Summary
Vi beskriver enkla metoder för att studera regleringen av tarmserotonintransportören (SERT) funktion och uttryck med hjälp av ett in vitro-cellodlingsmodell av Caco-2-celler odlas i 3D och en ex vivo modell av mus tarmar. Dessa metoder kan tillämpas på studier av andra epitelceller transportörer.
Abstract
Tarmepitelet har viktiga transport- och barriärfunktioner som spelar nyckelroller i normala fysiologiska funktioner i kroppen samtidigt som en barriär mot främmande partiklar. Nedsatt epitel transport (jon, närings eller läkemedel) har förknippats med många sjukdomar och kan få konsekvenser som sträcker sig utöver de normala fysiologiska funktioner transportörerna, såsom genom att påverka epitel integritet och tarmen microbiome. Förstå funktionen och regleringen av transportproteiner är avgörande för utvecklingen av förbättrade terapeutiska ingrepp. Den största utmaningen i studiet av epitel transport utvecklar ett lämpligt modellsystem som rekapitulerar viktiga inslag i de infödda intestinala epitelceller. Flera in vitro cellodlingsmodeller, såsom Caco-2, T-84, och HT-29-Cl.19A celler används vanligen i epitel transportforskning. Dessa cellinjer utgör ett reduktionistiskt tillvägagångssätt för att modellera den epithelium och har använts i många mekanistiska studier, inklusive deras undersökning av epitelceller mikrobiella interaktioner. Däremot har cellmonoskikt inte korrekt återspeglar cell-cell interaktioner och in vivo mikromiljö. Celler odlade i 3D har visat sig vara lovande modeller för läkemedels permeabilitets studier. Vi visar att Caco-2-celler i 3D kan användas för att studera epiteliala transportörer. Det är också viktigt att studier på Caco-2-celler kompletteras med andra modeller för att utesluta cellspecifika effekter och att ta hänsyn till komplexiteten i den nativa tarmen. Flera metoder har tidigare använts för att bedöma funktionalitet av transportörer, såsom vrängda säcken och upptag i isolerade epitelceller eller i isolerade plasma membranvesiklar. Med hänsyn till de utmaningar inom området med avseende på modeller och mätning av transportfunktion, visar vi här ett protokoll för att odla Caco-2-celler i 3D och beskriver användningen av en Ussing kammare som eneffektiv metod för att mäta serotonin transporter, såsom i intakta polariserade intestinala epitel.
Introduction
Tarmepitelet är utrustad med olika transportproteiner (kanaler, ATPaser, co-transportörer och värmeväxlare) som utför många funktioner som sträcker sig från absorptionen av näringsämnen, elektrolyter och droger till utsöndringen av vätska och joner i lumen. Transportproteiner genererar elektrokemiska gradienter som tillåter förflyttning av joner eller molekyler i en vektor sätt. Detta uppnås genom de asymmetriska fördelningar av transportsystemen i apikala och basolaterala membran av polariserade epitelceller. Dessutom, täta förbindelser, som Tether intilliggande epitelceller, spelar en viktig roll i denna process genom att fungera som en barriär mot intramembrane diffusion av komponenter mellan de apikala och basolaterala membran domäner. Lämpliga modellsystem som härmar dessa kännetecken för den infödda tarm (dvs. polaritet, differentiering och tight junction integritet) är avgörande för studien av funktionality av epitelceller transportsystem.
När det gäller modeller, de typiska cellinjer som används för närvarande i tarm forskning epitel transport är Caco-2, en modell för fullt differentierade, absorberande epitelceller i tunntarmen; och T84-celler eller HT-29 subkloner, modeller av crypt härrörande stora intestinala epitelceller 1. Konventionellt är dessa cellinjer odlas som monoskikt i plastytor eller belagda Transwell skär. Trans-well cellodlingsinsatser i viss mån likna in vivo miljön genom att tillåta polariserade celler att mata basolaterally. Emellertid är en begränsning i konventionella 2D odlingssystem att cellerna tvingas att anpassa sig till en konstgjord, platt och styv yta. Således är den fysiologiska komplexiteten hos den nativa epitel inte korrekt i en 2D-system. Denna begränsning har övervunnits av metoder för att odla celler i 3D i ett visst mikro, såsom geléform protein mixture, som innehåller en mängd olika extracellulära matriskomponenter 2, 3. Icke desto mindre kan de in vitro-kulturer inte simulera komplexiteten i tarmepitelet, som har flera celltyper och region-specifik arkitektur i tarmen. Således studier med cellodlingsmodeller kräver ytterligare validering i den nativa tarmen. Använda in vitro 3D cellkultur och mus tarmslemhinna, beskriver vi här enkla metoder för att studera regleringen av tarmserotonintransportören (SLC6A4, SERT).
Den SERT transportör reglerar den extracellulära tillgängligheten av en viktig hormon och neurotransmittor, 5-hydroxitryptamin (5-HT), genom att snabbt transportera den genom en Na + / Cl - -beroende process. Sert är ett känt mål för anti-depressiva och har nyligen dykt upp som ett nytt terapeutiskt mål av GI störningar, såsom diarré och tarminflammation.Metoder för att undersöka 5-HT-upptag i tarmepitelceller har tidigare beskrivits. Till exempel, har Caco-2-celler som odlas på plaststöd eller permeabla skär visats uppvisa fluoxetin känsliga 3 H-5-HT-upptag vid båda apikala och basolaterala domänerna 4. Mätningen av SERT funktion i isolerade tarmluddet membranvesiklar (BBMVs) framställt från human organdonatortunntarmen har också beskrivits av oss fem. 3 H-5-HT-upptag i humana BBVMs visades vara fluoxetin känslig och Na + / Cl - -beroende, och det uppvisade mättnads kinetik med ett K m av 300 nM 5. Med hjälp av liknande metoder, vi också tidigare uppmätta SERT funktion som 3 H-5-HT-upptag i mus tarm BBMVs 6. Emellertid framställningen av rena plasma membranvesiklar kräver en stor mängd av vävnad slemhinna. Andra metoder, såsom den radiographic visualisering av 3 H-5-HT-upptagsställen, har också visats tidigare i marsvin och råtta tunntarmen 7.
Den Ussing Kammaren tillhandahåller ett mer fysiologiskt system för att mäta transporten av joner, näringsämnen och läkemedel genom olika epitelvävnader. Den största fördelen med den Ussing kammartekniken är att den möjliggör den exakt mätning av de elektriska och transportparametrar av intakt, polariserade intestinala epitel. Vidare, för att minimera inverkan av den inneboende neuromuskulära systemet, kan utföras seromuscular strippning av tarmslemhinnan för att undersöka regleringen av transportörer i epitelet 8.
Vi visar att Caco-2-celler odlas i 3D på geléform protein bildar en ihålig lumen som uttrycker olika apikala och basolaterala markörer. Dessa celler visar högre uttryck av Sert än 2D Caco-2-celler. Metoder för att odla 3D celler och peR formimmunfärgning eller RNA och protein extraktion beskrivs. Dessutom beskriver vi metoder för att studera SERT funktion och reglering av TGF-β1, en pleiotropisk cytokin, i tunntarmens slemhinna genom att utnyttja en Ussing kammarteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Studie av Intestinal Transportörer i en 3D kultursystem av Caco-2: Odling 3D Caco-2 cellkultur på en Gelatinous proteinblandning
- Tö tillväxtfaktor reducerat gelatinös proteinblandningen på is under 8 h (eller O / N) vid 4 ° C. När tinats, göra 1 ml eller 500 mikroliter alikvoter för användning eller förvara vid -20 ° C för senare användning.
- På dagen för kultur, förkyla odlingsplattorna (för RNA och protein-extraktion) eller chambered slides (för immunfärgning) på is. Tillsätt 30 mikroliter av gelatinös proteinblandning till varje brunn i en åtta-brunnars chambered-glasskiva (eller 120 | il per brunn av en 6-brunnsplatta) och fördela det jämnt. Se till att inte generera luftbubblor under processen.
- Placera glasen / plattor inuti en cellkultur inkubator vid 37 ° C under 15-30 min och låta den gelatinösa proteinblandningen stelna.
- Medan den gelartade proteinblandningen stelnar, trypsinize ett konfluent kolv av Caco-2-celler.
- Räkna antaletav celler och snurra dem vid 500 xg i en bordscentrifug under 5 min. Återsuspendera cellpelleten i 3D Caco-2 Medium vid behov.
- Seed glaskammarobjektglas vid 4000 celler per brunn (för tallrikar, 20.000 per brunn). Tillåta cellerna att växa i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C. Byt medium var 3-4 d.
2. immunofluorescensfärgning för Epithelial Transportörer i 3D Caco-2-celler: Dag 1
- Aspirera mediet och fixera cellerna med 400 mikroliter av 2% paraformaldehyd (PFA) (i PBS med pH justerat till 8,5 med NaOH) under 30 min vid RT.
OBS: PFA lösning ska inte förvaras i mer än en vecka vid 4 ° C, och nyligen gjorda lösning kan användas. VARNING: PFA är mycket giftigt och en potentiellt cancerframkallande. Hantera alltid det med försiktighet i en kemisk huva och användning av personlig skyddsutrustning. - Skölj brunnarna två gånger med 1 x PBS och lagra bilderna vid 4 ° C i PBS (400 pl /väl). När fasta, förvara dem vid 4 ° C i upp till en vecka.
- Värm kammar glider till RT (detta kommer att härda gelatinliknande proteinblandningen säng och gör det lätt att aspirera under tvättningsstegen).
- Permeabilisering cellerna med 0,5% Triton i PBS under en längre tid än 15 minuter.
- Förbereda PBS-glycin-buffert (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO 4, och 100 mM glycin). Skölj 3x med 1 x PBS-glycin i 10 min vardera vid RT.
- Förbereda immunofluorescens-buffert (IF): 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH 2 PO 4, 100 mM glycin, 7,7 mM NaN3, 0,1% BSA, 0,2% TritonX-100, och 0,05% Tween-20 .
- Tvätta 3x i IF-buffert under 10 min vardera vid RT. Block i 5% normalt getserum (NGS) i IF-buffert. Inkubera med primär antikropp utspädd i IF + 1% getserum, 200 | il / brunn, under 1 - 2 h vid RT. Tvätta med IF-buffert 3x under 10 min vardera.
- Inkubera med sekundär antikropp (1: 200) utspädd i IF + 1% NGS, 200 | il / brunn, under 1 h vid RT.
- Tvätta med IF-buffert tre gånger i 10 min vardera. Håll bilderna i mörker från detta steg på. Lyft plastkamrarna från objektglas genom att placera kammaren bilden i en svart hållare och skjuta en vit lyftare genom hållaren tills dess kant kontakt med kanten av brunnarna. Dra försiktigt upp kamrarna (hållaren och lyftaren ska komma med kulturbilder).
- Montera med långsam anti-fade medium och låt den torka i 10 minuter vid RT.
- När torkat helt täta bilderna med nagellack och bild dem med konfokalmikroskopi. Lagra objektglasen vid 4 ° C under två veckor eller vid -20 ° C under flera månader.
3. RNA och Protein Extraction från 3D Caco-2-celler
- Behandla de celler som odlats på gelatinös proteinblandning för 12-14 d med ett testmedel, såsom TGF-β1 (10 ng / ml, 1 h).
- Efter behandling, tvätta cellerna med enx PBS. Hålla cellerna på is under 30 min för att smälta den gelartade proteinblandningen.
- Tvätta brunnarna med kyld PBS och samla upp cellerna i enskilda centrifugrör. Samla upp cellerna med användning av låghastighetscentrifugering vid 500 xg och 4 ° C under 10 min. Extrahera RNA med användning av standardförfaranden och använda realtid RT-PCR.
- För proteinextraktion, lysera cellerna med användning av 1x cellysbuffert kompletterad med 1x proteas cocktail inhibitor. Efter tillsats av cellysbuffert till pelleten, lysera cellerna genom sonikering och avlägsna celldebris genom centrifugering vid 7500 x g och 4 ° C under 10 min.
4. Mätning av 5-HT-upptag i mus ileum Med hjälp av en Ussing avdelningen: Intestinal Förberedelser och Seromuscular Strippa
- Efter dödshjälp, dissekera möss och ta bort de små tarmarna (efter magen och innan blindtarmen). Dela tunntarmen i tre delar. Kasta den mellersta tredje använder proximala tredjesom jejunum, och använda den distala tredjedel så ileum. Undvik att dra i tarmen från sin mesenteriska fastsättning för att förhindra skador på epitelet. Hålla vävnadssektionen kall genom att täcka den med iskall Krebs-Ringer bikarbonat (KBR) buffert.
- Öppna tarmen längdled med sax. Inkubera nyligen utskurna tarmsektioner i iskall, gasning KBR innehållande 1 | iM indometacin under 10 min före seromuscular stripp.
- Stift tarmsektionen (~ 1 cm långa) mukosal-sidan nedåt på en platta innehållande 7% agaros eller härdade silikonelastomeren (0,5 cm tjock).
- Skala seromuscular lagren under ett dissektion stereo med botten belysning. Skär seromuscular skiktet med hjälp av en fjäder skalpellblad. Använd fin pincett för att erhålla kanten av skiktet längs den longitudinella axeln av tarmen.
OBS: Under stripp förfarandet botten belysning av stereomikroskop hjälper till att identifiera och undvika områden med Peyer s patches. - Efter slutförandet av seromuscular stripp, montera slemhinnan noga på stiften i en Ussing halv-kammare. Under hela processen, vara noga med att hålla den avskalade slemhinnevävnaden i kanterna för att undvika att riva den.
5. Jämvikts och vävnadsbehandlande
- Förbereda Krebs lösning: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCOs 3, 2,4 mM K 2 HPO 4, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, och 0,4 mM KH 2 PO 4 vid pH 7,4, gasad med 95% O2 / 5% CO2 vid 37 ° C. Lägg 10 mM glukos till serosala badet för att fungera som en energi-substrat och 10 mM mannitol till den mukosala badet för att upprätthålla den osmotiska balansen.
OBS: Krebs lösning kompletteras med L-askorbinsyra (100 | iM) och pargylin (100 | iM, monoaminoxidashämmare) för att förhindra intracellulär 5-HT-nedbrytning. - Sätt reglaget i kammaren för att exponera både den apikala (luminala) side och basolaterala (serosala) sida av vävnaden till Krebs lösning.
- Efter en jämviktningsperiod av 10 min, förbehandla ileala vävnaden med fluoxetin (10 | iM) under 30 min på den apikala sidan för J ms (mukosal till serosal flux).
- Behandla vävnaden med TGF-β1 (10 ng / ml) under 1 h på basolaterala sidan och sedan inkubera det med 3 [H] -5-HT (20 nM) under 30 min på den apikala sidan.
6. Kvantifiering av Mukös till serosala Flux (J ms) och 3 [H] -5-HT ackumulering i vävnad
- Samla 0,75 ml alikvoter från serosala reservoaren (totalt 5 ml) för att mäta radioaktiviteten i en vätskescintillationsräknare och för att beräkna mukosal-till-serosala (J ms) omloppshastigheter; fluoxetin känsliga flux representerar Sert-medierad 3 [H] -5-HT-upptag.
- För att undvika hydrostatiska tryckskillnader över slemhinnan under en flödes period, ta prover från serosala sidan och återplacera dem med samma volymer bad medium.
OBS: flussmedel beräkningen korrigerar för utspädning av slutprovet (4,25 ml / 5 ml = 0,85). - För kvantifiering av 3 [H] -5-HT ackumuleras i vävnaden, demontera slemhinnan från reglaget, tvätta den en gång med iskall KRB-buffert, och placera den i glas odlingsrör.
- Inkubera slemhinnan i 0,5 ml 10% KOH över natt vid 37 ° C. Mäta radioaktiviteten i 150 | il alikvoter av lysaten (i triplikat) med användning av en vätskescintillationsräknare.
- Använd portioner (3-5 mikroliter) av lysaten för att mäta proteinkoncentration med hjälp av Bradford-metoden.
OBS: 10 mL inkubation medium innehållande radioaktiva serotonin används som en standard. 5-HT kvar i vävnaden uttrycks som pmol / mg protein / min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunfärgning i 3D Caco-2-cystor visas i figur 1. En representativ bild av en XY-planet som visar välavgränsade lumen i 3D-cysta färgades med falloidin aktin är avbildad i Figur 1A. Den sida som vetter mot lumen betecknar apikala sidan. Epitelceller odlade i en 3D-miljö resulterar i en robust epitelial fenotyp. Olika Caco-2 cystor på dag 12, när aktin och SERT var co-färgade, visas i figur 1B. I denna representation av en XY-plan (som skiljer sig från det plan som visas i figur 1A) är Sert färgning syns främst i luminala membranen, tillsammans med sub-apikala färgning. Figur 2 visar att Sert proteinnivåer är högre i 3D cystor jämfört med Caco-2-celler odlas som monoskikt på 12: e dagen postplating. Dessa data tyder på att 3D-kulturen i Caco-2-celler kan utlösa signalering händelser som efterliknar nativ epitel och resultera i ökad SERT uttryck. Figur 3A visar den allmänna genomgången och drift av en Ussing kammarsystem och visar den monterade tunntarmen hos stiften hos öppningen. Denna teknik gör det möjligt att utvärdera aktiviteten hos epitelceller transportörer i den nativa tarmen. Fördelen med Ussing kammar strategi är förmågan att bedöma funktionen av transportörer uttryckta på luminala (slemhinnan) eller basolateral (serosala) sida. Figur 4 demonstrerar ökad 5-HT J ms flöde (A) och ökad 5-HT-ackumulering i ileumslemhinna (B) som svar på TGF-β. Eftersom TGF-β1 ökade rörligheten av radiomärkt 5-HT från slemhinna till serosala sida, som representeras av J ms, dessa uppgifter tyder på en ökning av 5-HT-upptag från luminala membranen av ileal epitelceller. Detta är vidare uppenbart från en ökning av ansamling av radiomärkt 5-HT i cellen, vilketvar känslig för inhibering av fluoxetin, vilket återspeglar aktiviteten hos Sert uttrycks på luminala membranen.
Figur 1: Caco-2 odlas på en Gelatinous proteinblandning vid 12 d Visar Distinkt Lumen. Red: aktin. För immunfärgning av Caco-2-cystor odlas i 3D, odlades cellerna i en 8-brunnars kammarobjektglas och färgades med falloidin (A), såsom tidigare beskrivits av Debnath et al. 9. För immunofärgning 3D Caco-2 kultur (B), var cystor fixerades i 2% PFA under 30 minuter, behandlades med PBS-glycin och permeabiliserades med 0,5% Triton-X-100 under 15 min vid RT. Efter blockering ades de cystor inkuberades i SERT-antikropp (1: 100) över natten vid 4 ° C. De tvättades sedan och inkuberades med fluorescens-konjugerad sekundära antikroppar (1: 200) och falloidin (1: 200)under 45 min vid RT. Slutligen, var de monterade i antifad innehållande DAPI. Bilderna har tagits med en konfokalmikroskop. Skala bar: 20 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: SERT Protein Expression i Caco-2-celler odlas i 2D och 3D. Lysat från Caco-2-celler odlade på ett underlag av plast och Caco-2 3D sfärer beslutats av SDS-PAGE blottades på nitrocellulosamembran och analyseras med SERT antikropp och GAPDH. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/55304/55304fig3.jpg")
Figur 3: (A) Ussing kammaren och "reglaget" med stiften och öppning visar en monterad mus tunntarmen. Reglaget öppningsområde = 0,30 cm 2. Reglaget passar i de två halvorna av den Ussing kammaren, som är fackindelade. Elektriska parametrar, såsom transepitelial spänningspotential (V t), mäts av en potentiometer och elektroder (typiskt kalomel halvceller eller Ag-AgCl är anslutna via saltbryggor till varje kammare halv). Saltbryggor är sammansatta av tre% agar smält i fysiologisk buffert (t.ex., KBR) som används för bad slemhinnan för att undvika förändringar i den joniska sammansättningen av lösningarna. (B) Schematisk bild av principen om Ussing kammaren. Den avskalade tarmslemhinnan monterades i de två halvorna av den Ussing kammaren separera de mukosala och serosala kamrarna. Radioaktivt spårämne sattes till mucosal side; upptagningen mättes som mängden radioaktivitet införlivad genom vävnaden, normaliserad till det totala proteininnehållet. Flussmedlet utvärderades genom mätning av radioaktiviteten i den serosala kammaren över en tidsperiod. Elektroderna som visas i den schematiska möjliggöra samtidig övervakning av elektriska parametrar, inklusive ström, spänning och motstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mätning av SERT Funktion i ileumslemhinna Stripped av Seromuscular Layer. Ex vivo effekter av kortsiktiga TGF-β1 behandling på SERT funktion i mus ileum visade genom mätning av tre [H] -5-HT-upptag och 3 [H] -5-HT flöden med hjälp avUssing kammaren. TGF-β1-behandling (10 ng / ml, 1 h) på den basolaterala sidan ökade signifikant SERT funktion, vilket framgår av den ökade Na + -känsliga mukosal-till-serosala flux (J ms) (A) och 3 [H] - 5-HT-upptag (B). Fluoxetin behandling av ileal vävnad hämmade TGF-β1-stimulerade 5-HT-upptag. Fluoxetin känsliga upptag ökades 2,5-faldigt genom TGF-β1 jämfört med kontrollen. Resultaten representeras som medelvärde SEM. En envägs ANOVA Tukeys test användes för den statistiska analysen. Beräkning av J ms Flöde: [(CPM e - CPM s) x Utspädningsfaktor] / [(v. Std x konc substrat) CPM std / xtxa]. CPM e: räkningar per minut vid slutet av flödesmätning; CPM s: impulser per min vid starten av flödesmätning; CPM std: räkningar per minut av standard (tagen från slemhinna reservoaren); V std: volym of CPM std; t: tid av flöde i h; a: område av öppningen (0,3 cm 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fullt differentierade Caco-2 cellmonoskikt har använts i stor utsträckning som polariserad epiteliala monoskikt för att studera intestinal transport 10, 11, 12, 13, 14, 15. Men för att härma den fysiologiska organisationen av intestinala epitelceller, har det funnits ett stort intresse för utvecklingen av ett Caco-2 kulturen i 3D. Ett antal 3D cellodlingsmodeller för intestinala epitelceller har nyligen utvecklats som efterliknar nativa cell-cell och cell-extracellulärt matrix (ECM) interaktioner med större fysiologisk betydelse än 2D-system 16. Således är ECM-baserade naturliga hydrogeler innehåller gemensamma komponenter (såsom laminin, kollagen IV, och heparinsulfat proteoglykan) i stor utsträckning används för generering av 3D-cellkulturer 16.
Protokollet som beskrivs här visar lämpligheten av 3D Caco-2-celler odlas i geléform proteinblandning (en ECM-baserade naturligt hydrogel utvinns ur Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mustumörer) för epitel transportforskning. Inom 10 dagar, att cellerna börjar att bilda en ihålig lumen omgivna av ett skikt av celler och show polaritet, med distinkta apikala och basolaterala domäner. Celltätheten vid tidpunkten för sådd på en gelatinliknande proteinblandning är kritisk för bildandet av regelbundna cystor med central lumen. För färgning experiment har vi lagt 4000 celler / brunn av en 8-kammarglid (väl yta: 0,7 cm 2). Sådd celler vid en högre resultat densitet i oregelbundna sfärer. 3D Caco-2 cystor på 10 - 12 dagar visar polariteten och mer differentiering än 2D Caco-2-celler som odlas på transwell 17 (opublicerade observationer). Vi har visat en markant ökning i expressionen av SERT mRNA och proteinnivåer som kompared att fullt differentierade 2D monoskikt. Även, med utnyttjande av dessa metoder, har vi visat att TGF-TGF-β1 ökar ytan nivåer av SERT, såsom visas genom immunofluorescens-färgning 15.
Intressant nog har nya studier visat att 3D Caco-2-celler är mer mottagliga för patofysiologiska stimuli på grund av närvaron av kritiska signalkomponenter, såsom TNF-receptor 2 och MyD88, och representerar en bättre modell än den konventionella 2D-systemet 17. Men det är en fråga som begränsar användningen av 3D Caco-2 i epitel transportforskning avsaknaden av olika celltyper och den komplexitet som finns i den naturliga tarmen. I detta avseende, intestinala organoids (även kända som enteroids / colonoids) av humant eller musursprung representerar en state-of-the-art-modellen som innehåller alla olika celltyper av nativt epitel för att studera transporten av joner, näringsämnen eller droger. Jämfört med organoids, väldifferentierad 3D Caco-2 cystor representerar en typ av epitelceller (dvs absorberande enterocyter) och är verkligen lämpar sig för studier som fokuserar på de cellulära och molekylära mekanismer som styr tarm transportörer. Detta beror på att 3D Caco-2-celler är bekväma att hantera, är kostnadseffektiva, och är lätta att manipulera, såsom transfektioner av plasmid-DNA och siRNA. En annan begränsning av 3D Caco-2-celler i epitel transportforskning är svårigheten att få tillgång till lumen. Medel som binder till luminal membranreceptorer eller för smittämnen som ansluter till epitel från luminala sidan kan vara svårt att studera i detta system. Denna begränsning kan övervinnas genom microinjecting agenterna i lumen, som har gjorts tidigare i fall av mänsklig intestinal organoid kultur för C. difficile infektioner 18. Det är dock viktigt att studier i cellodling in vitro modeller valideras i den infödda intestine med användning av in vivo eller ex vivo metoder.
Under de senaste decennierna har Ussing kammaren i hög grad bidragit till erkännandet av de funktionella eller reglerande egenskaperna hos många epitelceller transportörer 19. Här visar vi lämpligheten hos Ussing kammar tillvägagångssätt för att mäta 5-HT flöde och 5-HT-upptag i mus tarmslemhinna saknar den seromuscular skiktet 15. TGF-β1 behandling av ileumslemhinna på den basolaterala sidan (10 ng / ml, 1 h) ökade signifikant SERT funktion, vilket framgår av en ökad Na + -känsliga mukosal-till-serosala flux (J ms) och 3 H-5- HT-upptag. Fluoxetin behandling av ileal vävnad inhiberade TGF-β1-medierad stimulering av 5-HT-upptag.
Kritiska steg i denna teknik inkluderar monterings vävnaden på glidöppningen som en intakt skikt (utan någon sönderrivning) för att achie ve noggranna mätningar. Lämpliga kirurgiska verktyg, såsom boll sax, tunn spets pincett och fjäder kirurgiska knivar, är viktiga för korrekt hantering och strippning av vävnad.
Denna metod är att studera funktionen av andra epitelceller transportörer, såsom elektrolyt transportörer (klorid transportörer, Na + / H + växlare, näringstransport, etc.). Specialiserade användningar av Ussing kammar såsom pH-stat-tekniken, för att mäta transepitelial bikarbonat sekretion och isotop flux metod för att mäta nettosekretion eller absorption av substrat-har granskats utförligt av Dr. Clarke et al. 8. De granskade omfattande tillämpning av Ussing kammare till studiet av näringstransport 19. Mini Ussing kammare har också använts kliniskt relevanta situationer, såsom att mäta transportfunktion i biopsiprovref "> 20. Den stora fördelen med den Ussing kammartekniken över vrängda sac metod är förmågan att samtidigt mäta de elektriska och transportparametrar av intakt, polariserade intestinala epitel.
Ett problem med den Ussing kammarmetoden är begränsad viabilitet och optimal funktion av en ex vivo tarm förberedelse. Vid avlägsnande från djuret, kan ex vivo tarm förberedelse bara pågå i upp till 3 timmar i en Ussing kammare 19. Sålunda kan denna metod har begränsningar i att testa effekten av medel under längre tidsperioder. I sådana fall kan behandlingen utföras in vivo och isoleras sedan tarmar från kontroll- och behandlingsgrupper kan användas för att mäta transportparametrar med Ussing metoden. I samtliga fall kan storleken av G t (eller R t) vara en realtids indikator på viabilitet och kan vara användbart i att diskriminera mellanspecifika och ospecifika effekter av testade reagens.
Sammanfattningsvis kan de metoder som beskrivs här underlättar förståelsen av de cellulära och molekylära mekanismer som styr funktionen och regleringen av epitelceller transportörer i friska och sjuka tillstånd, såsom tarminflammation, smittsam diarré, malabsorption eller metabola sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10x PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95% O2- 5% CO2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa Fluor Phalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| Caco-2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1 Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013--032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (NGS, 10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| Triton X-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
