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Developmental Biology

अध्ययन के लिए प्राथमिक सिलिया प्राथमिक neurosphere संस्कृति का उपयोग करना

Published: April 14, 2017 doi: 10.3791/55315
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

प्राथमिक पपनी तंत्रिका पूर्वज कोशिका प्रसार, neuronal भेदभाव, और वयस्क न्यूरोनल समारोह में मूल रूप से महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम ciliogenesis और प्राथमिक neurosphere संस्कृतियों का उपयोग कर तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और विभेदित न्यूरॉन्स में सिलिया के लिए प्रोटीन संकेत की तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन।

Introduction

प्राथमिक पपनी एक सूक्ष्मनलिका आधारित गतिशील subcellular डिब्बे है कि भ्रूण neuronal विकास 1, 2 के दौरान ध्वनि Hedgehog (श्श्श) मार्ग सहित सेलुलर संकेत दे रास्ते, समन्वय में एक संवेदी एंटीना, और वयस्क न्यूरोनल समारोह 3 में बंटे subcellular सिगनल, 4 के रूप में कार्य । इस तरह के श्श्श रिसेप्टर समझौता 5 के रूप में इन रास्ते, के घटक संकेत; मार्ग उत्प्रेरक smoothened (एसएमओ) 6; और Gpr161 7, एक अनाथ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) को नकारात्मक रूप श्श्श मार्ग को नियंत्रित करता है, सिलिया के लिए एक गतिशील फैशन में स्थानीय बनाना। एकाधिक GPCRs मस्तिष्क 7, 8, 9, 10 में न्यूरॉन्स में सिलिया को स्थानीय बनाना सूचित किया गया है sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16। सिलिया और सिलिया-उत्पन्न संकेत रास्ते में दोष कई ऊतकों को प्रभावित और सामूहिक रूप से ciliopathies 17, 18, 19 के रूप में जाना जाता है। Ciliopathy रोग स्पेक्ट्रम अक्सर इस तरह के craniofacial असामान्यताएं 20, 21, 22 के रूप में neurodevelopmental दोष, भी शामिल है। इसके अलावा, हाइपोथेलेमिक न्यूरॉन में प्राथमिक सिलिया केंद्रीय तृप्ति रास्ते को विनियमित, और दोषों केंद्रीय मोटापा 23 में परिणाम, इस तरह के बार्डेट Biedel सिंड्रोम 24 के रूप में स्यन्द्रोमिक ciliopathies में मोटापे को प्रतिबिंबित। इसके अलावा, न्यूरोपेप्टाइड रिसेप्टर सिलिया में संकेत centr को नियंत्रित करता हैअल तृप्ति 11 रास्ते, 14। इस तरह के हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में सोमेटोस्टैटिन रिसेप्टर 3 के रूप में adenylyl cyclase तृतीय (ACIII) और GPCRs के सिलिअरी स्थानीयकरण उपन्यास वस्तु की पहचान दोषों और स्मृति घाटे 25, 26 में परिणाम और रोमक अखंडता 27 की कमी समानताएं। सिलिया-उत्पन्न संकेत के विकास के पहलुओं को बारीकी से ऊतक homeostasis से बंधा रहे हैं; विशेष रूप से, सिलिया सेरिबैलम 28, 29 में ग्रेन्युल पूर्वज से उत्पन्न होने वाली श्श्श-उप प्रकार medulloblastomas की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, प्राथमिक सिलिया भ्रूण, प्रसव के बाद, और वयस्क न्यूरोनल विकास और समारोह के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) subventricular क्षेत्र पार्श्व वेंट्रिकल की (SVZ), हिप्पोकैम्पस के देंताते जाइरस की subgranular क्षेत्र, और में रहते हैंस्तनधारियों 30, 31, 32 में हाइपोथेलेमस में तीसरे निलय की निलय क्षेत्र। एनएससी, multipotent हैं आत्म नवीकरण के लिए क्षमता के अधिकारी, और मस्तिष्क के विकास और पुनर्योजी चिकित्सा 30 के लिए महत्वपूर्ण हैं। SVZ में अधिकांश एनएससी मौन कर रहे हैं और एक एकान्त प्राथमिक पपनी कि, कई मामलों में, पार्श्व वेंट्रिकल 33 के लिए बाहर फैली हुई है मेरे पास है। विभिन्न रिसेप्टर्स की स्थानीयकरण, नीचे की ओर सेलुलर प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण, विशेष रूप से श्श्श, TGFβ, और रिसेप्टर tyrosine kinase रास्ते 2, 34, 35, 36 के संबंध में के माध्यम से प्राथमिक पपनी संकेत है। के बाद से प्राथमिक सिलिया पार्श्व निलय में विस्तार, यह धारणा है कि प्राथमिक सिलिया मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) एनएससी 37 सक्रिय करने के लिए साइटोकिन्स का पता लगाने के 38, 39, 40, 41 सहित कई ऊतकों के उत्थान के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, जो सीएसएफ से तंत्र एनएससी के साथ संचार और क्या प्राथमिक सिलिया शामिल कर रहे हैं ज्ञात नहीं हैं। संस्कृति में पक्षपाती एनएससी रोमक कर रहे हैं; स्थानीय बनाना इस तरह के एसएमओ और Gpr161 सिलिया में के रूप में श्श्श मार्ग घटकों,; और श्श्श उत्तरदायी 42 कर रहे हैं। इस प्रकार, एनएससी श्श्श मार्ग का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली, सिलिअरी की तस्करी, और neuronal भेदभाव रास्ते के रूप में काम कर सकते हैं। इसके अलावा, एनएससी से विभेदित न्यूरॉन्स भी सिलिअरी तस्करी assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Neurospheres neura के प्रसार से उत्पन्न होने वाले मुक्त रूप से प्रवाहित कोशिकाओं के समूहों का गठन कर रहे हैंएल स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि विशिष्ट विकास कारकों और nonadhesive सतहों 43, 44 की उपस्थिति में हो जाना। Neurospheres सामान्य विकास और रोग 31, 45, 46, 47 में तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो संस्कृति मॉडल में के रूप में महत्वपूर्ण काम करते हैं। यहाँ, हम तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं संवर्धन के लिए और में न्यूरॉन्स / glia भेदभाव के लिए एक neurosphere आधारित परख का वर्णन। हम विशेष रूप से तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और विभेदित न्यूरॉन्स (चित्रा 1) के सिलिया के घटकों संकेत की तस्करी पर जोर देना। के रूप में प्राथमिक न्यूरॉन्स संवर्धन करने का विरोध किया, प्राथमिक neurospheres, संस्कृति अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं कई मार्ग के लिए उत्तरदायी होते हैं और फ्रीज-पिघलाव चक्र, और में न्यूरॉन्स / glia भेदभाव से गुजरना कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, हम चाहते हैं कि neurosphere व्युत्पन्न तंत्रिका निर्धारितस्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और विभेदित न्यूरॉन्स संस्कृति में रोमक कर रहे हैं और इन डिब्बों में सिलिअरी समारोह के लिए प्रासंगिक संकेतन अणुओं स्थानीय बनाना। Neurosphere आधारित संवर्धन तरीकों एनएससी और विभेदित न्यूरॉन्स में ciliogenesis और रोमक तस्करी के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली के रूप में काम कर सकते हैं।

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Protocol

वयस्क माउस मस्तिष्क से Neurospheres की 1. अलगाव

  1. isoflurane की अधिक मात्रा से एक वयस्क माउस (लगभग 2 महीने पुरानी) euthanize। दो बार जांचें कि माउस साँस लेने में बंद कर दिया और मौत के तुरंत बाद काटना गया है।
  2. कैंची का प्रयोग, खोपड़ी खोलने के लिए एक मध्य रेखा चीरा बनाने। मस्तिष्क निकालें।
  3. ठंड पीबीएस में मस्तिष्क बर्फ पर एक 10 सेमी डिश में रखें। पार्श्व वेंट्रिकल 48 से SVZ प्राप्त करने के लिए पूरे माउंट विच्छेदन विधि का पालन करें।
  4. पार्श्व वेंट्रिकल एक 1.5 एमएल ट्यूब में रखें, पीबीएस में 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA के 500 μL जोड़ने के लिए, और एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं।
  5. 15 मिनट के बाद, रोक माध्यम के 500 μL जोड़ें और धीरे 20 pipet - एक 1 एमएल टिप के साथ 30 बार। pipetting दौरान हवाई बुलबुले के गठन से बचें।
    नोट: यह कदम सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. 8 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, पीबीएस के 1 एमएल जोड़ने के लिए, और resuspend टीवह धीरे से एक 1 एमएल टिप के साथ 5x pipetting द्वारा कोशिकाओं।
  7. 8 मिनट के लिए 500 XG पर नीचे स्पिन। एक 1 एमएल टिप का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बेसल माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
  8. (वैकल्पिक) सेलुलर मलबे मनाया जाता है, तो एक 70 सुक्ष्ममापी सेल छन्नी के माध्यम से कोशिकाओं गुजरती हैं।
  9. एक hemocytometer साथ कोशिकाओं की संख्या की गणना; सामान्य रूप में, के बारे में 30,000 - 60,000 कोशिकाओं / SVZ प्राप्त कर रहे हैं।
  10. एक 10 सेमी 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एनएससी मध्यम और संस्कृति के 10 एमएल के साथ डिश में एक SVZ से कोशिकाओं प्लेट।
  11. (वैकल्पिक) क्षेत्रों के बीच 49 संलयन से बचने के लिए एक अति कम बाध्यकारी 6-अच्छी तरह से थाली कि 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एनएससी मध्यम और संस्कृति के 1.5 एमएल से भरी हुई है है एक भी अच्छी तरह से में 1,000 कोशिकाओं डाल दिया।
    नोट: 5-7 दिनों के बाद, neurospheres मनाया जा सकता है (चित्रा 2A)। संवर्धन अवधि माउस की उम्र या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ अलग हो सकता है।
  12. एनएससी माध्यम के 2 एमएल संस्कृति को बनाए रखने में जोड़े हर 3-4 दिन(मौजूदा मध्यम हटाने नहीं है)।

2. Neurospheres और Ciliogenesis टेस्ट विभेदन क्षमता का विश्लेषण

  1. भेदभाव क्षमता का विश्लेषण करने के लिए, भेदभाव माध्यम में पक्षपाती शर्तों के तहत neurospheres का विश्लेषण।
  2. autoclaving द्वारा या यूवी जोखिम उपयोग करने से पहले साथ 12 मिमी दौर coverslips जीवाणुरहित। एक पक्षपाती सेल संस्कृति के लिए, एक 24-अच्छी तरह से थाली अपूतित शर्तों के तहत की एक कुएं में एक निष्फल 12 मिमी दौर कवर गिलास रखा।
  3. कोट 0.002% पाली एल लाइसिन (पीएलएल) के 500 μL के साथ 10 एस के लिए कवर गिलास। समाधान Aspirate और 10-15 मिनट के लिए इसे सूखने।
  4. laminin समाधान (5 माइक्रोग्राम / μL) के 500 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कवर गिलास सेते हैं।
  5. laminin Aspirate और भेदभाव मध्यम या एनएससी मध्यम (undifferentiated नियंत्रण) के 500 μL जोड़ें।
  6. खुर्दबीन के नीचे एक 200 μL टिप के साथ 200 सुक्ष्ममापी क्षेत्र - भेदभाव परख के लिए, 100 लेने। जोड़नाएक 24 अच्छी तरह से थाली और भेदभाव माध्यम में 7-10 दिनों के लिए संस्कृति के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 5-10 neurospheres।
  7. undifferentiated neurospheres का विश्लेषण करने के लिए, एनएससी मध्यम में 1-2 दिनों के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली और संस्कृति के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 5-10 neurospheres जोड़ें। संलग्न neurospheres फैलाने और एक monolayer (चित्रा 2 बी) के रूप में विकसित।
  8. ध्यान से मध्यम हटाने के बाद, आर टी पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक है, और फिर आरटी पर 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस के साथ धोएं। प्लेट 1-2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    नोट: एनएससी मध्यम में तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और भेदभाव माध्यम में विभेदित कोशिकाओं कल्पना करने के लिए, Nestin के खिलाफ immunostaining प्रदर्शन (तंत्रिका स्टेम / पूर्वज सेल मार्कर), β ट्यूबिलिन III (TUJ1 मोनोक्लोनल न्यूरोनल मार्कर), GFAP (Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन , astrocyte मार्कर), और O4 (oligodendrocyte मार्कर) (चित्रा 2 बी-ई)। सिलिया का विश्लेषण करने के लिए, (Arl13b के खिलाफ immunostaining प्रदर्शन प्राथमिक ciलिया मार्कर) और Gpr161 (सिलिअरी GPCR) (चित्रा 3)।
  9. एक स्लाइड कांच पर समाधान बढ़ते के साथ कवर गिलास माउंट करें। अतिरिक्त समाधान निकालने के लिए स्लाइड कांच झुकाएँ।

Neurospheres में Ciliogenesis की 3. विश्लेषण

  1. immunostaining द्वारा बरकरार neurospheres में कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए, हस्तांतरण 1 संवर्धन माध्यम की एमएल 1.5 एमएल ट्यूब के लिए कई neurospheres युक्त और 8 मिनट के लिए 500 XG पर नीचे स्पिन। 15 मिनट के लिए मध्यम हटाने के बाद 4% (पीएफए) के साथ क्षेत्रों को ठीक करें और पीबीएस के साथ धोएं। 8 मिनट के लिए 500 XG पर क्षेत्रों नीचे स्पिन, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 4 डिग्री सेल्सियस पर क्षेत्रों हे / एन 30% sucrose के साथ सेते हैं।
  2. एक 1 एमएल टिप का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एक कट 1 एमएल टिप का उपयोग कर अक्टूबर समाधान के 500 μL जोड़ें। उद्घाटन को चौड़ा करने के लिए, के रूप में अक्टूबर चिपचिपा है टिप के किनारे काट लें।
  3. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक ठंड ढालना (10 मिमी x 10 मिमी x 5 मिमी) में neurospheres युक्त अक्टूबर समाधान स्थानांतरित करें।
  4. मीटर फ्रीजकम से कम 15 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर पुराने।
  5. (वैकल्पिक) प्रयोग बंद करें और अप करने के लिए 1 वर्ष के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ढालना की दुकान।
  6. cryostat के साथ वर्गों कट; वर्गों की मोटाई 15-30 सुक्ष्ममापी होना चाहिए।
  7. एक neurosphere में प्राथमिक सिलिया कल्पना करने के लिए, Arl13b के खिलाफ immunostaining (चित्रा 4) प्रदर्शन करते हैं।

4. संस्कृति और Neurospheres और पक्षपाती एनएससी के पारित

  1. मार्ग neurospheres जबकि क्षेत्र आकार 100-200 सुक्ष्ममापी के बीच है, जब neurospheres बहुत बड़ा (300 सुक्ष्ममापी या ऊपर) हैं, वे प्रयोगों के लिए आदर्श नहीं हैं।
  2. एक 1 एमएल टिप का उपयोग कर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में neurospheres स्थानांतरण और 8 मिनट के लिए 500 XG पर नीचे स्पिन।
  3. एक चूषित्र का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें, पीबीएस में 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA के 500 μL जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। ट्रिप्सिन की राशि क्षेत्रों की संख्या पर निर्भर करता है।
  4. सीरम मध्यम और धीरे पाइप के 500 μL जोड़ेंएक 1 एमएल टिप के साथ टी 20 बार।
  5. 8 मिनट के लिए 500 XG पर नीचे स्पिन। एक 1 एमएल टिप का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बेसल माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
  6. (वैकल्पिक) सेलुलर मलबे या undissociated neurospheres में देखा जाता है, तो एक 70 सुक्ष्ममापी सेल छन्नी के माध्यम से कोशिकाओं गुजरती हैं।
  7. मार्ग 10,000 कोशिकाओं / सेमी 2 एनएससी मध्यम में की एक घनत्व में एक 10 सेमी डिश में कोशिकाओं; कोशिकाओं एक सप्ताह के बाद अगले पारित होने के लिए तैयार हो जाएगा।
  8. (वैकल्पिक) कोशिकाओं फ्रीज करने के लिए, ठंड मध्यम 500,000 1,000,000 कोशिकाओं / एमएल निलंबन उत्पन्न करने के लिए जोड़ें। क्रायो-ठंड कंटेनरों का इस्तेमाल किया कोशिकाओं फ्रीज; undissociated neurospheres भी जमे हुए किया जा सकता है।
  9. में लिपटे Laminin एनएससी मध्यम के साथ coverslips, और संस्कृति 1-2 दिनों के लिए पक्षपाती संस्कृति के लिए, 50,000 कोशिकाओं / PLL- और पर सेमी 2 करने के लिए कोशिकाओं dillute।

5. भुखमरी और सिलिया का विश्लेषण

  1. भुखमरी मध्यम (तालिका 1) तैयार करें।
  2. 1-2 दिनों के प्रारंभिक pl के बादपृथक्करण, अच्छी तरह से किसी अन्य रूप में एक अच्छी तरह से (नियंत्रण) और भुखमरी माध्यम में एनएससी माध्यम के परिवर्तन (प्रयोग) के बाद पक्षपाती कोशिकाओं के ating।
  3. संस्कृति 24 घंटे के लिए पक्षपाती कोशिकाओं।
  4. आरटी पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पीएफए ​​के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और आरटी पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  5. (वैकल्पिक) प्रयोग बंद करें और 1-2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में coverslips के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेटों की दुकान।
  6. 7, 50 धुंधला के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल निष्पादित करें।
  7. बढ़ते समाधान का उपयोग कर coverslips माउंट। सूखी अंधेरे में स्लाइड कांच ओ / आर टी में एन।
  8. आवश्यक आवर्धन पर एक जटिल सूक्ष्मदर्शी पर चित्र प्राप्त। एक खुर्दबीन, एक कैमरा, और उद्देश्यों (40X / 1.3 तेल और 63X / 1.4 तेल), के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर नियंत्रित का उपयोग करें। 0.5-0.8 सुक्ष्ममापी अंतराल (चित्रा 5) पर पर्याप्त जेड वर्गों लो।
  9. में सिलिअरी स्थानीयकरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिएपक्षपाती कोशिकाओं, DAPI चैनल में देख कर संगामी कोशिकाओं के साथ 3-8 लगातार क्षेत्रों से छवियों के ढेर के अधिग्रहण। प्राथमिक सिलिया ImageJ / फिजी का उपयोग कर की संख्या यों। आमतौर पर, ImageJ प्लगइन्स में "सेल काउंटर" उपकरण का उपयोग> GPCR पॉजिटिव सिलिया से कोशिकाओं की गिनती करने के लिए संवाद बॉक्स का विश्लेषण करें; छवियों के ढेर से अधिक से अधिक अनुमानों भी गिनती और निर्यात उद्देश्यों के लिए ही प्रयोग से सभी छवियों के लिए ImageJ / Fiji.Use समान छवि तीव्रता और विपरीत मानकों से निर्यात किया जा सकता है।

6. Neurospheres के अभिकर्मक

  1. का पालन 24 घंटे के लिए coverslips कोशिकाओं अलग हो गई। एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक भी अच्छी तरह से में 500 एनएससी की μL माध्यम में एक सेल घनत्व का प्रयोग आम तौर पर 75,000 के बीच और 150,000 कोशिकाओं।
  2. 5 एस के लिए vortexing द्वारा एक 0.5 एमएल microtube में अभिकर्मक अभिकर्मक के 1.5 μL कम सीरम माध्यम के 25 μL और मिक्स।
  3. अन्तर्जीवविष मुक्त प्लाज्मिड डीएनए के 2.5 माइक्रोग्राम प्रति एक अलग 0.5 एमएल microtub में जोड़ेई कम सीरम मीडिया के 25 μL युक्त और 5 एस के लिए vortexing द्वारा मिश्रण।
  4. अभिकर्मक अभिकर्मक के 1 μL दूसरा microtube युक्त डीएनए में जोड़े और 5 एस के लिए vortexing द्वारा मिश्रण।
  5. पहले microtube के लिए डीएनए युक्त ट्यूब से मिश्रण जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण।
  6. आरटी पर 10-15 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, धीरे एनएससी मध्यम के शीर्ष (500 μL / अच्छी तरह से) पर कुओं अभिकर्मक मिश्रण dropwise जोड़ें।
  7. मध्यम 24 घंटे के बाद अभिकर्मक बदलें मध्यम (एनएससी मध्यम) या भुखमरी मध्यम (500 μL / अच्छी तरह से) को नियंत्रित करने के।
  8. 24 घंटे के बाद 4% पीएफए ​​के लिए मध्यम बदलकर कोशिकाओं को ठीक करें और immunostaining करते हैं; आम तौर पर, एक 10% अभिकर्मक दक्षता अप करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त की है।

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Representative Results

एक सप्ताह के लिए एनएससी मध्यम में SVZ से कोशिकाओं चढ़ाना के बाद, चल neurospheres (चित्रा 2A) देखे गए हैं। क्षेत्रों के आकार 50 और 200 सुक्ष्ममापी के बीच अलग-अलग। में लिपटे Laminin एनएससी मध्यम में coverslips 2 दिनों के लिए करता है, तो क्षेत्रों तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से प्राप्त किए गए जांच करने के लिए, neurospheres PLL- और पर प्लेटेड रहे थे। वे तो तंत्रिका स्टेम / पूर्वज सेल मार्कर, Nestin के खिलाफ immunostained गया। दो दिन क्षेत्रों coverslips के लिए संलग्न करने के लिए और कोशिकाओं की एक monolayer के रूप में विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए की जरूरत थी। कोशिकाओं के monolayer Nestin (चित्रा 2 बी) के लिए सकारात्मक था। neurospheres के भेदभाव क्षमता की जांच करने के लिए, हम उन्हें प्लेटेड निम्नलिखित PLL- और पर धारा 2 में उल्लिखित सभी चरणों पृथक्करण के बिना Laminin में लिपटे भेदभाव मध्यम में coverslips 7-10 दिनों के लिए। यह भेदभाव के लिए कम से कम एक सप्ताह लगता है। neurospheres coverslips से जुड़ी और विस्तारएड कोशिकाओं की एक monolayer के रूप में विकसित करने के लिए। हम कोशिकाओं तय की और न्यूरॉन, astrocyte, और oligodendrocyte मार्कर के खिलाफ immunostained। हम पक्षपाती neurospheres कि β ट्यूबिलिन III पॉजिटिव न्यूरॉन्स, GFAP पॉजिटिव astrocytes में विभक्त होता मनाया, और O4 पॉजिटिव oligodendrocytes (चित्रा 2C-E)। इस प्रकार, multipotent neurospheres वयस्क माउस SVZ से प्राप्त किया जा सकता है।

निर्धारित करने के लिए पक्षपाती neurospheres और विभेदित न्यूरॉन्स प्राथमिक सिलिया है, हम Arl13b (प्राथमिक पपनी मार्कर) 51 और Gpr161 (सिलिअरी स्थानीयकृत GPCR) 7 के खिलाफ immunostained। हमारे अनुभव, उपलब्ध माउस ARL13B-mCherry व्यक्त मॉडल में, और विकासशील माउस प्रांतस्था के साथ पढ़ाई में में, सबसे (यदि सभी नहीं) मस्तिष्क में neuronal सिलिया, Arl13b व्यक्त करते हुए सभी न्यूरॉन्स ACIII पॉजिटिव नहीं कर रहे हैं 52, 53, 54। गुरुरों, हम मुख्य रूप न्यूरोनल सिलिया पता लगाने के लिए Arl13b पर भरोसा करते हैं। हम प्राथमिक सिलिया और पालन neurospheres (चित्रा 3 ए) में पूर्वज कोशिकाओं की सिलिया के लिए और विभेदित न्यूरॉन्स (चित्रा 3 बी) में Gpr161 के स्थानीयकरण का पता चला। इस प्रकार, पक्षपाती neurospheres और विभेदित प्रजातियों संस्कृति में रोमक और संकेत अणुओं स्थानीय बनाना कर रहे हैं।

अगर चल neurospheres प्राथमिक सिलिया है निर्धारित करने के लिए, हम चल neurospheres निर्धारण के बाद, के रूप में खंड 3. में उल्लिखित हम sectioned neurospheres में तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (चित्रा 4 ए-बी) में प्राथमिक सिलिया मनाया cryosectioned। यह neurospheres भर में जेड वर्गों प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से प्राथमिक सिलिया कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह एक एकल z के विमान में प्राथमिक सिलिया की जांच के लिए मुश्किल है। सारांश में, एक समान neurospheres रोमक और गैर रोमक कोशिकाओं की विषम आबादी है।

(चित्रा 5 ए-बी) में सुसंस्कृत उन की तुलना में के रूप में, Arl13b द्वारा पता लगाया। इसके अलावा, हम भुखमरी पर Gpr161 पॉजिटिव सिलिया की संख्या में वृद्धि का उल्लेख किया (% Gpr161 पॉजिटिव सिलिया / Arl13b पॉजिटिव सिलिया) (चित्रा 5 ए-बी)। दिलचस्प बात यह है undifferentiated मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइनों का उपयोग कर पिछले एक अध्ययन का प्रदर्शन किया संस्कृति में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को भी प्राथमिक सिलिया 55 अधिकारी हैं। संख्या और इन सेल लाइनों में सीरम भुखमरी पर सिलिया वृद्धि की लंबाई, और इन सिलिया भी श्श्श मशीनरी के घटकों के अधिकारी।

हम यह भी पक्षपाती तंत्रिका स्टेम / progenito ट्रांसफ़ेक्टआर कोशिकाओं, के रूप में खंड 6. में उल्लिखित हम आम तौर पर 10% तक की एक अभिकर्मक दक्षता, प्रयोगशाला (चित्रा 6) में प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए इसी तरह का पता चला।

उपाय अंग
1x पीबीएस पतला 10x पीबीएस autoclaved पानी के साथ
एनएससी मध्यम 2 एमएल 50x B27
1 एमएल 100x एन 2
1 एमएल 200 मिमी एल glutamine
1 एमएल 100x पेन / Strep
FGF-बुनियादी (मानव bFGF) (स्टॉक समाधान 25 एनजी / Neurobasal मध्यम में एमएल): 20 एनजी / एमएल या 2 मिलीग्राम 100 एमएल मीडिया के लिए कुल
EGF (स्टॉक समाधान 25 एनजी / Neurobasal मध्यम में एमएल): 20 एनजी / एमएल या 2 मिलीग्राम 100 एमएल मीडिया के लिए कुल
95 एमएल बेसल मध्यम
मानव FGF-बुनियादी (मानव bFGF) 1 एमएल वाणिज्यिक मानव bFGF 25 माइक्रोग्राम प्रति बोतल के लिए बेसल मध्यम
-20 डिग्री सेल्सियस या उससे पहले वाले में बाँझ microtubes में संग्रहित करें। एक भी 80 μL विभाज्य या 2 माइक्रोग्राम / 100 एमएल एनएससी मीडिया का प्रयोग करें।
EGF वाणिज्यिक EGF 20 माइक्रोग्राम प्रति बोतल के 8 एमएल बेसल माध्यम जोड़ें
-20 डिग्री सेल्सियस या उससे पहले के रूप में बाँझ microtubes संग्रहित करें। एक भी 80 माइक्रोग्राम प्रति विभाज्य / 100 एमएल मीडिया का प्रयोग करें।
रोक मध्यम 1 एमएल एफबीएस
75 यू DNase मैं (75 यू / पीबीएस में UL)
9 एमएल पीबीएस
सीरम मध्यम 1 एमएल एफबीएस
9 एमएल बेसल मध्यम
बर्फ़ीली मध्यम 4 मिलीलीटर DMSO
24 एमएल बेसल मध्यम
12 एमएल 30% एफबीएस
भेदभाव मध्यम 90 एमएल बेसल मध्यम
5 एमएल 5% एफबीएस
1 एमएल 100x पेन / Strep
1 एमएल 200 मिमी एल glutamine
1 एमएल 100x एन 2
2 एमएल 50x B27
FGF-बुनियादी (मानव bFGF) (25 एनजी के स्टॉक समाधान / Neurobasal मध्यम में एमएल): 10 एनजी / एमएल या 1 मिलीग्राम 100 एमएल के लिए कुल
भुखमरी मध्यम 95 एमएल बेसल मध्यम
1 एमएल 100x पेन / Strep
1 एमएल 200 मिमी एल glutamine
1 एमएल 100x एन 2
2 एमएल 50x B27

तालिका 1: समाधान की पकाने की विधि।

ve_content "के लिए: रखने together.within-पन्ने की =" 1 "> आकृति 1
चित्र 1: neurosphere संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: Neurospheres प्रदर्शनी विभेदन क्षमता। (ए) प्रतिनिधि neurospheres दिखाए जाते हैं। (बी) Neurospheres 2 दिनों के लिए एनएससी मध्यम में PLL- और laminin लेपित coverslips पर प्लेटेड कर रहे थे और (तंत्रिका स्टेम / पूर्वज सेल मार्कर) Nestin के खिलाफ immunostained गया। लेपित laminin (सीई) Neurospheres PLL- और पर धारा 2 में उल्लिखित चरणों का पालन प्लेटेड थे 7 दिन witho के लिए भेदभाव मध्यम में coverslipsकेन्द्र शासित प्रदेशों के पृथक्करण; तय; और β ट्यूबिलिन III (न्यूरोनल मार्कर), GFAP (astrocyte मार्कर), और O4 (oligodendrocyte मार्कर) के खिलाफ immunostained। नाभिक DAPI द्वारा दाग रहे थे। स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: Neurospheres और न्यूरॉन्स पक्षपाती विभेदित Neurospheres में रोमक हैं। (ए) Undissociated neurospheres 2 डी के लिए एनएससी मध्यम में लेपित coverslips पर प्लेटेड कर रहे थे; तय; और Gpr161 (हरा), Arl13b (लाल), और डीएनए (नीला) के खिलाफ immunostained। (बी) विभेदित न्यूरॉन्स Gpr161 (हरा), Arl13b (लाल, ए) या β ट्यूबिलिन III (लाल, बी), और डीएनए (नीला) के खिलाफ immunostained गया। सफेद तीर सिलिया में Gpr161 स्थानीयकरण संकेत मिलता है।(ए) में सही पैनल सफेद तीर द्वारा संकेत प्राथमिक पपनी के बढ़े हुए देखा गया है। सफेद बॉक्सिंग न्यूरॉन में Gpr161 पॉजिटिव पपनी (बी) में सही करने के लिए दिखाया गया है। स्केल = 10 सुक्ष्ममापी (ए); 50 सुक्ष्ममापी (बी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: फ्लोटिंग, समान Neurospheres रोमक कोशिकाओं के पास है। फ्लोटिंग neurospheres नियत ना अक्टूबर में एम्बेडेड, cryosectioned, और Arl13b (लाल) और डीएनए के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए कार्रवाई की। एक neurosphere में Arl13b पॉजिटिव प्राथमिक सिलिया दिखाए जाते हैं। (ए) में पैनल एक neurosphere से 0.8 सुक्ष्ममापी अंतराल पर 14 जेड वर्गों की एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण है। में पैनल (बी) सी के बढ़े हुए दृश्य दिखानेमें (ए) सफेद बॉक्सिंग क्षेत्र में iliated कोशिकाओं। सभी z-वर्गों से अधिक से अधिक प्रक्षेपण छवि, एक ढेर के रूप में दिखाया गया है, जबकि संख्या 1 से 14 व्यक्ति जेड वर्गों संकेत मिलता है। सफेद तीर प्राथमिक सिलिया संकेत मिलता है। स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: Dissociated पक्षपाती तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में भुखमरी लाती Ciliogenesis। (ए) अलग कोशिकाओं एनएससी मध्यम या 24 घंटे के लिए भुखमरी माध्यम में लेपित coverslips पर प्लेटेड कर रहे थे; तय; और Gpr161 (हरा), Arl13b (लाल), और डीएनए (नीला) के खिलाफ immunostained। Gpr161 पॉजिटिव सिलिया नियंत्रण (बाएं) और भूखे (दाएं) कोशिकाओं में मनाया जाता है। कम पैनल संबंधित में संकेत सफेद बॉक्स के बढ़े हुए विचार हैंऊपरी पैनल। सफेद तीर और तीर क्रमशः Gpr161 पॉजिटिव और -नकारात्मक सिलिया से संकेत मिलता है,। स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी। (बी) Arl13b पॉजिटिव रोमक कोशिकाओं (बाएं ग्राफ) और Gpr161 नियंत्रण और भूखे कोशिकाओं में Arl13b पॉजिटिव सिलिया (दाएं ग्राफ) में स्थानीयकृत की मात्रा। दोनों Arl13b पॉजिटिव रोमक कोशिकाओं और Gpr161 Arl13b पॉजिटिव सिलिया में स्थानीयकृत के प्रतिशत भुखमरी पर वृद्धि हुई है। मात्रा एक प्रयोग के दो तकनीकी replicates से देखने के दो क्षेत्रों से प्रत्येक से किया गया था। डेटा मानक विचलन ± दृश्य के सभी 4 क्षेत्रों से मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। *, पी <0.05; **, पी <0.01। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्र 6: में अभिकर्मकDissociated पक्षपाती तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं। लेपित coverslips पर चढ़ाया अलग कोशिकाओं एक एलएपी-TULP3 N- टर्मिनस (1-183 आ) mut12 निर्माण कि कोर IFT-एक जटिल 56 करने के लिए बाध्य नहीं है के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। मध्यम भुखमरी मध्यम 24 घंटे के बाद अभिकर्मक में बदल गया था। कोशिकाओं 24 घंटे के बाद तय किए गए थे और GFP (हरा) के खिलाफ immunostained, Gpr161 (लाल), Arl13b (मैजंटा), और डीएनए (नीला)। Gpr161- और Arl13b पॉजिटिव पपनी के साथ एक ट्रांसफ़ेक्ट सेल, एक सफेद तीर द्वारा चिह्नित जबकि सिलिया के बिना एक ट्रांसफ़ेक्ट सेल एक सफेद तीर के साथ दिखाया गया है। पीला तीर और तीर के साथ या Gpr161 / Arl13b बिना क्रमश: untransfected कोशिकाओं को इंगित। स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ, हम पैदा करते हैं और वयस्क माउस SVZ से neurosphere संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए एक विधि का वर्णन। संस्कृतियों के बारे में कुछ उचित अंक इस प्रकार हैं। 200 सुक्ष्ममापी - प्रथम, क्षेत्रों के आकार 50 के बीच आम तौर पर कर रहे हैं। हमारे अनुभव में, जब एक neurosphere व्यास में बड़ा 300 से सुक्ष्ममापी हो जाता है में, passaging के लिए इष्टतम समय याद किया गया है। ये बड़े क्षेत्रों कोर में मृत कोशिकाओं होते हैं। दूसरा, के रूप में neurospheres आमतौर पर तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, यह महत्वपूर्ण EGF और FGF-बुनियादी (bFGF) उपयोग करने के लिए इन कोशिकाओं के stemness बनाए रखना है। इसलिए, कारकों, इस तरह के एफबीएस के रूप में है कि भेदभाव प्रेरित, neurospheres के रखरखाव के दौरान बचना अनिवार्य है। यह दिखाया गया है कि 10% एफबीएस astrocytes 47 में neurospheres अंतर कर सकते हैं। तीसरा, न्यूरोनल भेदभाव की डिग्री माउस की उम्र पर निर्भर हो सकता है। एक neurospheres से अधिक न्यूरोनल भेदभाव, युवा चूहों चाहता है तो (प्रसव के बाद दाy 0) का इस्तेमाल किया जा सकता है। चौथा, अगर नई संस्कृतियों शुरू, यह हमेशा अच्छा neurospheres के भेदभाव क्षमता की जांच करने के लिए है। पांचवां, हमारे विधि भी भविष्य प्रयोगात्मक उपयोग के लिए स्थापित किया गया neurosphere संस्कृतियों से ठंड और विगलन अनुमति देता है। विगलन के बाद, कोशिकाओं आम तौर पर बिना पाली एल लाइसिन या laminin के रूप में पक्षपाती धुरी के आकार की कोशिकाओं को बढ़ने। यह कोशिकाओं को फ्रीज पिघलाव क्षति की वजह से हो सकता है। पारित होने से पहले 80% संगामी - यह कोशिकाओं से बढ़ रहा जब तक वे 60 बन बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। पारित होने के बाद, कोशिकाओं आम तौर पर neurospheres के रूप में विकसित और आम तौर पर 5 से ऊपर passaged जा सकता है - 10 बार।

Neurosphere आधारित संवर्धन तरीके हमें सिलिअरी तस्करी और तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और विभेदित न्यूरॉन्स में संकेत रास्ते अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं। हम चल / पक्षपाती और विभेदित neurospheres में प्राथमिक सिलिया की जांच की। यह neurospheres की पूर्ण सीमा तक भर सिलिया कल्पना करने के लिए कई जेड वर्गों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, पीछेएर इन neurospheres के पक्षपाती संस्कृतियों पैदा करने, और उन्हें 24 घंटे के लिए भूख से मर, कोशिकाओं के सबसे (चित्रा 5) रोमक और अनाथ GPCR, Gpr161 में समृद्ध कर रहे हैं। हालांकि, subcellular vacuolar संरचनाओं में पक्षपाती संस्कृतियों परिणामों की भुखमरी तक चलाते रहे। इस प्रकार, यह ध्यान से विशेष प्रायोगिक उद्देश्यों के लिए भुखमरी अवधि का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

वर्तमान में, ciliogenesis पर अध्ययन मुख्य रूप से कुछ रोमक में प्रदर्शन कर रहे हैं, सेल लाइनों 57 अमर। ये सेल लाइनों हमेशा ईमानदारी से इस तरह के GPCRs या श्श्श मार्ग मशीनरी के रूप में संकेत घटकों, को व्यक्त करने में न्यूरॉन्स और तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की पुनरावृत्ति नहीं है, यह जरूरी जैविक प्रक्रियाओं में सिलिया की भूमिका का अध्ययन करने के नए तरीकों को विकसित करने के लिए बना रही है। neurosphere आधारित विधियों यहाँ वर्णित हमें GPCR और तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और diff के संदर्भ में श्श्श संकेतन सहित सिलिया विनियमित सेलुलर रास्ते, अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैंerentiated न्यूरॉन्स।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm round cover glass Fisherbrand 12-545-80 
24-well plate Falcon 353047
4% paraformaldehyde (PFA) Affymetrix 19943
50 mL tube Falcon 352098
95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid Fisherbrand FB0875714G 10 cm dish
70 µm cell strainer Falcon 352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-545-152 Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66 Neuromab AB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504001 B27
Centrifuge Thermo scientific ST 40R
Cryogenic vial Corning 430488
DAPI Sigma D9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancrease Sigma D5025-15KU Dnase I
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418-100ML DMSO
Disposable Vinyl Specimen Molds Sakura Tissue-Tek Cryomold 4565 10 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma D1408-500ML DPBS
Dumont #5 Forceps Fine science tools 11254-20
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9026-500ML
Fluoromount-G solution Southern Biotech 0100-01 mounting solution
GFAP DAKO Z0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate ThermoFisher Scientific A-21127 Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate ThermoFisher Scientific A-21137 Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161 home made N/A
human bFGF Sigma F0291 FGF
hemocytometer Hausser Scientific 0.100 mm deep improved neubauer
Isothesia Henry Schein NDC 11695-0500-2 Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane Sigma L2020 Laminin
L-Glutamine (200 mM) Sigma G7513
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000
Mr. Frosty Nalgene  5100-0036
N-2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17502001 N2
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
OCT compound Sakura Tissue-Tek 4583 OCT
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P4707
Recombinant human EGF protein, CF R and D systems 236-EG-200 EGF
Scissor Fine science tools 14060-10
Superfrost plus microscope slide Fisher scientific 12-550-15 slides
Triton X-100 Bio-Rad 161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X) Sigma T4174-100 Trypsin
COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile Corning 3471 ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin III Covance MMS-435P TUJ1

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 122 प्राथमिक सिलिया न्यूरल स्टेम कोशिकाओं तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं neurospheres ध्वनि हाथी जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर Gpr161
अध्ययन के लिए प्राथमिक सिलिया प्राथमिक neurosphere संस्कृति का उपयोग करना
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Shimada, I. S., Badgandi, H.,… More

Shimada, I. S., Badgandi, H., Somatilaka, B. N., Mukhopadhyay, S. Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia. J. Vis. Exp. (122), e55315, doi:10.3791/55315 (2017).

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