Summary
Birincil kirpik nöral projenitör hücre proliferasyonu, nöronal farklılaşma ve yetişkin nöronal fonksiyon temelde önemlidir. Burada, ciliogenesis ve primer neurosphere kültürleri kullanılarak nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların cilia proteinlerin sinyal kaçakçılığı incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Introduction
Birincil kirpik bir mikrotübül tabanlı dinamik hücre içi bölümü olduğu bir embriyonik nöronal gelişim 1, 2 boyunca sonik kirpi (Shh) yolu da dahil olmak üzere, hücresel sinyal yollarını, koordine duyusal anten ve yetişkin nöronal fonksiyon 3 bölmeli hücre içi sinyal, 4 olarak işlev . Örneğin 5 Patched Shh reseptörü gibi, bu yolların, bileşenleri sinyal; yol aktivatör Smoothened (SMO) 6; ve Gpr161 7, negatif Shh yolu düzenler yetim G-protein kenetli reseptör (GPCR), dinamik bir tarzda cilia lokalize. Çoklu GPCR'ler, 10 beyin 7, 8, 9, nöronlarda kirpikler lokalize bildirilmiştir sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Kirpikler ve kirpikler tarafından oluşturulan sinyal geçiş yollarında bazı kusurların çoklu dokuları etkiler ve birlikte ciliopathies 17, 18, 19 olarak bilinir. Ciliopathy hastalık spektrumu sıklıkla kraniofasial anormallikler 20, 21, 22 olarak nöro kusurları içerir. Buna ek olarak, hipotalamus nöronları birincil kirpikler merkezi tokluk yolları düzenler ve kusurları gibi Bardet Biedel sendromu 24 olarak sendrom ciliopathies şişmanlığın yansıtma, merkezi şişmanlık 23 ile sonuçlanır. Buna ek olarak, kirpikler sinyalleşme, nöropeptit alıcı centr düzenlerark tokluk 14, 11 geçiş yolu. Bu tür hipokampal nöronlar somatostatin reseptör 3 olarak adenilat siklaz III (ACIII) ve GPCR'lerin Siliyer lokalizasyonu yeni nesne tanıma kusurları ve 25, 26 hafıza noksanlıkları neden olur ve siliyer bütünlüğü 27 bir zamanda gelişmiştir. kirpikler tarafından oluşturulan sinyal gelişimsel açıdan yakın bir doku homeostazında bağlanırlar; Özellikle, sil serebellum 28, 29 granül progenitörlerinden kaynaklanan Shh alt tip medulloblastoma ilerlemesi için önemlidir. Böylece, birincil kirpikler embriyonik, postnatal ve erişkin nöronal gelişim ve işlevi sırasında önemli roller oynarlar.
Nöral kök hücreler (NSC'lerde) subventriküler bölgede lateral ventrikül (SVZ), hipokampusun dentat girus subgranuler kısmında ve ikametmemelilerde 30, 31, 32'de hipotalamusta üçüncü ventrikül ventriküler bölgesi. NSC'lerde multipotent olan kendini yenileme kapasitesini sahiptir ve beyin gelişimi ve rejeneratif tıpta 30 için önemlidir. SVZ'una en NSC'lerde hareketsiz olan ve, birçok durumda, yan karıncık 33 dışarı uzanan bir tek birinci cilium sahiptirler. Özellikle Shh, TGFp, ve reseptör tirozin kinaz yollarında 2, 34, 35, 36 ile ilgili olarak, alt-hücresel tepkiler oluşturmada farklı reseptörlerinin lokalizasyonu, yoluyla birincil kirpik sinyaller. Birincil kirpikler yanal ventrikil içine uzanan yana, birincil kirpikler beyin-omurilik sıvısı (CSF) NSCs 37 aktif hale getirmek için sitokinleri tespit olduğu hipotezi 38, 39, 40, 41 dahil olmak üzere birçok dokuda, tamir kök hücrelerin aktivasyonu ve rejenerasyonu için önemli olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, CSF mekanizma NSC'lerde ile iletişim kurar ve ana kirpikler olup bilinmemektedir katılmaktadırlar. kültür içinde yapışık NSC'lerde kirpikli edilir; Bu tür siliyalarda Smo'nun ve Gpr161 olarak Shh yolu bileşenlerinin, lokalize; ve 42 tepkili Sus bulunmaktadır. Bu nedenle, NSC'lerde bir Shh yolu incelemek için önemli model sistemi, siliyer ticareti ve nöronal farklılaşma yol olarak hizmet edebilir. Buna ek olarak, NSC'lerde ayırt nöronları da siliyer trafik deneyleri için de kullanılabilir.
Neurospheres neura çoğalması kaynaklanan serbest yüzen hücre kümeleri oluşturulurspesifik büyüme faktörleri ve yapışkan olmayan yüzeylerin 43, 44 varlığında büyüme l kök / progenitör hücreler. Neurospheres normal gelişimi ve hastalığın 31, 45, 46, 47 nöral kök / progenitör hücreleri incelemek için in vitro kültür modellerinde önemli vermektedir. Burada, nöral kök / progenitör hücrelerin kültürlenmesi için ve sinir / glia içine farklılaşması için bir neurosphere bazlı analiz tarif eder. Özellikle nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların (Şekil 1) tüycüklere bileşenleri sinyal kaçakçılığı vurgulamaktadır. birincil nöronları kültür aksine, birinci Neurospheres, kültür nispeten kolay birden fazla geçit için uygun olan ve donma-erime döngüleri ve sinir / glia farklılaşmayı geçirebilmektedir. Daha da önemlisi, bu neurosphere türetilmiş nöral tespitkök / progenitör hücreleri ve farklılaşmış nöronların kültür içinde kirpikli ve bu bölmelerin siliyer fonksiyonu ile ilgili sinyal molekülleri yerini belirleyen. Neurosphere tabanlı kültürleme metotları NSC'lerde ve farklılaşmış nöronların ciliogenesis ve siliyer kaçakçılığı çalışmak için ideal bir model sistem olarak hizmet edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yetişkin Fare Beyninden nöroküreleri 1. İzolasyonu
- izofluran aşırı dozda tarafından (yaklaşık 2 aylık) bir yetişkin fare Euthanize. Fare nefes durdu ve ölümden sonra hemen teşrih ettiğini tekrar kontrol edin.
- makas kullanarak, kafatası açmak için bir orta hat kesi yapmak. beyin çıkarın.
- Buz üzerinde 10 cm'lik bir tabak içinde soğuk PBS beyin yerleştirin. Lateral ventrikül 48 SVZ'unda elde etmek için tüm montaj diseksiyon yöntemi takip edin.
- Bir 1.5 ml tüp içine yanal ventrikül yerleştirin PBS içinde% 0.05 tripsin-EDTA 500 uL ekleyin ve bir su banyosu içinde 37 ° C 'de 15 dakika süre ile boru inkübe edin.
- 15 dakika sonra, durdurma ortamının 500 uL ekleyin ve hafifçe 20 pipetleyin - 1 ml ucu ile 30 kez. pipetleme sırasında hava kabarcıkları oluşturan kaçının.
NOT: Bu adım, hücre hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. - 8 dakika boyunca 500 x g'de hücreleri dönerler. Süpernatantı atın 1 mL PBS ekleyin ve tekrar süspansiyon tyavaşça 1 ml ucu ile 5x pipetleme o hücreleri.
- 8 dakika boyunca 500 x g'de Spin. 1 ml ucu kullanılarak Süpernatant atılır ve bazal ortamın 1 ml.
- (İsteğe bağlı) hücresel kalıntı gözlenirse, 70 um'lik bir hücre süzgecinden-hücreleri geçer.
- hemositometre ile hücrelerinin sayısını; Genel olarak, yaklaşık 30,000 - 60,000 hücre / SVZ elde edilir.
- % 5 CO2 ile 37 ° C 'de MGK orta ve kültür 10 mL, 10 cm tabak içine bir SVZ'unda hücreleri Plate.
- Küreler 49 arasında füzyon önlemek için (isteğe bağlı),% 5 CO2 ile 37 ° C 'de MGK orta ve kültür 1.5 mL ile doldurulmuş olan bir ultra-düşük-bağlayıcı 6-plaka tek bir bölmesinde 1.000 hücreleri koydu.
Not: 5-7 gün sonra, Neurospheres (Şekil 2A) gözlenebilir. kültürleme süresi farenin yaşına veya genetik kökenli farklı olabilir. - kültürünü korumak için her 3-4 günde MGK orta 2 mL ekleyin(Mevcut ortamı çıkarmayın).
Neurospheres ve Ciliogenesis Testleri Farklılaşma Kapasitesinin 2. Analiz
- farklılaşma kapasitesini analiz etmek için, farklılaşma ortamında yapışkan koşullar altında nöroküreleri analiz eder.
- otoklavda veya kullanımdan önce UV'ye maruz kalma ile 12 mm yuvarlak lamelleri sterilize edin. yapışkan bir hücre kültürü için, aseptik şartlar altında, bir 24-çukurlu plaka iyi bir steril 12 mm yuvarlak kapak cam koydu.
- Kaplama% 0.002 poli-L-lisin (PLL) 500 uL 10 s için cam kapak. çözelti aspire ve 10-15 dakika süre ile kurutulur.
- Laminin çözeltisi (5 ug / ml) 500 ul ilave edin. 37 ° C'de 1 saat boyunca cam kapak inkübe edin.
- laminin aspire ve farklılaşma orta veya MGK ortamında (farklılaşmamış kontrol) 500 uL ekleyin.
- mikroskop altında 200 uL ucu ile 200 um küre - farklılaşma deneyinde, bir 100 çekme. Eklemekfarklılaşma ortamında 7-10 gün için 24 plaka ve kültür her oyuğuna 5-10 Neurospheres.
- , Farklılaşmamış nöroküreleri analiz MGK ortamda 1-2 gün için 24 plaka ve kültür, her sıra için 5-10 nöroküreleri ekleyin. Ekli Neurospheres yayılmış ve bir tek tabaka (Şekil 2B) gibi büyür.
- dikkatle Ortamın çıkarılmasından sonra, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin düzeltmek ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez PBS ile yıkayın. plakası 1-2 ay için 4 ° C'de saklanabilir.
Not: (nöral kök / progenitör hücre işaretleme maddesi) Nestin karşı immun boyama gerçekleştirmek MGK orta nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşma ortamında farklılaşmış hücreleri görselleştirmek için, β-tübülin III (Tuj1 monoklonal nöronal markeri), GFAP (glial fibrilar asidik protein , astrosit markeri), ve O4 (oligodendrosit işaretleme maddesi) (Şekil 2B-D). (Arl13b karşı birincil ci immun boyama gerçekleştirmek, kirpikler analiz etmeklia işaretleme maddesi) ve Gpr161 (siliyer GPCR) (Şekil 3). - Bir slayt camına montaj çözümü ile kapak camı monte edin. fazla çözeltiyi almak için slayt cam yatırın.
Neurospheres içinde Ciliogenesis 3. Analiz
- immün bozulmamış neurospheres hücreleri analiz etmek için, kültür ortamının transferi 1 mL 1.5 ml tüp birden Neurospheres içeren ve 8 dakika boyunca 500 x g'de aşağı doğru döndürün. 15 dakika boyunca ortam çıkarıldıktan sonra% 4 (PFA) ile küreler düzeltmek ve PBS ile yıkayın. , 8 dakika boyunca 500 x g'de Küreler Spin süpernatant kaldırmak ve 4 ° C'de% 30 sukroz ile küreler O / N inkübe edin.
- 1 ml ucu kullanılarak Süpernatant atılır ve bir kesim 1 ml ucu oct kullanmanın çözeltisinin 500 uL ekleyin. Ekim viskoz olduğu gibi, açma genişletmek için uç kenarını kesin.
- bir tek kullanımlık plastik dondurma kalıp (10 mm x 10 mm x 5 mm) içine Neurospheres içeren Ekim çözeltisini.
- m Freezeen az 15 dakika boyunca kuru buz üzerinde eski.
- (İsteğe bağlı) deney durdurun ve 1 yıla kadar bir -80 ° C dondurucu içinde kalıp saklayın.
- Bir kriyostat ile bölümleri kesme; bölümlerin kalınlığının 15-30 um olmalıdır.
- Bir neurosphere birincil kirpikler görselleştirmek için, Arl13b karşı immun boyama (Şekil 4) gerçekleştirir.
4. Kültür ve nöroküreleri ve Yapışık NSC'lerde Passage
- Geçiş Neurospheres küre boyutu 100-200 um arasında iken; Neurospheres (300 mm veya üzeri) çok büyük olduğu zaman, bunlar deneyler için ideal değildir.
- 1 ml ucunu kullanarak bir 50 ml tüp içine nöroküreleri aktarın ve 8 dakika boyunca 500 x g'de aşağı doğru döndürün.
- Bir aspiratör kullanılarak Süpernatant atılır, PBS içinde% 0.05 tripsin-EDTA 500 uL ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir. Tripsin miktarı, küre sayısına bağlı olarak değişmektedir.
- yavaşça serum ortamına ve boru 500 mcL1 ml ucu t 20 kez.
- 8 dakika boyunca 500 x g'de Spin. 1 ml ucu kullanılarak Süpernatant atılır ve bazal ortamın 1 ml.
- (İsteğe bağlı) hücresel döküntü veya çözünmemiş Neurospheres görülürse, 70 um'lik bir hücre süzgecinden-hücreleri geçer.
- Geçiş MGK ortamı içinde 10,000 hücre / cm2'lik bir yoğunlukta bir 10 cm'lik bir tabakta hücreleri; Hücreler bir hafta sonra bir sonraki geçişi için hazır olacaktır.
- (İsteğe bağlı) 500.000 ila 1.000.000 hücre / ml süspansiyon elde etmek üzere orta dondurma ekleyin hücreleri dondurmak için. Kriyo-dondurma kaplar kullanılarak hücreler dondurma; ayrışmamış nöroküreler da dondurulabilir.
- Yapışkan kültür için, 50,000 hücre / PLL- ve üzerine cm2 hücreleri dillute 1-2 gün MGK orta lamelleri ve kültür laminin kaplı.
5. Açlık ve kirpikler analizi
- Starvasyon ortamını (Tablo 1) hazırlayın.
- 1-2 gün, ilk pl sonraayrışma, diğer bir yerde oyuk (kontrol) ve starvasyon ortamlarında MGK ortamına, değişim de (deney) sonra, uçucu hücrelerin ating.
- Kültür 24 saat yapışık hücreleri.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 PFA hücreleri saptamak ve oda sıcaklığında her biri 5 dakika için PBS ile iki kez yıkanır.
- (İsteğe bağlı) deney durdurun ve 1-2 ay için 4 ° C'de PBS içinde lamelleri ile 24 oyuklu plakalar saklayın.
- 7, 50 boyanması için bir immüno-floresan protokolü gerçekleştirin.
- Montaj çözümü kullanarak lamelleri monte edin. karanlıkta, oda sıcaklığında sürgü cam O / N kurutun.
- Gerekli büyütmede bir bileşik mikroskop görüntüleri elde edin. eşlik yazılımı kullanılarak kontrol edilen bir mikroskop, kamera ve amaçları (40X / 1.3 yağ ve 63X / 1.4 yağ) kullanın. 0.5-0.8 um aralıklarla (Şekil 5) yeterli z bölümleri al.
- siliyer lokalizasyonu kantitatif analizinde içinyapışkan hücreler, DAPI kanalı içine bakarak birleşik hücreler ile 3-8 ardışık alanlardan görüntülerin yığınlarını edinirler. ImageJ / Fiji kullanılarak primer kirpikler sayısını ölçmek. Tipik olarak,> ImageJ Eklentileri "Hücre sayacı" aracını kullanın GPCR pozitif kirpik bulunan hücreleri saymak için iletişim kutusunu analiz; görüntülerin yığınları gelen maksimum çıkıntılar sayımı ve dışa amacıyla aynı deneyden tüm görüntüler için ImageJ / Fiji.Use benzer görüntü yeğinliğinin doğruluğu ve kontrast parametrelerinden de ihraç edilebilir.
Neurospheres 6. transfeksiyonu
- Uyun, 24 saat süreyle kapak slipleri hücreleri ayrışmış. 24 kuyucuklu bir plakanın tek bir bölmesinde 500 uL MGK ortam içinde tipik olarak 75,000 ila 150,000 hücre bir hücre yoğunluğuna kullanın.
- 5 saniye boyunca burgaç halinde bir 0.5 mL mikrotüp düşük serum ortamına 25 uL ve transfeksiyon reaktifi 1.5 uL karıştırın.
- Ayrı bir 0.5 mL microtub endotoksin içermeyen plazmid DNA'nın 2.5 ug eklemedüşük serum ortamında 25 uL içeren ve 5 saniye girdap oluşturarak karıştırın örn.
- İkinci mikrotüp içeren DNA transfeksiyon reaktifi 1 uL ekleyin ve 5 saniye boyunca burgaç halinde karıştırın.
- İlk mikrotüp DNA içeren tüp karışımı ekleyin ve pipetleme karıştırın.
- Oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe karışımı. İnkübasyondan sonra, yavaşça MGK orta en (500 uL / oyuk) ile ilgili oyuklara transfeksiyon karışımı, damla damla ilave edilir.
- ortamı (NSC ortamı) ya da starvasyon ortamını (500 uL / oyuk) kontrol etmek için ortam 24 saat sonra transfeksiyon değiştirin.
- 24 saat sonra% 4 PFA orta değiştirerek hücreleri saptamak ve immun boyama yapmak; tipik olarak,% 10 transfeksiyon verimliliği kadar bu protokolü kullanılarak elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir hafta MGK ortamında SVZ'unda hücreleri kaplama sonra, yüzer Neurospheres (Şekil 2A) gözlenmiştir. kürelerin büyüklükleri 50 ila 200 um arasında değişmektedir. Küreler nöral kök / progenitör hücreler elde edilmiştir olmadığını belirlemek için Neurospheres PLL- ve üzerine plakalanmıştır 2 gün MGK orta lamelleri laminin kaplı. Daha sonra nöral kök / progenitör hücre işaretleyici, Nestin karşı boyama yapıldı. İki gün küreler lamelleri eklemek için ve hücrelerin bir tek tabaka olarak büyümelerine izin gerekiyordu. Hücrelerinin tek tabakalı Nestin (Şekil 2B) olarak rapor edilmiştir. neurospheres farklılaşma kapasitesi incelemek için, PLL- ve üzerine bölüm 2'de belirtilen adımları bunları kaplama 7-10 gün ayrışma olmadan farklılaşma ortamında lamelleri laminin kaplı. Bu farklılaşma için en az bir hafta sürer. Neurospheres lamelleri bağlı ve genişletmeked hücrelerin tek bir tabakası olarak büyümeye. Biz hücrelerini sabit ve nöron, astrositler ve oligodentrosit belirteçleri karşı immunohistokimyasal. Biz β-Tübülin III pozitif nöronlarının, GFAP-pozitif astrositler ayrışmıştır yapışkan Neurospheres gözlenmiştir ve O4 pozitif oligodendrositlerin (Şekil 2C-E). Bu nedenle, multipotent Neurospheres yetişkin fare SVZ'unda türetilebilir.
Yapışkan Neurospheres ve farklılaşmış nöronların primer kirpikler olup olmadığını belirlemek için, Arl13b (primer kirpik işaretleme maddesi) 51 ve Gpr161 (kirpiksi-lokalize GPCR) 7 karşı immüno. Tüm nöronlar 52, 53, 54-pozitif ACIII değil iken bizim ARL13B-mCherry ifade eden mevcut fare modellerinde deneyimi ve gelişmekte fare korteks ile çalışmalarda olarak, (hepsi değilse de) çoğu beyindeki nöronal kirpikler, Arl13b ifade. Pers, ağırlıklı olarak nöronal kirpikler algılamak için Arl13b güvenmektedir. Birincil kirpikler ve yapışmış neurospheres (Şekil 3A) progenitör hücrelerin kirpikler ve farklılaşmış nöronların (Şekil 3B) Gpr161 lokalizasyonunu tespit edildi. Bu durumda, yapışkan Neurospheres ve farklı soylar kültürde kirpikli ve sinyal molekülleri lokalize edilir.
Bu kesit neurospheres nöral kök / progenitör hücreleri (Şekil 4A-B) 'de primer kirpikler görülen bölüm 3'de tarif edilen yüzer Neurospheres primer kirpikler olup olmadığını belirlemek için, biz tespit sonrası yüzen Neurospheres cryosectioned. tek bir z-düzleminde birincil kirpikler tetkik edilmesi zor olduğu için, tamamen birincil kirpikler görselleştirmek için neurospheres boyunca z-bölümleri elde etmek için önemlidir. Özetle, farklılaşmamış Neurospheres silli olmayan silli hücrelerin heterojen popülasyonları sahiptir.
(Şekil 5A-B) 'de kültüre kıyasla olarak, Arl13b ile tespit edildiği üzere, kirpikler artan bir yüzdesini görülmektedir. Buna ek olarak, (% Gpr161 pozitif kirpikler / Arl13b pozitif silia) (Şekil 5A-B) açlık üzerine Gpr161 pozitif kirpikler fazla sayıda belirtti. İlginç bir şekilde, farklılaşmamış insan embriyonik kök hücre çizgileri kullanılarak bir önceki çalışma kültürde insan embriyonik kök hücreler, aynı zamanda birincil kirpikler 55 sahip olduğunu göstermiştir. sayısı ve bu hücre hatlarında, serum açlığından sonra kirpikler artış uzunluğu ve bu kirpikler da Shh makine bileşeni bulunmaktadır.
Biz de yapışık nöral kök / progenito transfektebölüm 6'da belirtildiği gibi R hücreleri, Normal olarak, laboratuar (Şekil 6) primer nöron kültürlerinden benzer% 10'a kadar bir transfeksiyon verimi tespit edildi.
| Çözüm | Bileşen |
| 1x PBS | 10x PBS otoklavlı su ile seyreltin |
| MGK orta | 2 ml 50x B27 |
| 1 ml 100 x N2 | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| FGF-bazik (insan bFGF) (stok çözelti 25 ng / Neurobasal orta mL): 100 ml ortam için 20 ng / ml veya 2 mg Toplam | |
| EGF (stok çözelti 25 ng / Neurobasal orta mL): 100 ml ortam için 20 ng / ml veya 2 mg Toplam | |
| 95 mL bazal ortamı | |
| İnsan FGF-bazik (insan bFGF) | Ticari insan bFGF 25 ug şişeye 1 ml bazal ortamı |
| -20 ° C veya daha düşük steril mikro-tüpler içinde depolayın. Tek bir 80 uL aliko ya da 2 ug / 100 ml MGK ortamı kullanın. | |
| EGF | Ticari EGF 20 ug şişeye 8 mL bazal ortamı ekleme |
| -20 ° C veya daha düşük olarak steril mikrotüpler saklayın. Tek bir 80 ug alikosu / 100 ml ortamı kullanın. | |
| Durdurma orta | 1 ml FBS |
| 75 U Dnaz I (PBS içinde 75 U / ul) | |
| 9 ml PBS | |
| Serum orta | 1 ml FBS |
| 9 mL Bazal ortam | |
| Donma ortamı | 4 mL DMSO |
| 24 mL bazal ortamı | |
| 12 mL% 30 FBS | |
| Farklılaşma orta | 90 ml bazal ortamı |
| 5 ml% 5 FBS | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100 x N2 | |
| 2 ml 50x B27 | |
| FGF-bazik (insan bFGF) (25 ng stok çözeltisi / Neurobasal orta mL): 100 mL için 10 ng / ml veya 1 mg Toplam | |
| Açlık orta | 95 mL bazal ortamı |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100 x N2 | |
| 2 ml 50x B27 |
Tablo 1: Çözümlerin Reçete.
1 ">: "keep-together.within sayfa = fo" ve_content
Şekil 1: Neurosphere Kültür ve Farklılaşma Protokolleri Şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: Neurospheres Sergi farklılaşma kapasitesi. (A), Örnek Neurospheres gösterilmiştir. (B) Neurospheres 2 gün MGK ortamında PLL- ve laminin ile kaplanmış lameller üzerine kaplandı ve Nestin karşı (nöral kök / progenitör hücre markörü) boyama yapıldı. (CE) Neurospheres PLL- ve üzerine bölüm 2'de belirtilen aşama aşağıdaki kaplanmıştır 7 gün witho farklılaşma ortamında lamelleri laminin kaplıut ayrışma; sabit; ve β-Tübülin III (nöronal belirteç), GFAP (astrosit işaretleme maddesi) ve O4 (oligodendrosit markeri) karşı immüno. çekirdekleri DAPI ile boyanmıştır. Ölçü bar = 100 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: Yapışkan Farklılaştırılmış Neurospheres içinde Neurospheres ve nöronlar Silli vardır. (A), çözünmemiş Neurospheres 2 gün boyunca MGK orta kaplanmış lameller üzerine kaplandı; sabit; ve Gpr161 (yeşil), Arl13b (kırmızı) ve DNA (mavi) karşı immunohistokimyasal. (B) farklı nöronların Gpr161 (yeşil), Arl13b (kırmızı, A) ya da β-Tübülin III (kırmızı, B) ve DNA (mavi) karşı boyama yapıldı. Beyaz oklar siliyalarda Gpr161 yerelleştirme gösterir.(A) sağ panel beyaz ok ile gösterilen birinci cilium büyütülmüş görünüşleridir. beyaz kutu nöron Gpr161 pozitif kirpik (B) 'de sağ tarafında gösterilir. Ölçek = 10 um (A); 50 um (B). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: Yüzer, ayrım Neurospheres Silli hücreler sahiptir. Yüzer Neurospheres, OCT içine yatırılmıştır ve sabit cryosectioned ve Arl13b (kırmızı) ve DNA'ya karşı immüno-floresan için işlenmiştir. Bir neurosphere içinde Arl13b pozitif primer kirpikler gösterilmiştir. (A) panel neurosphere 0.8 um aralıklarla 14 Z-kesitlerinin maksimum yoğunluklu projeksiyonudur. Paneller (B), c büyütülmüş bir görünümünü göstermektedir(A), beyaz bir çerçeveli bölgeye de iliated hücreleri. sayı 1 ila 14 tek tek z bölümlerine işaret ederken, tüm Z-kesitlerinden maksimal projeksiyon görüntüsü, bir yığın olarak gösterilmiştir. Beyaz oklar primer kirpikler göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5: Ayrılan yapışık Sinir kök / progenitör hücrelerinde Açlık İndükler Ciliogenesis. (A), Ayrılan hücreler, MGK orta veya 24 saat boyunca açlık ortamında kaplanmış lameller üzerine kaplandı; sabit; ve Gpr161 (yeşil), Arl13b (kırmızı) ve DNA (mavi) karşı immunohistokimyasal. Gpr161 pozitif kirpikler kontrol (sol) ve açlıktan (sağ) hücrelerde görülmektedir. Alt paneller ilgili belirtilen beyaz kutular büyütülmüş görünüşleridirÜst panel. beyaz oklar ve ok başları sırasıyla Gpr161 pozitif ve negatif kirpikler göstermektedir. Ölçü bar = 100 um. Arl13b pozitif kirpikli hücrelerin (sol grafik) ve Gpr161 kontrol ve açlıktan hücrelerde Arl13b pozitif kirpikler (sağ grafik) lokalize (B) miktarının belirlenmesi. Arl13b pozitif kirpikli hücreleri ve Gpr161 Arl13b pozitif kirpikler lokalize ikisinin de yüzdeleri açlık ile artmıştır. Nicelik tayini tek Deneyin iki teknik tekrarlanmış olan bakış iki alan her birinden yapıldı. veriler ± standart sapma, tüm bakış 4 alanlardan ortalama olarak temsil edilir. * P <0.05; ** p <0.01. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 6: in transfeksiyonuDisosiye Yapışık Nöral Kök / Ata Hücreleri. Kaplanmış lamelleri kaplama Ayrılan hücreler, göbek IFT-kompleks ile 56 bağlanmayan bir LAP-TULP3 N-ucunda (1-183 aa) mut12 yapısı ile transfekte edildi. Orta starvasyon ortamıyla 24 saat sonra, transfeksiyon için değiştirildi. Hücreler, 24 saat daha sonra sabit ve GFP (yeşil) karşı boyama yapıldı Gpr161 (kırmızı), Arl13b (eflatun) ve DNA (mavi). kirpikler olmayan bir transfekte edilmiş hücre, beyaz bir ok ile gösterilen sırada Gpr161- ve Arl13b pozitif cilium ile transfekte edilmiş bir hücre, beyaz bir ok ile işaretlenmiştir. Sarı oklar ve ok başları ya da sırasıyla Gpr161 / Arl13b olmadan edilmemiş hücrelere etmektedir. Ölçek çubuğu 10 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, üretmek ve yetişkin fare SVZ'unda gelen neurosphere kültürleri korumak için bir yöntem açıklanmaktadır. aşağıdaki gibi kültürleri ile ilgili birkaç uygun noktalardır. 200 um - İlk olarak, kürelerin büyüklükleri tipik olarak 50 arasındadır. Bir neurosphere çapı daha büyük 300'den um alır Deneyimlerimize göre,, geçiş için en uygun zaman cevapsız edilmiştir. Bu daha büyük küre çekirdek ölü hücreleri ihtiva etmektedir. Neurospheres yaygın sinir kök / progenitör hücreleri incelemek için kullanılır İkinci olarak, hücrelerin stemness korumak için EGF ve FGF-bazik (bFGF) kullanmak önemlidir. Bu nedenle, FBS olarak farklılaşmasını teşvik faktörler, neurospheres bakımı sırasında kaçınılmalıdır. % 10 FBS astrositler 47 içine nöroküreleri farklılaşabildiği gösterilmiştir. Üçüncü olarak, nöronal farklılaşma derecesi farenin yaşına bağlı olabilir. bir neurospheres daha nöronal farklılaşma, genç fareler istiyorsa (doğum sonrası day, 0) kullanılabilir. yeni kültürleri başlangıç eğer Dördüncü, neurospheres farklılaşma kapasitesinin incelemek her zaman iyidir. Beşinci olarak, bizim metot aynı zamanda gelecekteki deneysel kullanım için kurulan neurosphere kültürlerden dondurulmasını ve erimesini sağlar. Eritme sonrasında, hücreler tipik olarak, poli-L-lisin ya da laminin olmadan yapışık iğsi hücreleri büyür. Bu hücrelere donma-çözülme hasarı neden olabilir. geçit önce% 80 birleşmiş - Onlar 60 olana kadar büyüyen hücreleri tutmak önemlidir. geçişten sonra, hücreler tipik neurospheres olarak büyümeye ve genellikle 5 kadar pasajlanabilir olabilir - 10 kez.
Neurosphere tabanlı kültür yöntemleri bize siliyer trafiği ve nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların sinyal yollan araştırmak için izin verir. Biz yüzen / yapıştırıcı ve farklılaşmış neurospheres birincil kirpikler inceledi. Neurospheres tam düzeyine boyunca kirpikler görselleştirmek için çeşitli z bölümleri elde etmek önemlidir. Bundan başka, arkaer, bu neurospheres yapışkan kültürler üretilmesi, ve 24 saat boyunca bunları açlıktan, hücrelerin çoğunun (Şekil 5) kirpikli ve yetim GPCR, Gpr161 zenginleştirilmiş. Bununla birlikte, alt-hücresel vakuolar yapılarda yapışkan kültürler sonuçların açlık uzun süreli. Bu nedenle, dikkatli özel deneysel amaçlar için açlık sürelerini optimize etmek için önemlidir.
Şu anda, ciliogenesis üzerinde çalışmalar ağırlıklı olarak birkaç kirpikli yapılmaktadır, hücre hatları 57 ölümsüzleşmiş. Bu hücre hatları hep sadakatle zorunludur biyolojik süreçlerde kirpikler rolünü incelemek için yeni yöntemler geliştirmek için yapım böyle GPCRs veya Shh yolu makine olarak sinyal parçası ile ifade nöronlar ve nöral kök / progenitör hücreler recapitulate yoktur. Burada tarif edilen neurosphere bazlı yöntemler us nöral kök / progenitör hücreler ve fark bağlamında GPCR ve Shh sinyalinin içeren kirpikler regüle yolakları, çalışma izinfarklılaşmış nöronlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
- Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
- Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
- Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
- Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
- Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
- Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
- Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
- Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
- Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
- Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
- Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
- Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G.
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
- Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
- Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
- Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
- Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
- Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
- Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
- Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
- Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
- Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
- Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
- Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
- Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
- Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
- Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
- Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
- Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
- Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).
