Summary
Skal engineered blodkärl skulle förbättra den kliniska tillämpningen. Med användning av lätt ansenliga 3D-tryckta guider, var ringar av vaskulär glatt muskulatur skapas och staplas in i en rörform, som bildar en kärltransplantat. Transplantat kan dimensioneras för att möta de olika mänskliga kransartär dimensioner genom att helt enkelt ändra 3D-tryckta guiden storlek.
Abstract
Kranskärlssjukdom förblir en ledande dödsorsak och drabbar miljontals amerikaner. Med bristen på autologa kärltransplantat tillgängliga tekniska transplantat erbjuder stora möjligheter för patientbehandling. Emellertid engineered vaskulära transplantat är i allmänhet inte lätt skalbara, vilket kräver tillverkning av anpassade gjutformen eller polymerrören för att anpassa efter olika storlekar, som utgör en tidskrävande och kostsamt förfarande. Mänskliga artärer varierar i lumen diameter från cirka 2,0 till 38 mm och i tjocklek från ca 0,5 till 2,5 mm. Vi har skapat en metod, benämnd "ring Stacking Method", där varierande storlek ringar av vävnad i önskad celltyp, visade här med vaskulära glatta muskelceller (SMC), kan skapas med guider centrum inlägg att kontrollera lumen diameter och yttre skalen att diktera kärlets väggtjocklek. Dessa vävnadsringar staplas sedan för att skapa en rörformad konstrukt, som imiterar den naturliga formen av ett blodkärl. Fartyget längd kan be skräddarsys genom att helt enkelt stapla antalet ringsignaler som krävs för att utgöra den längd som behövs. Med vår teknik kan vävnader från i form av rör, liknande ett blodkärl, lätt tillverkas i en mängd olika dimensioner och längder för att möta behoven hos kliniken och patienten.
Introduction
Vid behandling av kransartärsjukdom (CAD), är en patients egna blodkärl skördas som ympmaterial för bypass-kirurgi. Men ofta, sjuka patienter har inte livskraftiga fartyg att donera till sig, och i de fall där de gör, givarstället orsakar betydande extra skada och har en allvarlig risk för infektion. 1 Engineered kärlimplantat skulle kunna fylla detta behov. Skalbarhet är av yttersta vikt för ingenjörs fartyg för att möta det breda utbudet av patientens behov fartygets storlek. Men nuvarande metoder för tekniska fartyg inte skalbar, och kräver typiskt nytillverkning av komplexa formar eller polymerstöd. Mest konstruerade transplantat antingen använda en polymer tubulär schavotten som ympas med kärl fibroblaster, glatt muskulatur, eller endotelceller; eller rullande en cellarket runt en dorn för att skapa en vävnadsröret. Två konstruerade vaskulära transplantat i kliniska prövningar bygger på en decellularized polymer-ECM-plattform. 2, 3, 4 Polymer transplantat tillgängliga för användning i vaskulär reparation är redan kända för att ha problem med öppenhet, som kan uppstå som en viktig fråga med långvarig användning av ett transplantat med en varaktig närvaro polymer. Rörformiga formar har använts för att tillverka helt cellulära fartyg, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 vilka förfaranden skulle kräva ytterligare konstruktion och verktygstillverkning för anpassade formar för att producera fartyg i olika storlekar .
Den metod som beskrivs häri, omfattar en ny teknik för att skapa skalbar engineered vaskulärtransplantat använder anpassningsbara 3D tryckta insatser och traditionella odlingsplattor. 14 Celler såddes i plattor med skär av en central post och yttre skal. efterhandskontroller lumen diameter och tillåter encellsskiktet att själv montera in en ring av vävnad. Det yttre skalet styr tjockleken av ringen, och därmed väggtjockleken hos den slutliga kärlet. Genomförda vävnadsringar staplas sedan till bildande av en rörformig, kärltransplantat. Fördelen med denna metod, benämnd "ring Stacking Method" är att vidhäftande celltyp kan ympas in i plattan inställning och vävnadsringar eller rör av alla storlekar som krävs för den önskade applikationen kan genereras genom att helt enkelt modifiera styrinsatser. Jämförande tekniker i vävnadsteknik SKAPA ringar av vävnad förblir svåra att skala, 15, 16 kräver nytillverkning av formar för varje önskad storlek. Dessutom, vaskulära transplantat med användning av denna metod kan producerad på 2-3 veckor, flera veckor snabbare jämfört med andra tekniska fartyg. 6 För kliniken, kan den här gången diskrepans göra en betydande skillnad i behandling av en försämrad patient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture Förberedelse
- Utnyttja mänskliga glatta muskelceller från aorta köpas kommersiellt.
- Upprätthålla celler i glattmuskelcelltillväxtmedium som består av 88,6% 231 medier, 0,1% vardera av rekombinant humant insulin (rh-insulin), rekombinant human fibroblasttillväxtfaktor (rH-FGF), rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (rH-FGF), och askorbinsyra; och 5% vardera av fetalt bovint serum (FBS) och L-glutamin; och 1% antibiotika / antimykotika.
OBS! Varje tillväxtfaktor, FBS och L-glutamin är köpas som en vaskulär mediatillväxt kit. - Ändra media varje 48 timmar tills cellerna är omkring 90% sammanflytande och redo för vävnads sådd.
- Minnesceller i en inkubator i mellan medie förändringar för expansion.
2. Beredning av 3D Tryckt Insatser och anpassade silikon Gjuten Plates
- Använd en kommersiell 3D-skrivare (t.ex. Replicator Mini) för 3D utskrift plattan skär.
- Använd open källa 3D-design program som Blender för att skapa 3D-modeller av de tryckta yttre skal och inlägg.
- Exportera modellen förare fil via en STL format möjliggör portabilitet till 3D-skrivare programvara.
- Framställa tryckta inlägg och yttre skal som använder poly (mjölksyra) filament (PLA) laddas i 3D-skrivare.
- Efter tryckning, utför en 30 minuters tid i en 70% -100% etanollösning för att sterilisera varje insats.
- Bered en 1:10 härdningsmedel till baspolymer blandning av poly (dimetylsiloxan) (PDMS) silikonpolymer och låt blandningen avgasas vid rumstemperatur under 10 min.
- Definiera petriskålstorlekar som används som små (35 mm), mellanprodukt (60 mm), och stora (100 mm).
- Tillsätt 2 ml, 4 ml och 6 ml av ohärdad silikon på varje liten, mellan och stor tallrik, respektive, och skapar ett tunt skikt över hela botten av petriskål.
- Skapa tjänster för den lilla plattan genom att hälla PDMS i en100 mm platta till en höjd av 7 mm och låt härda på en värmeplatta vid 60 ° C under ca 2-3 timmar. Använd sedan en 5 mm biopsistans att stansa ut cylindriska inlägg. Använd en liten mängd av ohärdad PDMS för att säkra varje PDMS cylinder och mitten av varje skylt.
- För de mellanliggande och stora plattor, före fullständig härdning av PDMS i botten av plattan, placera 3D tryckta inlägg 10 mm och 20 mm i diameter centralt i varje mellanliggande och stora plattor, respektive. För de större plåtarna, dessutom placera en 3D tryckt yttre skal ca 66,7 mm i samma avstånd diameter från posten.
- Tillåta varje skål för att härda i fria luften på en värmeplatta vid 60 ° C under ca 2-3 timmar, vilket gör att 18 timmar för avgasning av polymeren. Fixa tryckta komponenter till plattan i rätt region och orientering som framgår av fig 1.
- Tillsätt en lösning av 70% etanol med 30% destillerat vatten i 30 minuter till insidan av alla plates för sterilisering och sedan täcka varje platta.
- Försiktigt aspirera etanol från varje platta och låt lufttorka.
- Ordna varje platta i ett biologiskt säkerhetsskåp (BSC) bredvid locket, framsidan uppåt. Exponera plattor och lock för UV-ljus under BSC under 30 minuter för fullständig sterilisering. Steril teknik utförs med varje steg efter UV-exponering.
3. Framställning av Fibrin Hydrogel, ympning med glatta muskelceller och Underhåll av tallrikar
- Blanda en lösning av fibrin gel innehållande tillväxtmedier + 0,01% TGF-β1 i mängder av 0,5 ml, 1,1 ml och 1,81 ml för små, medelstora och stora plattstorlekar, respektive.
- Tillsätt 40 mikroliter, 88,4 mikroliter och 145 mikroliter av trombin, från ett lager av 100 U / ml, till media för varje liten, mellan och stor tallrik, respektive. Snurra försiktigt varje platta för hand för att se till att trombin blandas ordentligt i media.
- Därefter till 1601, L, 354 mikroliter och 580 mikroliter fibrinogen, från ett lager av 20 mg / ml, droppvis cirkulärt till trombin-medie blandningen till varje liten, mellan och stor tallrik, respektive. virvla försiktigt för hand för att säkerställa blandning och fördelning av hydrogelen i ett jämnt skikt.
- Tillåta hydrogel härda under 10-15 minuter vid rumstemperatur.
- Trypsinize glatta muskelceller expanderas i 150 mm cellodlingsplattor och centrifugera i enlighet med standardprotokoll. Den resulterande pelleten bör återsuspenderades i 3 ml av differentiering media bestående av 98% - 231 media, 1% FBS och 1% antibiotika / antimykotika.
- Kraftigt blanda celler genom att titrera upp och ned med en 2 ml pipett för att bryta upp eventuella cellklumpar. Räkna celler med en hemocytometer och skapa en cellsuspension av 2 x 10 6 celler / ml, 1,0 x 10 7 celler / ml och 1,4 x 10 7 celler / ml för små, mellanstora och stora plattor, respektive.
- Tillsätt 1 ml av varje cellsuspension intoa motsvarande 50 ml koniska märkt små, medelstora och stora. Inrätta ytterligare 50 ml koniska på detta sätt för varje ytterligare vävnad ring önskas.
- Lägg differentiering media till varje konisk för att erhålla slutliga sådd volymer 2 ml, 4 ml och 5 ml för varje liten, mellan och stor fartyg, respektive. Sedan försiktigt pipettera cellen lösningen droppvis ovanpå den förberedda hydrogelen i varje motsvarande platta.
- Placera plattorna i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
- Byt differentiering media var 48-72 timmar för varje platta. I fallet med den större plattan, byta media först efter 24 timmar, sedan ändra det var 48-24 timmar för att kompensera för den stora cellsåddtäthet.
- Efter 2-4 dagar som ringarna kommer att ha helt kontrakt in mot posten, tillsätt 10 mikroliter, 20 mikroliter och 35 mikroliter av TGF-β1 till varje liten, mellan och stor ring, respektive. Efter exponering för TGF-β; 1 under minst 24 timmar, ringar är redo att hanteras.
4. Montering av Vascular Konstruera och underhåll
- Innan tillverkningen av den slutliga kärl konstruktionen, är en specialiserad behållare som skapats för att hålla det färdiga fartyget.
- För litet kärl, skapa en hög skylt för ring stapling genom att skära en 2-tums avsnitt från toppen av en 50 ml polykarbonat koniska rör, och sedan PDMS limma den skurna kanten till en 35 mm platta. Använda den koniska locket när locket plattan.
- För mellan och stora fartyg lång ring stapla plattor, skär en 1,75-tums diameter polykarbonatröret i 2,5 tum sektioner på längden för att fungera som hög skylt väggarna. För de höga platt bottnar, skära en 0,125 tum tjock polykarbonatskiva i 2-tums cirkel diameter bitar. Använda akryl lim, binda polykarbonat rördelen till den cirkulära kapade biten. Använd locket från en 60 mm petriskål som locket för hög skylt.
- 3D print inlägg 5, 10 och 20 mm i diameter och 50 mm i längd.
- Tillsätt 10 ml ohärdad silikon till varje behållare. Innan den fullständiga härdningen av PDMS, centralt placera varje tjänst som skapas i steg 4.1.3 i varje liten, mellan- och stor container.
- Låt härda på en värmeplatta inställd på 60 ° C under 2-3 timmar.
- Sterilisera med en lösning av 70% etanol med 30% destillerat vatten i 30 minuter.
- Försiktigt aspirera etanol från varje behållare och låt sedan lufttorka i BSC. Därefter ordna behållarna i motorhuven med varje platta placeras bredvid locket, framsidan uppåt. Exponera behållaren för UV-ljus under BSC under ytterligare 30 minuter för ytterligare sterilisering. Använd steril teknik med varje steg efter UV-exponering.
- Använda mycket fin pincett, försiktigt bort varje tätt rullade glatt muskulatur hydrogel ring från sin post och överföra till dess motsvarande större behållare med höga stolpar.
- Använd ett parpincett i varje hand och lyfta en sida av ringen från posten, och sedan den andra. Var noga med att skydda och bevara lumen.
- Genomföra förflyttningen med denna två handed metod, glidande först en sidan och sedan den andra sidan av ringen på den långe stolpen. Med mjuka, gradvisa rörelser, och arbetar i omkrets, långsamt trycker ringen ned på den höga post. Därefter stapla vävnadsringar tills önskad fartygslängd har erhållits, med varje ring sätta ungefär 1-2 mm mellan längd och den färdiga konstruktionen.
- Med ringen stack placerade på höga 3D tryckta inlägg, vrid plattan så att tjänsten är parallellt med arbetsytan.
- Med användning av en mikropipett, tillsätt 40, 80 och 160 mikroliter av trombin vid en koncentration av 100 U / ml försiktigt till den yttre ytan av varje liten, mellan och stor kärl, respektive. Under tillsats av trombin, rotera långsamt plattan för att säkerställa en jämn täckning av alla ytor på konstruktionen.Detta kommer att vara basen för fibrin lim används för att fästa ringen stacken konstruktionen i de första dagarna efter läggningen.
- Nästa, tillsätt 40, 80 och 160 mikroliter av fibrinogen vid en koncentration av 20 mg / ml till varje liten, mellanliggande och stor konstrukt, respektive, med användning av en mikropipett under rotation av konstruktionen snabbt. Trombin och fibrinogen snabbt ställa in en fast gel en gång blandas. På grund av den korta härdningstiden, applicera fibrinogen så snabbt och jämnt som möjligt.
- Tillsätt 20 ml av differentiering media till varje behållare, som innehåller konstruktionen. Place kärlen till en 37 ° C inkubator tills det behövs. Ändra media var 3-5 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dokumenterad här är tillverkning av 3 olika tekniska kärlstorlekar transplantat (Figur 1), som visar att Ringen Stacking Method (RSM) är skalbar. För att bevisa tillämplighet, de 3 olika fartygsstorlekar valts korrelerar till verklig mänsklig fartygens storlek för den vänstra främre nedåtgående artär (liten, lumendiameter = 4 mm) 17, fallande aorta (mellan, lumendiameter = 10 mm) och stigande aorta (stora; lumen diameter = 20 mm) 18. Väggtjocklek är ca 500 pm för de små ringar och ca 1500 um för både mellanliggande och stora ringar. Varje fartyg visade byggs genom att stapla 6 ringar, vilket motsvarar en längd av ca 6 mm för små fartyg och 9 mm för de mellanliggande och stora fartyg. Längd är baserad på väggtjockleken hos varje enskild ring.
Histologisk analys avslöjadehög cellularitet i alla ringar storlekar (Figur 2). Röd material avgränsar fibrin gel. I små ringar, är en liten mängd kvarvarande fibringel ses på den yttre kanten av ringen. I de större ringarna ades viss fibringel varvas med det cellulära innehållet. I Massons Trichrome fläck, kan tecken på produktionen av kollagen (markerad med blått) ses i de mellanliggande och stora ringar.
För att bestämma cellfenotyp efter ringbildning var vävnadsringar analyseras med hjälp av immunofluorescens för antikroppar mot a-glatt muskulatur aktin (SMA) och tropomyosin (Figur 3). Alla ringstorlekar var positiva för båda antikropparna, kontrollera att den glatta muskulaturen fenotypen bibehölls.
Dragprovning utfördes på de olika stora ringar för att bestämma deras mekaniska egenskaper (Figur 4). U-stretch, ett av mekanismercal testanordning, användes för att dragprov små och mellanringar och fartyg, medan en Instron användes för att dragprovnings stora ringar och fartyg. Elasticitetsmodul (E), dragbrottgränsen (UTS) och misslyckande hållfasthet data (FS) uppsamlades. En genomgående trend observerades med ökande styrka korrelerar till ökad ring och fartygsstorlek.
Cell sådd antal som behövs för att skapa de olika storlek ringar ökade ungefär linjärt med sådd yta (Figur 5). För att skapa större ringar, var åtminstone 14 miljoner celler som behövs för att skapa bukaorta stora ringar.
Sex-ring stackar, eller kärl, testades med avseende på deras förmåga att motstå flöde. Konstrukt laddades i en specialbyggd perfusionssystem (figur 6) och utsattes för flöda under upp till 5 min vid flödeshastigheter 100-417 ml / min. fartyg varkunna motstå flöde. Mindre läckage observerades vid kärl ändarna på kontakterna till perfusion systemet.
Figur 1: Konstruktion av de skalade konstruerade fartyg. A) Diagram över processen för skalning engineered fartyg, som börjar med beredning platta, cellsådd och fartygsbyggnad. Dokumenterad finns tre olika storlek B) ringar och C) fartyg. D) representant stort kärl är helt biologiskt och liknar naturlig vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Histologisk analys. Rong> H & E och Masson trikrom fläckar visar livskraftig cellularitet hela ringtjocklek för alla ringstorlekar. Trikrom fläckar avslöja delar av produktionen av kollagen som indikeras av blå (blå pilar). Stora ringar visade fibringelen varvat, sannolikt på grund av veckning av den relativt större ytarea av cellarket. Skalstrecken: små ringar = 200 pm; mellanliggande ringar = 200 | im; och stora ringar = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunofluorescensanalys för glatta muskelceller markörer. Alla ringstorlekar var positiva för glatt muskulatur kontraktila proteiner α-glatt muskulatur aktin (SMA) och tropomyosin (TM). Skalstrecken = 200 | j, m.belastning / 55322 / 55322fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Dragprovning analys. Stress-töjningskurvor för alla storlekar av ringar och fartyg visade en allmän trend av ökad styrka korrelerar med ökad ring / fartygsstorlek. Ringar och fartyg utsträckt i omkretsriktningen. Parametrar bedömas från graferna var elasticitetsmodul, brotthållfasthet och fel styrka (listade i tabell 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cell sådd antal korrelation till sådd surfaace området. Baserat på humana glatta muskelceller från aorta. Ytarean definieras som det område i ringbildningsplattor mellan det centrala stödet och plattan vägg eller yttre skalet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Sex-ring tryckkärl som utsätts för perfusion analys. A) Specialbyggd perfusion system för flödestester. B) Engineered kärl laddas in i perfusionssystemet. Tre fartyg perfusion testas för läckage för upp till 5 minuter under flödesförhållanden. Fartygen förblev stabil under flöde, med mindre läckage vid fartygsslut kontakter anslutna till systemet slangen. Klicka här för att seen större version av denna siffra.
Animerad figur 1: Demonstration av perfusion flöde genom en konstruerad kärl. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
| Små | Mellanliggande | Stor | |||||
| Ringar | Elasticitetsmodul (kPa) | 13,6 ± 2,25 | (N = 6) | 14,5 ± 1,2 | (N = 3) | 17,2 ± 2,2 | (N = 4) |
| Brottgräns (kÅrligen) | 34,5 ± 10,2 | 39,6 ± 2,98 | 50,9 ± 10,6 | ||||
| Underlåtenhet Styrka (kPa) | 34,5 ± 10,2 | 39,6 ± 2,98 | 50,9 ± 10,6 | ||||
| Kärl | Elasticitetsmodul (kPa) | 49,7 ± 2,80 | (N = 3) | 59,8 ± 3,90 | (N = 2) | 79,8 ± 10,1 | (N = 2) |
| Brottgräns (kPa) | 115 ± 6,90 | 137 ± 12,0 | 192 ± 86,9 | ||||
| Underlåtenhet Styrka (kPa) | 96,2 ± 12,2 | 60,7 ± 12,1 | 173 ± 92,2 | ||||
Tabell 1: Dragegenskaper hos de skalade ringar och fartyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ring Stacking metoden ger flera fördelar jämfört med nuvarande vaskulära vävnadsutvecklad konstruktion tekniker. RSM kan anpassas för att skapa mänskliga fartyg oavsett storlek genom att helt enkelt anpassa post och yttre skal dimensioner. Vår metod möjliggör utveckling av polymerfria engineered fartyg som består endast av mänskliga celler och snabbt nedbrytbara bärarmaterialet som finns i kroppens naturliga sårläkningsprocessen. Polymer transplantat är kända för att orsaka restenos i kliniken och kan bli problematiskt om de ingår i tekniska transplantat. Cellsådd nummer behöver ändras för varje annan storlek vävnad ring. En graf av cellnumret till sådd ytarean visas i figur 5, från vilken sådd numret kan approximeras och / eller extrapoleras. Det bör noteras att den celltyp som används här är humana glatta muskelceller från aorta. Att anpassa RSM till olika celltyper, cellstorlek och proliferationshastighet måste tas med iövervägande och optimal såddtäthet bestämdes. Till exempel har vi också skapat mänskliga fibroblast ringar med hjälp av RSM, och har funnit att åtminstone 2x behövs antalet celler jämfört med SMC. Vilken som helst önskad längd på kärlet kan byggas genom tillägg av ringar. Ring stackar har odlats i upp till 2 månader och förblev stabil. Mellanliggande och stora ringar är båda hålls vid den lämpliga 1.500 um väggtjocklek, även om de var och en är konstruerade på ett 60 mm och 100 mm platta, respektive, genom placering av ett yttre skal i 100 mm platta. Detta visar användbarheten av det yttre skalet för att styra och att erhålla den lämpliga väggtjockleken för ett visst fartyg. I steg 3.3.1, är TGF-β1 sattes eftersom det är känt för att stimulera produktionen av kollagen 19 och har den observerade effekten av att dra åt ringarna. När väl ringarna har helt rullas, är en dos av TGF-β1 tillsättes i det sista steget, och ringarna är klara att användas en dag senare. TGF-β1 gör öka produktionen av kollagen i ringarna, vilket kan ses i de Trikrom bilderna (Figur 2).
Celler i de små ringar är mer runda och kompakta, medan de 2 större storlekar, celler längs ytterkanterna uppvisar en grad av anpassning med vävnaden kanten och tillsammans med andra i linje celler. Det senare kan indikera ett senare skede av cellmognad, utvecklats från högre cellinnehåll i de större ringarna, och därmed en högre grad av intercellulära signaleringen för att främja mognad. Fibrin gel interspersion i större ringar kan tyda på att större cellskikt tenderar att vika något när de rullar. De histologiska bilder som visar detta fenomen togs ett dagen efter fullständig ring rulle upp- därför är det förståeligt att fibringelen, som tar 2 veckor att brytas ned i kulturen, fortfarande skulle vara närvarande. Odling av ringarna under minst 2 veckor bör försämra fibrin gel, lämnar efter sig en helt cellulär konstruktion.
nt "> Alpha-glatt muskulatur aktin (SMA) utgör de tunna trådar som underlättar kontraktion och tropomyosin är en sammandragande protein. 20, 21 Både SMA och tropomyosin var närvarande i alla storleks ringar, med den starkaste, mest jämnt fördelad signal i mellan ringar. Detta fenomen kan bero på en högre grad av celltäthet och organisation, stimulera en ökning av kontraktila operandi utveckling.Elasticitetsmodul indikerar elasticitet ringarna, och den ökande E från små till stora ringar tyder en ökning av kollagen och elastin produktion. Brottgräns är den högsta styrkan uthärdat av ringarna utan att brista. Fel styrka är poängen med vävnads misslyckande. För ringarna, UTS lika FS. För fartyg, är UTS större än FS, som visar att brottgräns av kärlet tillskrivs en kombination av mekanisk bidrag från alla ringari kärlet, och misslyckandet punkten beror på den svagaste ringen.
Styrkan i våra konstruerade fartyg låg i kPa intervallet, medan nativa humana fartyg har styrkor inom MPa intervallet. För att stärka våra fartyg mot den inhemska fartyg, undersöker vi tekniker för att öka extracellulära matrixproduktion, nämligen kollagen och elastin. Tillväxtfaktorer som främjar kollagen och elastin produktion för närvarande tillämpas på våra ringar för att undersöka om hållfasthetsegenskaper kommer att öka.
Förutom mekaniska egenskaper, funktionella mått på muskelsammandragning är relevanta för fartygets prestanda. Muskelstimulering och kontraktion av faktorer såsom acetylkolin och epinefrin kan användas för att testa muskelsammandragningskrafterna. Sådana experiment är aktuella för våra framtida studier.
Sammantaget visar våra resultat att Ringen Stacking Method enkelt kan skalasför att uppnå ett intervall av konstruerade vaskulära vävnadsstorlekar. Skalning till de största mänskliga kärl, såsom 40 mm lumen aorta diameter, sannolikt skulle kräva utveckling av ett vasa vasorum, mikrovaskulaturen naturligt förekommande i stora och medelstora fartyg, som vårt labb utvecklar för närvarande. Dessutom den endoteliala cellskiktet (dvs intiman) som typiskt linjer lumen i medieskiktet är viktig för etablering av korrekt hemodynamik i ett kärl. Vårt laboratorium arbetar för närvarande på skapandet av intima i vår SMC ring stack användning av humana vaskulära endotelceller. Med dessa kombinerade tekniker skulle konstruerade fartyg har större tillämpbarhet på kliniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka våra kolleger Lam labb kollegor Ammar Chishti och Bijal Patel för deras vänliga hjälp med några av histologi och cellodling. Finansieringen kom från Wayne State University nanoFellowShip (CBP), startpeng och Cardiovascular Research Institute Seed Grant (MTL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Aortic Smooth Muscle Cells | ATCC | PCS-100-012 | vascular smooth muscle cells |
| Medium 231 | Gibco (Life Technologies | M-231-500 | media specific to vascular smooth muscle cells |
| Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PSC-100-042 | growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability |
| Replicator Mini 3D printer | MakerBot | N/A | 3D printer |
| Poly(lactic acid) 3D ink (PLA) | MakerBot | N/A | 3D printer filament |
| Poly(dimethlysiloxane) (PDMS) | Ellworth Adhesives | 3097358-1004 | polymer for gluing plate parts |
| Fibrinogen | Hyclone Labratories, Inc. | SH30256.01 | fibrin gel component |
| Thrombin | Sigma Life Sciences | F3879-5G | fibrin gel component |
| Tranforming Growth Factor-Beta 1 | PeproTech | 100-21 | growth factor for stimulating collagen production |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | for cell counting |
| Polycarbonate tubing | US Plastics | PCTUB1.750X1.625 | material for making tall, ring stacking plates |
| Polycarbonate sheet | Home Depot | 409497 | material for making tall, ring stacking plates |
| Adhesive polymer solvent | SCIGRIP | 10799 | material for making tall, ring stacking plates |
| Instron 5940 | Instron | N/A | tensile testing machine |
| U-Stretch | Cell Scale | N/A | tensile testing machine |
| Smooth Muscle Actin | MA5-11547 | Thermo Fisher | antibody |
| Tropomyosin | MA5-11783 | Thermo Fisher | antibody |
References
- Luciani, G. B., et al. Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease. ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).
- Lawson, J. H., et al. Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials. Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).
- McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).
- Wystrychowski, W., et al. First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access. J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).
- Konig, G., et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).
- Gui, L., et al. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).
- Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells. Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).
- Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. Allogeneic human tissue-engineered blood vessel. J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).
- Dahl, S. L., et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci Transl Med. 2 (68), (2011).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Meier, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery. J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).
- Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts. Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).
- Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).
- Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
- Fearon, W. F., et al. Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation. Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).
- Erbel, R., Eggebrecht, H. Aortic dimensions and the risk of dissection. Heart. 92 (1), 137-142 (2006).
- Ha, D. M., et al. Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease. J Transl Med. 14, 39 (2016).
- Skalli, O., et al. Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes. J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).
- von der Ecken, J., et al. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
