -2 세포 때문에 이러한 TNF 수용체 2에서 MyD88 같은 중요한 신호 성분의 존재의 병태 생리 학적 자극에 더 반응하는 것을 증명하고, 종래의 2D 시스템 (17)보다 더 나은 모델을 표현하고있다. 그러나, 상피 전송 연구 3D 카코 (2)의 사용을 제한하는 하나의 문제는 여러 종류의 세포의 부족 및 네이티브 소장에서 발견되는 복잡성이다. 이와 관련하여, 인간 또는 마우스 유래의 (또한 enteroids / colonoids라고도 함) 장 organoids은 이온 영양소 나 약물 수송을 연구하기 위해 원시 상피의 모든 다른 유형의 세포를 포함하는 최신 모델을 나타낸다. organoids에 비해 잘차별화 된 3D 카코 2 낭종 상피 세포의 한 종류 (즉, 흡수 장 세포)를 표현하고 확실히 장 수송을 관장하는 세포 및 분자 메커니즘에 초점을 맞춘 연구에 적합하다. 차원 카코 -2 세포는 취급하기 편리한 경제적이며, 예컨대 플라스미드 DNA 및 siRNA를 형질 감염의 경우와, 조작이 용이하기 때문이다. 상피 전송 연구 3D 카코 -2 세포의 또 다른 한계는 루멘 액세스있어서의 어려움이다. 막 수용체 또는 내강 측으로부터 상피에 액세스 감염원에를 내강에 바인딩 에이전트는이 시스템에서 공부에 도전 할 수있다. C. 디피 감염 (18)에 대한 인간의 장 organoid 문화의 경우 이전에 수행 된 바와 같이이 제한은, 루멘에 에이전트를 마이크로 인젝션에 의해 극복 될 수있다. 이는 시험 관내 세포 배양 모델에서 연구 기본 I에서 검증 있다는 것은 중요ntestine 생체 내 또는 생체 외 접근에 사용.
지난 몇 년 동안, Ussing 챔버는 많은 상피 컨베이어 (19)의 기능 또는 규제 등록의 인식에 크게 기여하고있다. 여기에서는 seromuscular 층 (15)의 결여 마우스 장 점막에서 5-HT 플럭스 및 5-HT 흡수를 측정하기 위해 Ussing 챔버 방식의 적합성을 나타낸다. 증가 나 의해 입증 크게 SERT 함수 증가 기저 측 (10 NG / ㎖, 1 H)에 회장 점막의 TGF-β1 처리 + 과민 플럭스 (J 밀리) 점막 장막 간 3 H-5- HT 흡수. 회장 조직의 플루옥세틴 치료는 5-HT 흡수의 TGF-β1 매개 자극을 억제 하였다.
이 기술의 중요한 단계는 achie하기 위해 (모든 찢어짐없이) 손상되지 않은 층으로 슬라이드 개구의 조직 마운팅 포함 정확한 측정을했습니다. 이러한 공 가위, 얇은 팁 집게, 깃털 수술 블레이드와 같은 적절한 수술 도구는, 적절한 처리를 위해 중요하고 조직의 제거이다.
이 방법은 다른 상피 같은 전해질 운송 등 운송 (염화 운송, 나 + / H + 기, 영양 운송 등)의 기능을 연구하기 위해 적용 할 수있다. 산도 통계 기법으로 Ussing 챔버-등의 특수 용도가 순 분비 또는 흡수 측정하기 위해, transepithelial 중탄산염 분비 및 동위 원소 플럭스 방법을 측정하기 위해 기판을-한 박사 클라크 등에 의해 종합적으로 검토. 8. 그들은 광범위하게 영양 운송 (19)의 연구에 실을 Ussing의 적용을 검토했다. 미니 Ussing 챔버는 생검 샘플 수송 기능을 측정하는 등, 임상 적 상황에서 사용 된REF "> 20. everted SAC 방법 통해 Ussing 챔버 기술의 주요 장점은 동시에 그대로 편광 장내 상피 세포의 전기적 전송 파라미터를 측정 할 수있다.
Ussing 챔버 방법으로 하나의 관심사는 제한된 생존 능력과 생체 장 준비의 최적의 기능입니다. 동물에서 제거되면, 생체 장 준비에만 Ussing 챔버 (19)에서 최대 3 시간 동안 지속될 수 있습니다. 따라서,이 방법은 긴 시간 동안 에이전트의 효과를 테스트에 제한이있을 수 있습니다. 이러한 경우, 처리는 생체 내에서 수행하고 Ussing 법으로 전송 파라미터를 측정 할 수 제어 및 처리 군에서 장내를 분리 할 수있다. 모든 경우에, G의 t (또는 R의 t)의 크기는 생존을 실시간 표시 할 수 있고, 구분하기에 유용 할 수있다테스트 시약의 특정과 비특이적 효과.
요약하면, 여기에 기술 된 방법은 장내 염증, 감염성 설사, 흡수 장애, 대사 장애 등 건강하고 병에 걸린 상태에서 기능과 상피 운송의 규제에 적용되는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 용이하게 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
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