Summary
Schaalbare engineered bloedvaten zou de klinische toepasbaarheid te verbeteren. Gebruik gemakkelijk aanzienlijke 3D gedrukte geleiders, ringen van vasculaire gladde spieren zijn gemaakt en gestapeld in een buisvormige vorm, die een vasculair transplantaat. Enten kan worden aangepast aan de reeks van menselijke kransslagader afmetingen voldoen door eenvoudig de 3D gedrukte handleiding te wijzigen.
Abstract
Coronaire hartziekte blijft een belangrijke oorzaak van de dood, die miljoenen Amerikanen. Met het gebrek aan autologe vasculaire transplantaten beschikbaar, ontwikkeld grafts een groot potentieel voor de behandeling van patiënten. Echter, gemanipuleerde vasculaire grafts algemeen niet gemakkelijk schaalbaar, ter vervaardiging van aangepaste mallen of polymeer buizen om te passen aan de grootte, die een tijdrovende en kostbare praktijk. Menselijke slagaders variëren in lumen diameter van ongeveer 2,0-38 mm en een wanddikte van ongeveer 0,5-2,5 mm. We hebben een methode gecreëerd, aangeduid als de "Ring stapelmethode," waarin variabele grootte ringen van weefsel van het gewenste celtype, toonde hier met vasculaire gladde spiercellen (SMC), kan worden gemaakt met geleidingen centrum posten lumendiameter beheersen en buitenste schelpen wanddikte van het drukvat te dicteren. Deze weefsels ringen worden vervolgens gestapeld tot een buisvormige construct, het nabootsen van de natuurlijke vorm van een bloedvat. De lengte vat kan be afgestemd door simpelweg het aantal ringen die nodig is om de lengte nodig vormen stapelen. Met onze techniek, kan weefsels van buisvormige membranen, vergelijkbaar met een bloedvat, gemakkelijk worden vervaardigd in verschillende afmetingen en lengtes aan de behoeften van de kliniek en patiënt voldoen.
Introduction
Bij de behandeling van coronaire hartziekte (CAD), zijn eigen bloedvaten van de patiënt geoogst als entmateriaal voor bypassoperatie. Echter, vaak, zieke patiënten hebben geen levensvatbare schepen om te doneren aan zichzelf, en wanneer ze dat doen, de donor gebied veroorzaakt aanzienlijke extra schade en heeft een ernstig risico op infectie. 1 Engineered vasculaire implantaten kunnen deze behoefte in te vullen. Schaalbaarheid van het grootste belang voor engineering vaartuigen om de uiteenlopende patiëntafmeting verblijf voldoen. Echter, huidige methoden voor engineering schepen zijn niet gemakkelijk schaalbaar en vergen doorgaans herfabricage van complexe vormen of polymeer steigers. De meeste engineered grafts ofwel gebruik van een polymeer buisvormige scaffold dat is bezaaid met vasculaire fibroblasten, gladde spiercellen of endotheelcellen; of het werpen van een cel vel rond een doorn om een tissue buis te creëren. Twee gemanipuleerde vasculaire implantaten in klinische studies gebaseerd op decellularized polymeer-ECM-platform. 2, 3, 4 Polymeer transplantaten beschikbaar voor gebruik in vasculaire reparatie reeds bekend om problemen met doorgankelijkheid, welke als een groot probleem bij langdurig gebruik van een implantaat met een voortdurende aanwezigheid polymeer kunnen aandienen. Buisvormige mallen werden gebruikt om volledig cellulaire schepen, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 welke procedures zouden extra ontwerp en vervaardiging van werktuigen voor aangepaste matrijzen nodig hebben om schepen te produceren in een verscheidenheid van grootte fabriceren .
De hierin beschreven werkwijze omvat een nieuwe techniek voor het maken eenvoudig schaalbaar ontworpen vasculaireenten met behulp van aanpasbare 3D geprint inserts en traditionele cultuur platen. 14 Cellen worden gezaaid in platen met inzetstukken van een centrale post en buitenste schil. De controles achteraf lumen diameter en laat de cel monolaag om zelf te assembleren in een ring van weefsel. De behuizing controles dikte van de ring, en dus wanddikte van de uiteindelijke vat. Afgesloten weefsel ringen worden vervolgens gestapeld tot een buisvormige vasculaire graft vormen. Het voordeel van deze methode, de zogenaamde "Ring stapelmethode," dat aanhechtend celtype kan worden gezaaid in de plaat opstart en weefsel ringen of buizen van elke omvang die voor de gewenste toepassing kan worden gegenereerd door eenvoudig modificeren gids inserts. Vergelijkende technieken weefselengineering creëren ringen weefsel blijft moeilijk schaal 15, 16 ter verwerk van mallen voor elke gewenste afmeting. Bovendien, vasculaire transplantaten gemaakt met deze methode kan producerend in 2-3 weken, verscheidene weken sneller dan bij andere hoogwaardige schepen. 6 Voor de kliniek, kan deze tijd discrepantie een significant verschil in de behandeling van een verslechterende patiënt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cel Cultuur Voorbereiding
- Maak gebruik van menselijke aorta gladde spiercellen in de handel gekocht.
- Handhaven cellen in gladde spier celgroei media bestaande uit 88,6% 231 media, 0,1% elk van recombinant humaan insuline (rv-insuline), recombinant humaan fibroblast growth factor (rv-FGF), recombinante humane epidermale groeifactor (rv-FGF), en ascorbinezuur; en 5% elk van foetaal runderserum (FBS) en L-glutamine; en 1% antibioticum / antimycoticum.
OPMERKING: Elke groeifactor, FBS en L-glutamine worden gekocht als een vasculaire media groei kit. - Change media om de 48 uur tot de cellen zijn ongeveer 90% confluent en klaar voor weefsel zaaien.
- Store cellen in een incubator in tussen media veranderingen voor uitbreiding.
2. Voorbereiding van de 3D Gedrukte Inserts en Custom Siliconen Gegoten Plates
- Gebruik een commerciële 3D-printer (bijvoorbeeld Replicator Mini) voor 3D-printen van de plaat inserts.
- gebruik opnl source 3D-ontwerpsoftware, zoals Blender om de 3D-modellen van de gedrukte buitenste schelpen en posten.
- Exporteer het model driver-bestand via een .stl formaat waardoor draagbaarheid om de software van de 3D-printer.
- Produceren gedrukte posten en buitenmantels gebruikt poly (melkzuur) filament (PLA) geladen in de 3D printer.
- Na het afdrukken, het uitvoeren van een 30-minuten weken in een 70% -100% ethanol oplossing voor elke insert steriliseren.
- Bereid een 1:10 hardingsmiddel polymeermengsel poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) siliconenpolymeer baseren en laat het mengsel ontgast bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Definieer petrischaal afmetingen als klein (35 mm), tussenproduct (60 mm) en grote (100 mm).
- Voeg 2 ml, 4 ml en 6 ml uitgeharde siliconen om elke kleine, gemiddelde en grote plaat, respectievelijk, en een dunne laag over de gehele bodem van de petrischaal.
- Maak berichten voor de kleine bord door het gieten van PDMS in een100 mm plaat tot een hoogte van 7 mm en laten uitharden op een hete plaat bij 60 ° C gedurende 2-3 uur. Maak dan gebruik van een 5 mm biopsie punch punch uit cilindrische berichten. Gebruik een kleine hoeveelheid onverhard PDMS beveiligen PDMS elke cilinder en het midden van elk plaatje.
- Voor de gemiddelde en grote platen vóór uitharden van de PDMS invullen op de bodem van het schaaltje, zet de 3D afgedrukte berichten 10 mm en 20 mm centraal in elk tussenliggende en grote platen, respectievelijk. Voor de grote platen, bovendien plaats een 3D geprint buitenste schil ongeveer 66,7 mm in diameter gelijke afstand van de post.
- Laat elk gerecht uitharden in de open lucht op een hete plaat bij 60 ° C gedurende ongeveer 2-3 uur, zodat 18 uren voor het ontgassen van het polymeer. Fix gedrukte elementen aan de plaat in de juiste regio en oriëntatie zoals getoond in figuur 1.
- Voeg een oplossing van 70% ethanol met 30% gedestilleerd water gedurende 30 minuten om de binnenkant van plates voor sterilisatie en vervolgens dekking elke plaat.
- Zorgvuldig aspireren de ethanol uit elke plaat en laat aan de lucht drogen.
- Schik elke plaat in een biologisch veiligheidskabinet (BSC) naast zijn deksel, face-up. Expose borden en deksels UV licht onder het BSC 30 minuten sterilisatie voltooien. Steriele techniek wordt uitgevoerd bij elke stap na blootstelling aan UV.
3. Bereiding van Hydrogel fibrine, enten met gladde spiercel en onderhoud van platen
- Meng een oplossing van fibrine gel met groeimedia + 0,01% TGF-β1 in de hoeveelheden van 0,5 ml, 1,1 ml en 1,81 ml voor kleine, midden en grote plaat maten, respectievelijk.
- Voeg 40 pl, 88,4 uL en 145 uL van trombine uit een voorraad van 100 U / ml aan de media van elke kleine, gemiddelde en grote plaat, respectievelijk. Zwenk elke plaat met de hand om ervoor te zorgen dat trombine wordt gelijkmatig gemengd in de media.
- Voeg vervolgens 1601, L, 354 pl en 580 pl fibrinogeen, uit een voorraad van 20 mg / ml, druppelsgewijs circulair de trombine-media mengsel aan elke kleine, gemiddelde en grote plaat, respectievelijk. Zwenk de hand te waarborgen mengen en verdeling van de hydrogel in een gelijkmatige laag.
- Sta hydrogel uitharden gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur.
- Trypsinize gladde spiercellen Geëxpandeerd 150 mm celkweekplaten en centrifuge volgens standaardprotocollen. De resulterende pellet worden geresuspendeerd in 3 ml differentiatie media bestaande uit 98% - 231 media, 1% FBS en 1% antibioticum / antimycoticum.
- Krachtig mengen cellen door titratie op en neer met een 2 mL pipet te breken een cel klonten. Aantal cellen met een hemocytometer en een celsuspensie van 2 x 10 6 cellen / ml, 1,0 x 10 7 cellen / ml en 1,4 x 10 7 cellen / ml voor kleine, gemiddelde en grote platen respectievelijk.
- Voeg 1 ml elke celsuspensie into een overeenkomstige 50 ml conische gelabeld klein, midden en groot. Zo'n additioneel 50 ml conische deze wijze per extra weefselring gewenst.
- Voeg differentiatie media aan elke conische definitieve zaaien volumes van 2 ml, 4 ml en 5 ml voor elke kleine, gemiddelde en grote vaten te verkrijgen, respectievelijk. Vervolgens voorzichtig pipet de cel oplossing druppelsgewijs bovenop de bereide hydrogel in elke corresponderende plaat.
- Plaats platen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Change differentiatie media elke 48-72 uur voor elke plaat. In het geval van de grotere plaat, veranderingsmedia aanvankelijk na 24 uur, dan veranderen om 48-24 uur te compenseren grootcellig zaaidichtheid.
- Na 2-4 dagen als de ringen volledig in zal hebben opgelopen in de richting van de post, voeg 10 pi, 20 pi en 35 pi van TGF-β1 aan elk klein, midden en grote ring, respectievelijk. Na blootstelling aan TGF-β, 1 ten minste 24 uur, ringen gereed zijn behandeld.
4. Montage van Vascular Construct en onderhoud
- Voor de vervaardiging van de uiteindelijke vasculair construct, wordt een speciale houder gemaakt om het voltooide vat te houden.
- Voor de kleine vaartuig, zorgen voor een hoge kentekenplaat voor ring stapelen door het snijden van een 2-inch doorsnede uit de top van een 50 ml polycarbonaat conische buis, en vervolgens PDMS lijm de snijrand in een 35 mm plaat. Gebruik de conische deksel als de plaat deksel.
- Voor de tussenliggende en grote schip hoge ring stapelen platen, snijd een 1,75-inch diameter polycarbonaat buis in 2,5 inch secties in de lengte om te dienen als de grote plaat muren. Voor de lange plaat bodems, snijd een 0.125-inch dikke polycarbonaat in 2-inch cirkel met een diameter stukken. Met behulp van acryl lijm, binden de polycarbonaat buis sectie om de cirkelvormige gesneden stuk. Gebruik het deksel van een 60 mm petrischaal als het deksel voor de lange plaat.
- 3D print posten 5, 10 en 20 mm in diameter en 50 mm lang.
- Voeg 10 ml niet uitgeharde siliconen elke container. Voorafgaand aan de volledige uitharding van het PDMS, centraal plaatst elk bericht gemaakt in stap 4.1.3 in elke kleine, tussentijdse, en grote container.
- Laten uitharden op een hete plaat ingesteld op 60 ° C gedurende 2-3 uur.
- Steriliseren met een oplossing van 70% ethanol met 30% gedestilleerd water gedurende 30 minuten.
- Zorgvuldig aspireren de ethanol uit elke container en laat aan de lucht drogen in de BSC. Vervolgens regelen van de containers in de kap met elke plaat geplaatst naast het deksel, face-up. Blootstellen aan UV-licht onder de BSC gedurende nog 30 minuten verder sterilisatie. Gebruik steriele techniek bij elke stap na blootstelling aan UV.
- Met behulp van zeer fijne tang, verwijder voorzichtig elke strak opgerold gladde spieren hydrogel ring uit zijn post en over te dragen aan de bijbehorende grotere container met de hoge posten.
- Gebruik een paarpincet in elke hand en hef één zijde van de ring van de paal, en dan de andere. Wees voorzichtig te beschermen en het lumen te handhaven.
- Voer de overdracht met deze twee handen werkwijze schuiven eerste zijde, dan de andere zijde van de ring op de hoge paal. Met behulp van zachte, geleidelijke bewegingen, en de omtrek werken, duw langzaam de ring naar beneden op de hoge paal. Vervolgens stapelen ringen weefsel tot de gewenste lengte vaartuig is verkregen, waarbij elke ring toevoeging van ongeveer 1-2 mm lengte aan de voltooide construct.
- Met de ring stapel gepositioneerd op de lange 3D gedrukte berichten, zet de plaat, zodat de post parallel aan het werkoppervlak is.
- Met behulp van een micropipet, voeg 40, 80 en 160 ui thrombine met een concentratie van 100 U / mL voorzichtig aan het buitenoppervlak van elke kleine, gemiddelde en grote vaten, respectievelijk. Terwijl het toevoegen van de trombine, langzaam draai de plaat om de dekking van alle oppervlakken van het construct te verzekeren zelfs.Dit zal de basis voor de fibrinelijm gebruikt om de ring stapel construct veilig in de eerste dagen na constructie.
- Voeg vervolgens 40, 80 en 160 pi van fibrinogeen in een concentratie van 20 mg / ml tot elke kleine, intermediaire en grote construct, respectievelijk, met behulp van een micropipet terwijl sneldraaiende het construct. De trombine en fibrinogeen snel set in een stevige gel eenmaal gemengd. Door de korte uithardingstijd, toepassen fibrinogeen zo snel en gelijkmatig mogelijk.
- Voeg 20 ml differentiatie medium elke container die het construct. Plaats kolven op een 37 ° C incubator tot gebruik. Wijzig de media elke 3-5 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Is hier zichtbaar vervaardiging van 3 verschillendenanomaterialen vasculaire graft maten (figuur 1), waaruit blijkt dat de ringstapeling Method (RSM) is schaalbaar. Om toepasbaarheid te bewijzen, de 3 verschillende grootte van de vaartuigen gekozen correlaat op ware grootte menselijke vaartuig voor de linker anterieure dalende slagader (small; lumen diameter = 4 mm) 17, dalende aorta (tussenproduct; lumen diameter = 10 mm) en de stijgende aorta (grote; lumen diameter = 20 mm) 18. Wanddikte ongeveer 500 urn voor de kleine ringen, en ongeveer 1500 urn voor zowel de gemiddelde en grote ringen. Elk vaartuig aangetoond wordt gebouwd door stapelen ringen 6, hetgeen neerkomt op een lengte van ongeveer 6 mm voor kleine vaten en 9 mm voor de gemiddelde en grote vaten. Lengte is gebaseerd op de wanddikte van elke individuele ring.
Histologische analyse toondehoge cellulariteit in alle maten ringen (figuur 2). Red materiaal bakent fibrine gel. In kleine ringen, wordt een kleine hoeveelheid resterend fibrine gel gezien op de buitenrand van de ring. In de grotere ringen is enige fibrine gel afgewisseld met de cellulaire inhoud. In de Masson's Trichrome kleuring, kan indicaties collageenproductie (gemarkeerd met blauw) zichtbaar in de tussenliggende en grote ringen.
Naar cel fenotype bepalen na ringvorming, werden weefsel ringen geanalyseerd middels immunofluorescentie antilichamen tegen a-gladde spier actine (SMA) en tropomyosine (figuur 3). Alle ringmaten waren positief voor beide antilichamen, te hebben vastgesteld dat de gladde spieren fenotype werd gehandhaafd.
Trekproef werd uitgevoerd op de verschillende grootte ringen om hun mechanische eigenschappen (figuur 4) te bepalen. De U-stretch, een meccal testapparaat, werd gebruikt voor het testen van kleine en tussenringen en vaten trek-, terwijl een Instron werd gebruikt trekproef grote ringen en vaten. Elastische modulus (E), treksterkte (UTS) en falen sterkte (FS) gegevens werden verzameld. Een consistente trend werd waargenomen met het verbeteren van kracht correleren aan het vergroten van de ring en de omvang van het schip.
Cel zaaien getal nodig voor het creëren van verschillende maten cockring verhoogd ongeveer lineair met zaaien oppervlak (Figuur 5). Om grotere ringen maken, werden ten minste 14 miljoen cellen nodig abdominale aorta sized ringen maken.
Zesring stacks of vaartuigen, werden getest op hun vermogen om stroom te weerstaan. Constructen werden in een op maat gemaakte perfusie systeem (figuur 6) en onderworpen aan stroom tot 5 min bij stroomsnelheden 100-417 ml / min. schepen warenkan stromen weerstaan. Kleine lekken werd waargenomen bij de uiteinden vat, in de connectoren op de perfusie systeem.
Figuur 1: De bouw van de geschaalde gemanipuleerde schepen. A) Schematische weergave van het proces van schaalvergroting ontworpen schepen, beginnend met plaat voorbereiding, zaaien van cellen en verblijf gebouw. Demonstreerde zijn drie verschillende maten B) ringen en C) schepen. D) Vertegenwoordiger groot schip is volledig biologisch en lijkt op natuurlijk weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Histologische analyse. rong> H & E en Masson's Trichrome vlekken vertonen levensvatbaar cellulariteit de hele ring dikte voor alle ring maten. Trichrome vlekken onthullen gebieden van de productie van collageen wordt aangegeven door blauw (blauwe pijlen). Grote ringen toonde fibrinegel afgewisseld, waarschijnlijk door het vouwen van het relatief grote oppervlak van de cellaag. Schaal bars: kleine ringen = 200 micrometer; tussenringen = 200 micrometer; en grote ringen = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunofluorescentie analyse van gladde spieren markers. Alle ringmaten waren positief voor gladde spier contractiele eiwitten α-gladde spier actine (SMA) en tropomyosine (Tm). Schaalbalken = 200 urn.load / 55322 / 55322fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Tensile test analyse. Spanning-rek curves voor alle maten ringen en vaten toonde een algemene trend van een toename van de sterkte gerelateerd is aan een toename in grootte ring / verblijf. Ringen en schepen werden de omtrek uitgerekt. Parameters beoordeeld vanuit de grafieken waren elasticiteitsmodulus, treksterkte en falen sterkte (in tabel 1 vermeld). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Cel zaaien aantal correlatie met zaaien surface gebied. Gebaseerd op menselijke aorta gladde spiercellen. Het oppervlak wordt gedefinieerd als het gebied in de ringvorming platen tussen de middenstijl en de plaat of wand buitenschaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Zes-ring schip onderworpen aan perfusie analyse. A) Op maat gemaakte perfusie-systeem voor flow testen. B) Engineered schip geladen in de perfusie-systeem. Drie vaten werden perfusie beproefd op lekken tot 5 minuten onder stroomomstandigheden. De schepen bleven stabiel onder stroom, met kleine lekken aan het schip eind-connectors aangesloten op het systeem slang. Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.
Animated Figuur 1: Demonstratie van perfusie stroom door een aangelegde schip. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
| Klein | tussen- | Groot | |||||
| ringen | Elastic Modulus (kPa) | 13,6 ± 2,25 | (N = 6) | 14,5 ± 1,2 | (N = 3) | 17.2 ± 2.2 | (N = 4) |
| Ultimate treksterkte (kVader) | 34,5 ± 10,2 | 39,6 ± 2,98 | 50,9 ± 10,6 | ||||
| Failure Strength (kPa) | 34,5 ± 10,2 | 39,6 ± 2,98 | 50,9 ± 10,6 | ||||
| schepen | Elastic Modulus (kPa) | 49,7 ± 2,80 | (N = 3) | 59,8 ± 3,90 | (N = 2) | 79,8 ± 10,1 | (N = 2) |
| Ultimate treksterkte (kPa) | 115 ± 6.90 | 137 ± 12,0 | 192 ± 86,9 | ||||
| Failure Strength (kPa) | 96,2 ± 12,2 | 60,7 ± 12,1 | 173 ± 92,2 | ||||
Tabel 1: De trekeigenschappen van de geschaalde ringen en vaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Ring Stacking Method biedt meerdere voordelen ten opzichte van de huidige vasculaire tissue engineered construct technieken. De RSM kan worden aangepast aan menselijke voertuigen van elke grootte door simpelweg aanpassen van de post en buitenschaal afmetingen. Onze methode maakt ontwikkeling van polymeervrije ontworpen vaartuigen uitsluitend uit menselijke cellen en snel afbreekbare dragermateriaal in het lichaam de natuurlijke wondgenezingsproces. Polymer grafts is bekend dat restenose veroorzaken in de kliniek en problematisch worden als in engineered grafts. Cel zaaien nummer moet worden aangepast voor elke verschillende grootte weefsel ring. Een grafiek van het aantal cellen aan het zaaien oppervlak is getoond in figuur 5, waaruit het zaaien nummer kan worden benaderd en / of geëxtrapoleerd. Opgemerkt wordt dat de hier gebruikte celtype humane aortische gladde spiercellen. Om de RSM tot verschillende celtypen aan te passen, celgrootte en proliferatie tarief moet in worden genomenbehandeling en optimale zaaidichtheid bepaald. Zo hebben wij daarnaast de menselijke fibroblast ringen met de RSM en hebben gevonden dat tenminste 2x het aantal cellen nodig vergeleken met SMC. Elke gewenste lengte van het vaartuig kan worden opgebouwd door de toevoeging van ringen. Ring stapels werden gekweekt gedurende maximaal 2 maanden stabiel bleef. Intermediaire en grote ringen zijn zowel die op het passende 1500 pm wanddikte hoewel ze elk zijn uitgevoerd in een 60 mm en 100 mm plaat, respectievelijk, door het plaatsen van een buitenmantel in de 100 mm plaat. Dit toont de bruikbaarheid van de buitenmantel voor het besturen en het verkrijgen van de juiste wanddikte van een bepaald vaartuig. In stap 3.3.1, is TGF-β1 toegevoegd omdat het bekend is collageenproductie stimuleren en 19 heeft het waargenomen effect van aanscherping van de ringen. Zodra de ringen volledig zijn uitgerold, wordt een dosis van TGF-β1 toegevoegd in de laatste stap, en de ringen zijn klaar voor gebruik 1 dag later. TGF-β1 doet verbeteren collageenproductie in de ringen, zoals gezien in de Trichrome beelden (figuur 2).
Cellen in de kleine ringen zijn rond en compact, terwijl in de grotere maten 2, cellen langs de buitenranden een mate van aanpassing weer met het weefsel rand en samen met andere cellen uitgelijnd. De laatste kan een later stadium van rijpheid cel, voortgekomen uit hogere celinhoud in de grotere ringen geven, en dus een grotere intercellulaire signalering naar volwassenheid bevorderen. Fibrine gel interspersion in grotere ringen kan erop wijzen dat grotere cel platen hebben de neiging om iets te vouwen als ze rollen. De histologische beelden die dit verschijnsel werden 1 dag na volledige ring roll up- dus is het begrijpelijk dat de fibrine gel, die 2 weken duurt afgebroken in cultuur, nog steeds aanwezig zijn. Kweken van de ringen ten minste 2 weken dient de fibrine gel afbreken, en laat een volledig cellulaire construct.
nt "> alfa-gladde spier actine (SMA) vormt de dunne filamenten die vergemakkelijkt samentrekking en tropomyosine een contractiele eiwitten. 20, 21 Zowel SMA en tropomyosine aanwezig in alle maten ringen waren met de sterkste en meest gelijkmatige signaal in de tussenliggende ringen. Dit verschijnsel kan het gevolg zijn van een hogere celdichtheid en organisatie, het stimuleren van een verhoging van contractiele operandi ontwikkeling.Elasticiteitsmodulus duidt de elasticiteit van de ringen, en de toenemende E van kleine tot grote ringen suggereert een toename van collageen en elastine. Ultimate treksterkte is de hoogste kracht doorstaan door de ringen zonder te breken. Mislukking kracht is het punt van het weefsel mislukking. Voor de ringen, UTS gelijk FS. Voor vaartuigen, UTS groter dan FS, waaruit blijkt dat de uiteindelijke sterkte van het drukvat wordt toegeschreven aan de combinatie van mechanische bijdrage van alle ringenin het vat en het faalpunt komt door de zwakste ring.
De kracht van ons gemanipuleerde schepen lag in de kPa range, terwijl natieve humane schepen krachten binnen het bereik MPa. Om onze schepen naar die van natief vaartuigen worden, onderzoeken we technieken om extracellulaire matrix productie, namelijk die van collageen en elastine verhogen. Groeifactoren die collageen en elastine bevorderen worden momenteel toegepast op onze ringen te onderzoeken of trekeigenschappen toenemen.
Naast mechanische eigenschappen, functionele maatregelen van spiercontracties prestaties verblijf relevant. Spierstimulatie en contractie door factoren zoals acetylcholine en epinefrine kan worden gebruikt om spier contractiekracht testen. Dergelijke experimenten worden overwogen voor onze toekomstige studies.
Overall, onze resultaten tonen aan dat de ring stapelmethode gemakkelijk kan worden geschaaldeen reeks gemanipuleerde vaatweefsel afmetingen bereiken. Schalen de grootste menselijke vaten, zoals de 40 mm lumenmiddellijn aorta, waarschijnlijk vereisen de ontwikkeling van een vasa vasorum de microvasculatuur van nature aanwezig in grote afmetingen schepen die ons lab nog ontwikkelt. Bovendien, de endotheliale cellaag (dwz de intima) die typisch lijnen het lumen van de media layer is belangrijk voor de juiste instelling van hemodynamica in een vat. Ons laboratorium werkt momenteel aan de schepping van de intima in onze SMC ring stapel met behulp van menselijke vasculaire endotheliale cellen. Met deze gecombineerde technologieën, zou ontworpen vaartuigen grotere toepasbaarheid voor de kliniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag onze collega Lam lab collega Ammar Chisti en Bijal Patel bedanken voor hun vriendelijke hulp met een aantal van de histologie en celkweek. De financiering werd verstrekt door de Wayne State University Nanogeneeskunde Fellowship (CBP), Start-Up Fondsen en Cardiovascular Research Institute Seed Grant (MTL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Aortic Smooth Muscle Cells | ATCC | PCS-100-012 | vascular smooth muscle cells |
| Medium 231 | Gibco (Life Technologies | M-231-500 | media specific to vascular smooth muscle cells |
| Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PSC-100-042 | growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability |
| Replicator Mini 3D printer | MakerBot | N/A | 3D printer |
| Poly(lactic acid) 3D ink (PLA) | MakerBot | N/A | 3D printer filament |
| Poly(dimethlysiloxane) (PDMS) | Ellworth Adhesives | 3097358-1004 | polymer for gluing plate parts |
| Fibrinogen | Hyclone Labratories, Inc. | SH30256.01 | fibrin gel component |
| Thrombin | Sigma Life Sciences | F3879-5G | fibrin gel component |
| Tranforming Growth Factor-Beta 1 | PeproTech | 100-21 | growth factor for stimulating collagen production |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | for cell counting |
| Polycarbonate tubing | US Plastics | PCTUB1.750X1.625 | material for making tall, ring stacking plates |
| Polycarbonate sheet | Home Depot | 409497 | material for making tall, ring stacking plates |
| Adhesive polymer solvent | SCIGRIP | 10799 | material for making tall, ring stacking plates |
| Instron 5940 | Instron | N/A | tensile testing machine |
| U-Stretch | Cell Scale | N/A | tensile testing machine |
| Smooth Muscle Actin | MA5-11547 | Thermo Fisher | antibody |
| Tropomyosin | MA5-11783 | Thermo Fisher | antibody |
References
- Luciani, G. B., et al. Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease. ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).
- Lawson, J. H., et al. Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials. Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).
- McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).
- Wystrychowski, W., et al. First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access. J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).
- Konig, G., et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).
- Gui, L., et al. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).
- Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells. Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).
- Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. Allogeneic human tissue-engineered blood vessel. J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).
- Dahl, S. L., et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci Transl Med. 2 (68), (2011).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Meier, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery. J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).
- Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts. Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).
- Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).
- Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
- Fearon, W. F., et al. Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation. Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).
- Erbel, R., Eggebrecht, H. Aortic dimensions and the risk of dissection. Heart. 92 (1), 137-142 (2006).
- Ha, D. M., et al. Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease. J Transl Med. 14, 39 (2016).
- Skalli, O., et al. Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes. J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).
- von der Ecken, J., et al. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
