Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

इंजीनियर संवहनी grafts के स्केलिंग 3 डी मुद्रित गाइड और अंगूठी Stacking विधि का प्रयोग

Published: March 27, 2017 doi: 10.3791/55322
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Wayne State University, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University

Summary

स्केलेबल इंजीनियर रक्त वाहिकाओं नैदानिक ​​प्रयोज्यता में सुधार होगा। आसानी से बड़े आकार का 3 डी-मुद्रित गाइड का उपयोग करना, संवहनी चिकनी पेशी के छल्ले बनाया है और एक ट्यूबलर रूप में खड़ी है, एक नाड़ी भ्रष्टाचार गठन किया गया। ग्राफ्ट बस 3 डी-मुद्रित गाइड आकार बदलने के द्वारा मानव कोरोनरी धमनी आयामों की श्रृंखला को पूरा करने के लिए आकार जा सकता है।

Abstract

कोरोनरी धमनी की बीमारी से मौत का एक प्रमुख कारण बनी हुई है, अमेरिकियों के लाखों लोगों को प्रभावित। ऑटोलॉगस संवहनी उपलब्ध ग्राफ्ट की कमी के साथ, इंजीनियर ग्राफ्ट रोगी उपचार के लिए महान क्षमता प्रदान करते हैं। हालांकि, इंजीनियर संवहनी ग्राफ्ट आम तौर पर आसानी से नहीं स्केलेबल, विभिन्न आकार के लिए अनुकूलित करने के क्रम में कस्टम molds या बहुलक ट्यूबों के निर्माण की आवश्यकता होती है, एक समय लेने वाली और महंगा अभ्यास का गठन। मानव धमनियों 2.0-38 मिमी के बारे में और 0.5-2.5 मिमी के बारे में से दीवार मोटाई में लुमेन व्यास में लेकर। , "रिंग Stacking विधि," जो में वांछित सेल प्रकार के ऊतक के चर आकार के छल्ले, संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ यहाँ का प्रदर्शन (एसएमसी) करार दिया हम एक तरीका बनाया है, लुमेन व्यास नियंत्रित करने के लिए केंद्र पदों की गाइड का उपयोग कर बनाया जा सकता है और बाहरी गोले पोत दीवार मोटाई हुक्म चलाना। ये ऊतक के छल्ले तो एक ट्यूबलर निर्माण बनाने के लिए, एक रक्त वाहिका की प्राकृतिक रूप नकल उतार खड़ी दिखती हैं। पोत की लंबाई कर सकते हैं खई बस लंबाई जरूरत का गठन करने के लिए आवश्यक छल्ले की संख्या stacking द्वारा रुझान। हमारी तकनीक के साथ, ट्यूबलर रूपों, एक रक्त वाहिका के समान है, के ऊतकों आसानी आयाम और लंबाई की एक किस्म में निर्मित किया जा सकता क्लिनिक और रोगी की जरूरतों को पूरा करने के लिए।

Introduction

कोरोनरी धमनी रोग (सीएडी) के उपचार में, एक मरीज की अपनी ही रक्त वाहिकाओं बाईपास सर्जरी के लिए भ्रष्टाचार सामग्री के रूप में काटा जाता है। हालांकि, बार बार, बीमार रोगियों को खुद के लिए दान करने के लिए व्यवहार्य जहाजों की जरूरत नहीं है, और मामलों में जहां वे कर में, दाता साइट काफी अतिरिक्त नुकसान का कारण बनता है और संक्रमण के लिए एक गंभीर खतरा है। 1 इंजीनियर संवहनी ग्राफ्ट इस जरूरत को भर सकता है। अनुमापकता आदेश रोगी पोत आकार की आवश्यकताओं की विस्तृत श्रृंखला को पूरा करने के लिए इंजीनियरिंग जहाजों के लिए अत्यंत महत्व का है। हालांकि, इंजीनियरिंग जहाजों के लिए वर्तमान तरीकों आसानी से स्केलेबल नहीं हैं, और आम तौर पर जटिल molds या बहुलक scaffolds के remanufacture की आवश्यकता होती है। ज्यादातर इंजीनियर ग्राफ्ट या तो एक बहुलक ट्यूबलर पाड़ कि नाड़ी fibroblasts, चिकनी मांसपेशियों, या endothelial कोशिकाओं के साथ वरीयता दी गई है का उपयोग; या एक खराद का धुरा के चारों ओर एक सेल चादर रोलिंग एक ऊतक ट्यूब बनाने के लिए। क्लिनिकल परीक्षण में दो इंजीनियर संवहनी ग्राफ्ट एक decellularize के आधार पर कर रहे हैंडी बहुलक-ईसीएम मंच। 2, 3, 4 पॉलिमर संवहनी मरम्मत में उपयोग के लिए उपलब्ध ग्राफ्ट पहले से ही प्रत्यक्षता के साथ मुद्दों है, जो एक निरंतर बहुलक उपस्थिति के साथ एक भ्रष्टाचार की लंबी अवधि के आवेदन के साथ एक प्रमुख मुद्दे के रूप में पैदा हो सकता है करने के लिए जाना जाता है। ट्यूबलर नए नए साँचे पूरी तरह से सेलुलर जहाजों, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, जो प्रक्रियाओं क्रम में कस्टम molds के लिए अतिरिक्त डिजाइन और उपकरण विनिर्माण की आवश्यकता आकार के एक किस्म में जहाजों का उत्पादन होगा निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

विधि यहाँ बताया आसानी से स्केलेबल इंजीनियर संवहनी बनाने के लिए एक उपन्यास तकनीक शामिलअनुकूलन 3 डी मुद्रित सम्मिलित करता है और पारंपरिक संस्कृति प्लेट का उपयोग grafts। 14 प्रकोष्ठों एक केंद्रीय पोस्ट और बाहरी कवच के आवेषण के साथ प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। पोस्ट नियंत्रण व्यास लुमेन और करने के लिए सेल monolayer ऊतक के एक अंगूठी में स्वयं को इकट्ठा अनुमति देता है। अंगूठी के बाहरी कवच ​​नियंत्रण मोटाई, और इस तरह अंतिम पोत की दीवार मोटाई। पूरे ऊतक के छल्ले तो एक ट्यूबलर, नाड़ी भ्रष्टाचार के लिए फार्म खड़ी दिखती हैं। लाभ इस विधि के लिए, "रिंग Stacking विधि," करार दिया है कि किसी भी पक्षपाती सेल प्रकार बस को संशोधित गाइड सम्मिलित द्वारा उत्पन्न किया जा सकता प्लेट सेटअप और ऊतक के छल्ले या वांछित आवेदन के लिए आवश्यक किसी भी आकार की ट्यूब में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। ऊतक के ऊतक इंजीनियरिंग बनाने के छल्ले में तुलनात्मक तकनीक पैमाने पर, 15, 16 के लिए मुश्किल बने हुए प्रत्येक इच्छित आकार के लिए नए नए साँचे के remanufacture की जरूरत पड़ेगी। इसके अतिरिक्त, नाड़ी ग्राफ्ट इस विधि का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता बनाया2-3 सप्ताह में डी, कई हफ्तों के तेजी से अन्य इंजीनियर वाहिकाओं की तुलना में। 6 क्लिनिक के लिए, इस समय विसंगति एक बिगड़ती रोगी के उपचार में एक महत्वपूर्ण अंतर कर सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल संस्कृति तैयारी

  1. वाणिज्यिक खरीदा मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का उपयोग।
  2. 88.6% की रचना की चिकनी मांसपेशियों सेल के विकास में मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखने 231 मीडिया, 0.1% पुनः संयोजक मानव इंसुलिन (आरएच-इंसुलिन), पुनः संयोजक मानव fibroblast वृद्धि कारक (आरएच FGF), पुनः संयोजक मानव epidermal वृद्धि कारक (आरएच FGF) में से प्रत्येक, और एस्कॉर्बिक एसिड; और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और एल glutamine के प्रत्येक; और 1% एंटीबायोटिक / कवकनाशी।
    नोट: प्रत्येक वृद्धि कारक, FBS और एल glutamine एक नाड़ी मीडिया विकास किट के रूप में खरीद रहे हैं।
  3. बदलें मीडिया कोशिकाओं तक हर 48 घंटे के बारे में 90% मिला हुआ है और ऊतक बोने के लिए तैयार हैं।
  4. विस्तार के लिए मीडिया परिवर्तन के बीच में एक मशीन में स्टोर कोशिकाओं।

2. 3 डी मुद्रित सम्मिलित करता है और कस्टम सिलिकॉन की तैयारी ढाला प्लेट्स

  1. एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर का उपयोग करें (जैसे, रेप्लिकेटर मिनी) 3 डी के लिए थाली सम्मिलित मुद्रण।
    1. सेशन का प्रयोग करेंएन स्रोत 3 डी डिजाइन सॉफ्टवेयर ऐसे ब्लेंडर के रूप में मुद्रित बाहरी गोले और पदों की 3 डी मॉडल बनाने के लिए।
    2. एक .stl प्रारूप 3 डी प्रिंटर के सॉफ्टवेयर को पोर्टेबिलिटी के लिए अनुमति देता है के माध्यम से मॉडल के ड्राइवर फ़ाइल निर्यात।
    3. मुद्रित पोस्ट और बाहरी गोले पाली का उपयोग कर (लैक्टिक एसिड) रेशा (पीएलए) 3 डी प्रिंटर में लोड निर्माण।
    4. मुद्रण के बाद, एक 30 मिनट की एक 70% -100% इथेनॉल समाधान प्रत्येक डालने बाँझ में लेना प्रदर्शन करते हैं।
  2. पाली (dimethylsiloxane) के बहुलक मिश्रण (PDMS) सिलिकॉन बहुलक का आधार है और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर देगास करने के मिश्रण की अनुमति के लिए एक 1:10 इलाज एजेंट तैयार करें।
    1. पेट्री डिश आकार छोटा (35 मिमी) के रूप में इस्तेमाल किया, मध्यवर्ती (60 मिमी), और बड़ी (100 मिमी) को परिभाषित करें।
    2. 2 एमएल, 4 एमएल और प्रत्येक, छोटे मध्यवर्ती और बड़ी प्लेट क्रमश uncured सिलिकॉन से 6 एमएल जोड़ें, और पेट्री डिश के पूरे नीचे भर में एक पतली परत बना सकते हैं।
    3. एक में PDMS गिरने से छोटी प्लेट के लिए पदों का सृजन100 मिमी 7 मिमी की ऊंचाई तक की थाली और के बारे में 2-3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर इलाज करने के लिए अनुमति देते हैं। तब बेलनाकार पदों बाहर पंच के लिए एक 5 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करें। प्रत्येक सिलेंडर PDMS और प्रत्येक छोटी प्लेट के केंद्र के लिए सुरक्षित करने के लिए uncured PDMS की एक छोटी राशि का प्रयोग करें।
    4. मध्यवर्ती और बड़े प्लेटों के लिए, पहले की प्लेट के नीचे PDMS के इलाज पूरा करने के लिए, 3 डी मुद्रित पदों 10 मिमी और केन्द्र प्रत्येक मध्यवर्ती और बड़े प्लेटों में व्यास में 20 मिमी, क्रमशः जगह है। बड़े प्लेटों के लिए, इसके अलावा एक 3 डी मुद्रित बाहरी कवच ​​पद से समान दूरी व्यास में 66.7 मिमी के बारे में जगह है।
      1. प्रत्येक पकवान के बारे में 2-3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर खुली हवा में इलाज करने के लिए, बहुलक की degassing के लिए 18 घंटे की इजाजत देने की अनुमति दें। उचित क्षेत्र और ओरिएंटेशन में थाली करने के लिए मुद्रित घटकों ठीक कर के रूप में चित्रा 1 में देखा।
    5. सभी पीएलए के अंदर करने के लिए 30 मिनट के लिए 30% आसुत जल के साथ 70% इथेनॉल का एक समाधान जोड़ेंनसबंदी के लिए टीईएस और फिर एक प्लेट को कवर किया।
    6. ध्यान से प्रत्येक थाली से इथेनॉल aspirate और शुष्क हवा की अनुमति देते हैं।
    7. इसकी ढक्कन, चेहरे-अप करने के लिए अगले एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में एक थाली की व्यवस्था। प्लेटें और पलकों नसबंदी पूरा करने के लिए 30 मिनट के लिए बीएससी के तहत पराबैंगनी प्रकाश को बेनकाब। बाँझ तकनीक यूवी जोखिम के बाद हर कदम के साथ किया जाता है।

3. आतंच हाइड्रोजेल की तैयारी, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और प्लेट्स के रखरखाव के साथ सीडिंग

  1. आतंच विकास मीडिया + 0.01%, छोटे मध्यवर्ती और बड़े आकार के लिए प्लेट 0.5 एमएल, 1.1 एमएल और 1.81 एमएल की मात्रा में TGF-β1, क्रमशः युक्त जेल का एक समाधान मिक्स।
    1. , प्रत्येक, छोटे मध्यवर्ती और बड़ी प्लेट की मीडिया के लिए क्रमश: 40 μL, 88.4 μL और थ्रोम्बिन के 145 μL जोड़ें, 100 यू / एमएल के एक शेयर से। धीरे हाथ से प्रत्येक थाली ज़ुल्फ़ सुनिश्चित करने के लिए कि थ्रोम्बिन समान रूप से मीडिया के भीतर मिलाया जाता है।
    2. अगले, 160 जोड़ने1, एल, 354 μL और 580 μL फाइब्रिनोजेन, 20 मिलीग्राम की एक स्टॉक से / एमएल, ड्रॉप-वार चक्राकार थ्रोम्बिन मीडिया मिश्रण करने के लिए प्रत्येक, छोटे और बड़े मध्यवर्ती थाली करने के लिए, क्रमशः। धीरे हाथ से चक्कर आने के लिए एक भी परत में मिश्रण और हाइड्रोजेल का वितरण सुनिश्चित करने के लिए।
    3. हाइड्रोजेल कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए इलाज के लिए अनुमति दें।
  2. Trypsinize चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं मानक प्रोटोकॉल के अनुसार 150 मिमी सेल संस्कृति प्लेटों और सेंट्रीफ्यूज में विस्तार किया। 231 मीडिया, 1% FBS और 1% एंटीबायोटिक / कवकनाशी - जिसके परिणामस्वरूप गोली 98% से मिलकर भेदभाव मीडिया के 3 एमएल में resuspended किया जाना चाहिए।
    1. तेजी से एक 2 एमएल पिपेट साथ titrating से और नीचे कोशिकाओं मिश्रण किसी भी सेल clumps को तोड़ने के लिए। एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना और /, छोटे मध्यवर्ती और बड़े प्लेटों के लिए एमएल क्रमश: 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल, 1.0 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल और 1.4 10 x 7 कोशिकाओं के एक सेल निलंबन पैदा करते हैं।
    2. प्रत्येक सेल निलंबन int के 1 एमएल जोड़ेंOA इसी 50 एमएल शंक्वाकार, छोटे मध्यवर्ती और बड़े लेबल। प्रत्येक अतिरिक्त ऊतक अंगूठी वांछित के लिए इस तरह से एक अतिरिक्त 50 एमएल शंक्वाकार सेट करें।
    3. प्रत्येक शंक्वाकार को भेदभाव मीडिया जोड़ें 2 एमएल, 4 एमएल और प्रत्येक, छोटे मध्यवर्ती और बड़े पोत के लिए 5 एमएल के अंतिम बोने मात्रा में प्राप्त करने के लिए, क्रमशः। फिर, ध्यान से सेल समाधान बूंद के लिहाज से प्रत्येक इसी थाली में तैयार हाइड्रोजेल के शीर्ष पर pipet।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर और 5% सीओ 2 में जगह प्लेटें।
  3. बदलें भेदभाव मीडिया एक थाली के लिए हर 48-72 घंटे। बड़ा प्लेट के मामले में शुरू में 24 घंटे के बाद मीडिया को बदलने, तो यह हर 48-24 घंटे बदलने के बड़े सेल बोने घनत्व के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए।
    1. बाद छल्ले के रूप में 2-4 दिनों के लिए पूरी तरह से पोस्ट की दिशा में अनुबंधित किया जाएगा, 10 μL, 20 μL और TGF-β1 के 35 μL प्रत्येक, छोटे मध्यवर्ती और बड़े अंगूठी के लिए क्रमश: जोड़ें। TGF-β के लिए जोखिम के बाद; 1 कम से कम 24 घंटे के लिए, अंगूठियां नियंत्रित किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं।

4. नाड़ी का निर्माण और रखरखाव के विधानसभा

  1. अंतिम नाड़ी निर्माण के निर्माण से पहले, एक विशेष कंटेनर पूरा पोत धारण करने के लिए बनाई गई है।
    1. छोटे पोत के लिए, एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पॉली कार्बोनेट के ऊपर से एक 2 इंच खंड काटने से अंगूठी स्टैकिंग के लिए एक लंबा प्लेट बनाने के लिए, और फिर PDMS एक 35 मिमी की थाली में कटौती बढ़त गोंद। प्लेट ढक्कन के रूप में शंक्वाकार ढक्कन का प्रयोग करें।
    2. मध्यवर्ती और बड़े पोत लंबा रिंग प्लेटों stacking के लिए, लंबाई लंबा प्लेट दीवारों के रूप में सेवा करने के लिए 2.5 इंच वर्गों में 1.75 इंच व्यास पॉली कार्बोनेट ट्यूब काटा। लंबा प्लेट नीचे के लिए, 2 इंच व्यास चक्र टुकड़ों में एक 0.125 इंच मोटी पाली कार्बोनेट शीट काट दिया। एक्रिलिक विलायक सीमेंट का प्रयोग, परिपत्र कटौती टुकड़ा करने के लिए पॉली कार्बोनेट ट्यूब अनुभाग बाँध। लंबा प्लेट के लिए ढक्कन के रूप में एक 60 मिमी पेट्री डिश से ढक्कन का प्रयोग करें।
    3. 3 डी पीप्रिंट करें पदों 5, व्यास में 10 और 20 मिमी और लंबाई में 50 मिमी।
    4. uncured सिलिकॉन के 10 एमएल प्रत्येक कंटेनर में जोड़े। PDMS का पूरा इलाज करने से पहले, केंद्रीय रूप से प्रत्येक, छोटे मध्यवर्ती, और बड़े कंटेनर में कदम 4.1.3 में बनाई गई प्रत्येक पद के लिए जगह है।
    5. 2-3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म थाली सेट पर इलाज करने की अनुमति दें।
    6. 30 मिनट के लिए 30% आसुत जल के साथ 70% इथेनॉल का एक समाधान के साथ बाँझ।
    7. ध्यान से प्रत्येक कंटेनर से इथेनॉल aspirate और फिर बीएससी में हवा शुष्क करने की अनुमति। इसके बाद, अपनी ढक्कन, चेहरे-अप के बगल में रखा प्रत्येक थाली के साथ हुड में कंटेनरों की व्यवस्था। आगे नसबंदी के लिए एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए बीएससी के तहत पराबैंगनी प्रकाश के कंटेनरों को बेनकाब। यूवी जोखिम के बाद हर कदम के साथ बाँझ तकनीक का प्रयोग करें।
  2. बहुत ठीक संदंश का प्रयोग, ध्यान से अपने पद से प्रत्येक कसकर लुढ़का चिकनी मांसपेशियों हाइड्रोजेल अंगूठी निकालने और लंबा पदों के साथ अपनी इसी बड़े कंटेनर के लिए स्थानांतरण।
    1. की एक जोड़ी का उपयोग करेंएक हाथ में संदंश और पद से अंगूठी के एक तरफ उठा, और फिर अन्य। रक्षा और लुमेन बनाए रखने के लिए सावधान रहें।
    2. इस दो हाथ विधि के साथ अंतरण, लंबा पद पर पहली बार एक पक्ष है, तो अंगूठी के दूसरी ओर फिसलने। कोमल, क्रमिक आंदोलनों का उपयोग कर, और circumferentially काम कर रहा है, धीरे धीरे लंबा पद पर नीचे की अंगूठी धक्का। इसके बाद ऊतक के छल्ले ढेर जब तक वांछित पोत की लंबाई प्रत्येक अंगूठी पूरा का निर्माण करने के लिए लंबाई के लगभग 1-2 मिमी जोड़ने के साथ, प्राप्त किया गया है।
  3. अंगूठी ढेर लंबा 3 डी मुद्रित पदों पर तैनात साथ, प्लेट बारी तो उस पद के काम की सतह के साथ समानांतर है।
    1. एक micropipette का प्रयोग, थ्रोम्बिन के 40, 80 और 160 μL 100 यू / एमएल की एकाग्रता में धीरे प्रत्येक, छोटे मध्यवर्ती और बड़े पोत की बाहरी सतह के लिए क्रमश: जोड़ें। थ्रोम्बिन जोड़ने के दौरान, धीरे-धीरे प्लेट बारी बारी से निर्माण की सभी सतहों की कवरेज भी सुनिश्चित करने के लिए।यह आतंच गोंद निर्माण के बाद शुरुआती दिनों में अंगूठी ढेर निर्माण को सुरक्षित करने के लिए उपयोग के लिए आधार होगा।
    2. अगले, फाइब्रिनोजेन के 40, 80 और 160 μL 20 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में प्रत्येक, छोटे मध्यवर्ती, और बड़े निर्माण के लिए क्रमश: एक micropipette का उपयोग करते समय जल्दी से निर्माण घूर्णन जोड़ें। थ्रोम्बिन और फाइब्रिनोजेन जल्दी से एक फर्म जेल एक बार मिलाया में निर्धारित किया है। लघु इलाज समय के कारण, जितनी जल्दी संभव हो और समान रूप से फाइब्रिनोजेन लागू होते हैं।
  4. भेदभाव मीडिया के 20 एमएल प्रत्येक कंटेनर का निर्माण धारण करने के लिए जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह जहाजों की जरूरत तक। मीडिया हर 3-5 दिन बदल जाते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ का प्रदर्शन 3 अलग इंजीनियर संवहनी भ्रष्टाचार आकार (चित्रा 1) के निर्माण, दिखा रहा है कि रिंग Stacking विधि (RSM) स्केलेबल है। प्रयोज्यता साबित करने के लिए, 3 अलग पोत आकार बाईं पूर्वकाल धमनी उतरते लिए वास्तविक मानव पोत आकार के लिए सहसंबंधी चुना (छोटे, व्यास लुमेन = 4 मिमी) 17, महाधमनी (मध्यवर्ती; व्यास लुमेन = 10 मिमी) और उतरते आरोही महाधमनी (बड़े; लुमेन व्यास = 20 मिमी) 18। दीवार मोटाई लगभग 500 छोटे छल्ले के लिए माइक्रोन, और दोनों मध्यवर्ती और बड़े छल्ले के लिए के बारे में 1500 मीटर है। प्रत्येक पोत का प्रदर्शन 6 छल्ले स्टैकिंग, छोटे पोत के लिए लगभग 6 मिमी और मध्यवर्ती और बड़े जहाजों के लिए 9 मिमी की लंबाई को equating द्वारा बनाया गया है। लंबाई प्रत्येक व्यक्ति की अंगूठी की दीवार मोटाई पर आधारित है।

ऊतकीय विश्लेषण से पता चलासभी के छल्ले के आकार में उच्च कोषमयता (चित्रा 2)। लाल सामग्री आतंच जेल demarcates। छोटे छल्ले में, अवशिष्ट आतंच जेल की एक छोटी राशि की अंगूठी के बाहरी छोर पर देखा जाता है। बड़े छल्ले में, कुछ आतंच जेल सेलुलर सामग्री के साथ बीच-बीच में किया गया था। मेसन के Trichrome दाग में, कोलेजन उत्पादन (नीला द्वारा चिह्नित) के संकेत मध्यवर्ती और बड़े छल्ले के रूप में देखा जा सकता है।

सेल phenotype निर्धारित करने के लिए अंगूठी गठन के बाद, ऊतक के छल्ले immunofluorescence का उपयोग एंटीबॉडी अल्फा-चिकनी करने के लिए पेशी actin (SMA) और tropomyosin (चित्रा 3) का विश्लेषण किया गया। सभी अंगूठी के आकार दोनों एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक थे, पुष्टि है कि चिकनी मांसपेशियों phenotype बनाए रखा गया था।

तनन परीक्षण अलग अलग आकार के छल्ले पर प्रदर्शन किया गया था उनके यांत्रिक गुणों (चित्रा 4) निर्धारित करने के लिए। यू-खिंचाव, एक mechaniकैलोरी परीक्षण उपकरण, परीक्षण छोटी और मध्यवर्ती छल्ले और जहाजों तन्यता करने के लिए इस्तेमाल किया, जबकि एक Instron तन्यता परीक्षण बड़े छल्ले और जहाजों का इस्तेमाल किया गया था। लोचदार मापांक (ई), परम तन्य शक्ति (यूटीएस) और विफलता शक्ति (एफएस) डेटा एकत्र किए गए थे। एक लगातार प्रवृत्ति बढ़ती ताकत बढ़ाने की अंगूठी और पोत के आकार के correlating के साथ मनाया गया।

सेल विविध आकार के छल्ले बनाने के लिए आवश्यक संख्या में बोने बोने सतह क्षेत्र (चित्रा 5) के साथ लगभग रैखिक वृद्धि हुई है। आदेश में बड़े छल्ले बनाने के लिए, कम से कम 14 लाख कोशिकाओं उदर महाधमनी आकार के छल्ले बनाने की जरूरत थी।

छह-अंगूठी के ढेर, या जहाजों, प्रवाह का सामना करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया गया। निर्माणों एक कस्टम निर्मित छिड़काव प्रणाली (चित्रा 6) में भरी हुई है और 100 से 417 के लिए एमएल / मिनट से प्रवाह दरों पर अप करने के लिए 5 मिनट के लिए प्रवाह के अधीन थे। वेसल्स थेप्रवाह को झेलने में सक्षम। माइनर लीक पोत सिरों पर मनाया गया, छिड़काव प्रणाली के लिए कनेक्टर्स पर।

आकृति 1
चित्रा 1: बढ़ाया इंजीनियर जहाजों का निर्माण। ए), इंजीनियर वाहिकाओं स्केलिंग प्लेट तैयारी, सेल बोने और पोत के निर्माण के साथ शुरू करने की प्रक्रिया का आरेख। प्रदर्शन तीन अलग अलग आकार बी) के छल्ले और सी) जहाजों कर रहे हैं। डी) प्रतिनिधि बड़े पोत पूरी तरह से जैविक और प्राकृतिक ऊतक जैसा दिखता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: histological विश्लेषण। रोंग> एच ई और मेसन की Trichrome दाग सभी अंगूठी आकार के लिए अंगूठी मोटाई भर व्यवहार्य कोषमयता दिखा। Trichrome दाग ब्लू (नीले तीर) ने संकेत दिया कोलेजन उत्पादन के क्षेत्रों का पता चलता है। बड़े छल्ले आतंच जेल सेल चादर की अपेक्षाकृत बड़ा सतह क्षेत्र की तह की वजह से बीच-बीच में हैं, आमतौर पर दिखाया। स्केल सलाखों: छोटे छल्ले = 200 माइक्रोन; मध्यवर्ती छल्ले = 200 माइक्रोन; और बड़े छल्ले = 0.5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: चिकनी मांसपेशियों मार्करों के लिए immunofluorescence विश्लेषण। सभी अंगूठी के आकार चिकनी मांसपेशी सिकुड़ा प्रोटीन α चिकनी पेशी actin (SMA) और tropomyosin (टीएम) के लिए सकारात्मक थे। स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन।लोड / 55322 / 55322fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: तनन परीक्षण विश्लेषण। के छल्ले और जहाजों के सभी आकार के लिए तनाव तनाव घटता अंगूठी / पोत के आकार में वृद्धि के साथ correlating शक्ति में वृद्धि की एक सामान्य प्रवृत्ति देखी गई। छल्ले और जहाजों circumferentially फैला रहे थे। रेखांकन से मूल्यांकन पैरामीटर लोचदार मापांक, परम तन्य शक्ति और विफलता शक्ति (1 टेबल में सूचीबद्ध) थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: सेल बोने सर्फ करने के लिए संख्या के सहसंबंध बोनेइक्का क्षेत्र। मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के आधार पर। सतह क्षेत्र केंद्र पोस्ट और प्लेट दीवार या बाहरी कवच ​​के बीच अंगूठी गठन प्लेटों में क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: छह अंगूठी पोत छिड़काव विश्लेषण के अधीन। ए) कस्टम निर्मित प्रवाह परीक्षण के लिए छिड़काव प्रणाली। बी) के इंजीनियर पोत छिड़काव प्रणाली में भरा हुआ है। तीन जहाजों छिड़काव प्रवाह शर्तों के तहत अप करने के लिए 5 मिनट के लिए लीक के लिए परीक्षण किया गया। वाहिकाओं प्रवाह के तहत स्थिर बने रहे, पोत अंत कनेक्टर्स प्रणाली ट्यूबिंग से जुड़ी पर नाबालिग लीक के साथ। कृपया देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

एनिमेटेड चित्रा 1
एनिमेटेड चित्रा 1: एक इंजीनियर पोत के माध्यम से छिड़काव प्रवाह का प्रदर्शन। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

छोटा मध्यम विशाल
के छल्ले लोचदार मापांक (केपीए) 13.6 ± 2.25 (एन = 6) 14.5 ± 1.2 (एन = 3) 17.2 ± 2.2 (एन = 4)
परम तन्य शक्ति (कश्मीरPa) 34.5 ± 10.2 39.6 ± 2.98 50.9 ± 10.6
विफलता शक्ति (केपीए) 34.5 ± 10.2 39.6 ± 2.98 50.9 ± 10.6
वेसल्स लोचदार मापांक (केपीए) 49.7 ± 2.80 (एन = 3) 59.8 ± 3.90 (एन = 2) 79.8 ± 10.1 (एन = 2)
परम तन्य शक्ति (केपीए) 115 ± 6.90 137 ± 12.0 192 ± 86.9
विफलता शक्ति (केपीए) 96.2 ± 12.2 60.7 ± 12.1 173 ± 92.2

तालिका 1: बढ़ाया छल्ले और जहाजों की तन्यता गुण।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

रिंग Stacking विधि वर्तमान संवहनी ऊतक इंजीनियर निर्माण तकनीक पर कई फायदे प्रस्तुत करता है। RSM बस पोस्ट और बाहरी कवच ​​आयामों अनुरूपण के द्वारा किसी भी आकार के मानव जहाजों को बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हमारे विधि बहुलक मुक्त इंजीनियर पूरी तरह से मानव कोशिकाओं और तेजी से शरीर की प्राकृतिक घाव भरने की प्रक्रिया में पाया समर्थन सामग्री से बना अपमानजनक वाहिकाओं के विकास के लिए अनुमति देता है। पॉलिमर ग्राफ्ट क्लिनिक में restenosis कारण जाना जाता है और अगर इंजीनियर ग्राफ्ट में निहित समस्याग्रस्त हो सकता है। सेल बोने संख्या प्रत्येक अलग-अलग आकार के ऊतकों की अंगूठी के लिए संशोधित किया जाना चाहिए। बोने सतह क्षेत्र के लिए सेल नंबर का ग्राफ चित्रा 5 में दिखाया गया है जिसमें से बोने नंबर approximated और / या extrapolated किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सेल का यहां इस्तेमाल किया प्रकार मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं रहे हैं। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए RSM अनुकूल करने के लिए, सेल आकार और प्रसार दर में उठाए जाने की जरूरतविचार और इष्टतम बोने घनत्व निर्धारित की। उदाहरण के लिए, हम भी RSM का उपयोग मानव fibroblast छल्ले बनाया है, और पाया है कि कम से कम 2x कोशिकाओं की संख्या की तुलना में एसएमसी की जरूरत है। पोत के किसी भी वांछित लंबाई के छल्ले के अलावा के माध्यम से बनाया जा सकता है। रिंग के ढेर अप करने के लिए 2 महीने के लिए संवर्धित किया गया है और स्थिर बने रहे। मध्यवर्ती और बड़े छल्ले दोनों भले ही वे एक एक 60 मिमी और 100 मिमी प्लेट में निर्माण कर रहे हैं, क्रमश: 100 मिमी प्लेट में एक बाहरी कवच ​​की नियुक्ति से उचित 1,500 माइक्रोन मोटाई दीवार पर रखा जाता है। यह नियंत्रित करने और किसी दिए गए पोत के लिए उचित दीवार मोटाई प्राप्त करने के लिए बाहरी कवच ​​की उपयोगिता से पता चलता है। चरण 3.3.1 में, TGF-β1 क्योंकि यह कोलेजन उत्पादन 19 को प्रोत्साहित करने के लिए जाना जाता है और छल्ले कस मनाया प्रभाव पड़ता है जोड़ा जाता है। एक बार जब छल्ले पूरी तरह से लुढ़का हुआ है, TGF-β1 की एक खुराक अंतिम चरण में जोड़ा जाता है, और अंगूठी के लिए उपयोग 1 दिन बाद तैयार हैं। TGF-β1 के छल्ले में कोलेजन उत्पादन बढ़ाने, Trichrome छवियों (चित्रा 2) के रूप में देखा है।

जबकि 2 बड़े आकार में, बाहरी किनारों के साथ कोशिकाओं ऊतक बढ़त के साथ और अन्य गठबंधन कोशिकाओं के साथ साथ संरेखण के एक डिग्री प्रदर्शन छोटे छल्ले में कोशिकाओं, अधिक गोल और कॉम्पैक्ट हैं। उत्तरार्द्ध सेल परिपक्वता के बाद के चरण में, बड़े छल्ले में उच्च सेल सामग्री से विकसित का संकेत हो सकता है, और इसलिए कहनेवाला संकेतन का एक बड़ा डिग्री परिपक्वता प्रोत्साहित करने के लिए। बड़े छल्ले में आतंच जेल interspersion का संकेत हो सकता है कि बड़े सेल चादरों से थोड़ा गुना करने के लिए के रूप में वे रोल करते हैं। ऊतकीय इस घटना दिखा छवियों 1 दिन पूरा अंगूठी रोल ऊपर इस प्रकार यह समझा जा सकता है कि आतंच जेल है, जो संस्कृति में नीचा करने के लिए 2 सप्ताह का समय लगता है, अभी भी मौजूद रहेंगे निम्नलिखित ले जाया गया। कम से कम 2 सप्ताह के लिए छल्ले संवर्धन आतंच जेल नीचा होना चाहिए, एक पूरी तरह सेलुलर निर्माण छोड़ने के पीछे।

NT "> अल्फा-चिकनी पेशी actin (SMA) पतली तंतु है कि सुविधा संकुचन और tropomyosin एक सिकुड़ा प्रोटीन होता है का गठन किया। 20, 21 और दोनों एसएमए tropomyosin मध्यवर्ती में, सभी आकार के छल्ले में उपस्थित थे मजबूत, सबसे समान रूप से वितरित संकेत के साथ बजता है। यह घटना सेल घनत्व और संगठन के एक उच्च डिग्री के कारण हो सकता है, सिकुड़ा ढंग विकास में वृद्धि उत्तेजक।

लोचदार मापांक के छल्ले की लोच को इंगित करता है, और छोटे से बढ़ती ई बड़े छल्ले को कोलेजन और elastin उत्पादन में वृद्धि का सुझाव है। परम तन्य शक्ति सर्वोच्च शक्ति को तोड़ने के बिना छल्ले द्वारा सहा है। विफलता ताकत ऊतक विफलता की बात है। छल्ले के लिए, यूटीएस एफएस के बराबर होती है। जहाजों के लिए, यूटीएस एफएस से अधिक है, जो दिखाता है कि पोत के परम शक्ति सभी के छल्ले से यांत्रिक योगदान के संयोजन के लिए जिम्मेदार ठहराया हैपोत में, और विफलता बिंदु सबसे कमजोर अंगूठी के कारण है।

हमारे इंजीनियर वाहिकाओं की ताकत, केपीए रेंज में निहित है, जबकि देशी मानव वाहिकाओं एमपीए सीमा के भीतर ताकत है। आदेश मूल निवासी जहाजों की कि प्रति हमारी वाहिकाओं को मजबूत बनाने के लिए, हम बाह्य मैट्रिक्स उत्पादन, अर्थात् है कि कोलेजन और elastin के बढ़ाने के लिए तकनीक की जांच कर रहे हैं। वृद्धि कारक है कि कोलेजन और elastin उत्पादन को बढ़ावा देने वर्तमान में कि क्या जांच करने तन्यता गुणों में वृद्धि होगी हमारे छल्ले के लिए लागू किया जा रहा है।

यांत्रिक गुणों के अलावा, मांसपेशियों में संकुचन के कार्यात्मक उपायों पोत प्रदर्शन के लिए प्रासंगिक हैं। मांसपेशियों उत्तेजना और ऐसे acetylcholine और एपिनेफ्रीन जैसे कारकों से संकुचन मांसपेशी सिकुड़ा बल परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह के प्रयोगों हमारे भविष्य के अध्ययन के लिए विचार किया जा रहा है।

कुल मिलाकर, हमारे परिणाम बताते हैं कि रिंग Stacking विधि को आसानी से बढ़ाया जा सकता हैइंजीनियर संवहनी ऊतक आकार की एक सीमा प्राप्त करने के लिए। इस तरह 40 मिमी व्यास महाधमनी लुमेन के रूप में सबसे बड़ी मानव वाहिकाओं, स्केलिंग, संभावना एक वासा vasorum, microvasculature स्वाभाविक रूप से बड़े आकार के जहाजों के भीतर मौजूद है, जो हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में विकसित कर रहा है के विकास की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, endothelial सेल परत (यानी, intima) कि आम तौर पर लाइनों मीडिया परत के लुमेन एक पोत में उचित hemodynamics की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है। हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में मानव संवहनी endothelial कोशिकाओं का उपयोग हमारे एसएमसी अंगूठी ढेर में intima के निर्माण पर काम कर रहा है। इन संयुक्त प्रौद्योगिकियों के साथ, इंजीनियर वाहिकाओं क्लिनिक के लिए अधिक से अधिक प्रयोज्यता होगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ऊतक विज्ञान और सेल संस्कृति से कुछ के साथ अपनी तरह की सहायता के लिए हमारे साथी लाम प्रयोगशाला सहयोगियों अम्मार चिश्ती और बीजल पटेल को धन्यवाद देना चाहूंगा। अनुदान वेन स्टेट यूनिवर्सिटी Nanomedicine फैलोशिप (सीबीपी) द्वारा प्रदान किया गया था, शुरू हुआ धन और हृदय अनुसंधान संस्थान बीज अनुदान (MTL)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells  ATCC PCS-100-012 vascular smooth muscle cells
Medium 231 Gibco (Life Technologies  M-231-500 media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit  ATCC PSC-100-042 growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer  MakerBot  N/A 3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA) MakerBot  N/A 3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS) Ellworth Adhesives  3097358-1004 polymer for gluing plate parts
Fibrinogen Hyclone Labratories, Inc. SH30256.01 fibrin gel component
Thrombin  Sigma Life Sciences F3879-5G fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1  PeproTech 100-21 growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer  Hausser Scientific Co. 3200 for cell counting
Polycarbonate tubing  US Plastics  PCTUB1.750X1.625 material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet  Home Depot 409497 material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent  SCIGRIP 10799 material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940 Instron N/A tensile testing machine
U-Stretch Cell Scale N/A tensile testing machine
Smooth Muscle Actin  MA5-11547 Thermo Fisher antibody
Tropomyosin MA5-11783 Thermo Fisher antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luciani, G. B., et al. Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease. ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).
  2. Lawson, J. H., et al. Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials. Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).
  3. McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).
  4. Wystrychowski, W., et al. First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access. J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).
  5. Konig, G., et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).
  6. Gui, L., et al. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).
  7. Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells. Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).
  8. Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. Allogeneic human tissue-engineered blood vessel. J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).
  9. Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).
  10. Dahl, S. L., et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci Transl Med. 2 (68), (2011).
  11. Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
  12. Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
  13. Meier, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery. J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).
  14. Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts. Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).
  15. Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).
  16. Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
  17. Fearon, W. F., et al. Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation. Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).
  18. Erbel, R., Eggebrecht, H. Aortic dimensions and the risk of dissection. Heart. 92 (1), 137-142 (2006).
  19. Ha, D. M., et al. Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease. J Transl Med. 14, 39 (2016).
  20. Skalli, O., et al. Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes. J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).
  21. von der Ecken, J., et al. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 121 नाड़ी भ्रष्टाचार ऊतक इंजीनियरिंग स्केलिंग 3 डी प्रिंटिंग चिकनी मांसपेशियों व्यास लुमेन दीवार मोटाई
इंजीनियर संवहनी grafts के स्केलिंग 3 डी मुद्रित गाइड और अंगूठी Stacking विधि का प्रयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pinnock, C. B., Xu, Z., Lam, M. T.… More

Pinnock, C. B., Xu, Z., Lam, M. T. Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method. J. Vis. Exp. (121), e55322, doi:10.3791/55322 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter